《非中斷雜交》PPT課件.ppt

1、大腸桿菌（E.coil）梯度轉(zhuǎn)移基因定位（非中斷雜交） （一）,一、目的： 熟悉細菌接合和基因定位分析的原理； 掌握大腸桿菌非中斷雜交分析的技術(shù)； 理解、區(qū)分中斷雜交和非中斷雜交分析的關(guān)鍵技術(shù)點。,二、內(nèi)容： 母液配制，培養(yǎng)基培制，器具干熱、濕熱滅菌。 活化菌種，接種，擴菌，雜交，涂平板，培養(yǎng)，點種A，點種B-G。 實驗結(jié)果觀察統(tǒng)計分析，基因位點距離計算。,二、實驗原理：,F因子： DNA小環(huán)，占染色體DNA的2% 。,Hfr菌株F-菌株： Hfr染色體從原點斷裂，染色體向F菌株起始轉(zhuǎn)移。,雜交時間： 全部染色體進入F需要100min。,如何選出各種重組子，排除供（父）、受（本）體？,選擇性標

2、記(selected marker)基因： 目的：選擇出全部的重組子，排除雜交中的受體菌。,措施：培養(yǎng)基中不加Met和Leu。,選什么樣的基因？,反選擇性標記(nonselected marker)基因： 目的：排除供體菌，同時保證全部的重組子存活。,選什么樣的基因？,措施：在培養(yǎng)基中添加鏈霉素(Str)。,Met和離Leu離原點最近,Str離原點最遠，使Hfr染色體更多機會進入受體,本實驗所配制的選擇培養(yǎng)基： A培養(yǎng)基： 排除供、受體 選擇全部重組子 BG培養(yǎng)基： 選擇各種重組子 求出重組頻率 確定基因連鎖情況,各種選擇性培養(yǎng)基,添加物質(zhì) 碳源 10A 瓊脂粉 水 MgSO4 硫胺素(鹽酸噻

3、胺，VB1) 精氨酸 腺嘌呤 色氨酸 組氨酸 鏈霉素,A B C D E F G - - 葡萄糖 - 乳糖 半乳糖 ,四、方法步驟：,重組子數(shù)目取決于接合細胞數(shù)，通常Hfr與F細胞數(shù)之比為1:1020 。 重組子的檢出：影印法，單菌落點種法 本次實驗單菌落點種法。,（一）配制各種選擇性培養(yǎng)基的基本溶液,試劑名稱 10 A 葡萄糖 乳糖 半乳糖 MgSO4.7H2O 硫胺素 精氨酸 色氨酸 組氨酸 腺嘌呤,溶液規(guī)格 (119頁） 20% 20% 20% 0.25M 1mg/1ml 10mg/ml 10mg/ml 10mg/ml 10mg/ml,配制量 500ml 200ml 25ml 25ml

4、25ml 25ml 25ml 25ml 25ml 25ml,注：1)色氨酸(Trp)需在50-60水浴條件下溶解。 2)腺嘌呤（Ade）不溶于水，需先用1N（不要過濃過?。〩Cl調(diào)成糊，逐滴加1NHCl直到溶，再補水定容。 3)鏈霉素(Str)受熱易分解，所以不能加入培養(yǎng)基中一起滅菌，而應在倒平板前，用無菌水現(xiàn)配現(xiàn)用。,（二）配制LB液體培養(yǎng)基:(周四上午組再多配300mL) 200ml ，分裝：3瓶/組，5ml / 瓶， 其余交給老師 （三）每組包裝滅菌： 培養(yǎng)皿20個 接合用的空三角瓶（100ml）1個 牙簽200支（20支左右一包） (四)Tip頭準備 為下次實驗準備藍、黃tip頭各1盒,用50ml小三角瓶分裝,更正：教材p118“LB液”配制中，蒸餾水應為mL,配制方法： 1. 稱取瓊脂 2. 另取其它各成分于一小椎型瓶中，將瓊脂其中混勻。 3. 滅菌：A到G培養(yǎng)基115滅菌20min，其它培養(yǎng)基和耗材121 滅菌15min 。 請大家滅菌時注意把相同滅菌條件的物品放在相同的滅菌框中。,各小組滅菌后需收齊的物品： A培養(yǎng)基 250 mL （分裝2個250ml三角瓶） B-G培養(yǎng)基 各30mL （裝于6個100mL三角瓶） LB培養(yǎng)基 15mL （分裝3個50m