《酶引論教學(xué)用》PPT課件.ppt

1、第9章，酶的介紹，1。酶研究簡(jiǎn)史(自學(xué))2。酶是生物催化劑3。酶的化學(xué)本質(zhì)4。酶5的命名和分類。酶特異性6。酶活性的測(cè)定。非蛋白生物催化劑核酶8。酶分子工程，教學(xué)內(nèi)容2。酶是生物催化劑。反應(yīng)速率理論和活化能(自學(xué))2降低反應(yīng)活化能；反應(yīng)前后的平衡常數(shù)或吉布斯自由能不變。酶與非生物催化劑的一些共性：(2)酶通過(guò)降低活化自由能來(lái)提高反應(yīng)速率。酶如何克服能量障礙并降低活化能？酶還原反應(yīng)的激活自由能可以從熵和焓來(lái)考慮：根據(jù)鄰近效應(yīng)和取向效應(yīng)鄰近：在雙分子酶促反應(yīng)中，兩個(gè)底物分子結(jié)合在酶分子表面，使它們相互靠近；方向：兩個(gè)底物反應(yīng)基團(tuán)之間以及底物反應(yīng)基團(tuán)和酶催化基團(tuán)之間的正確方向。鄰近效應(yīng)和取向效應(yīng)相當(dāng)

2、于增加了局部襯底濃度和有效碰撞概率。就熵因子而言，它是33，360。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)兩個(gè)底物分子形成活化復(fù)合物時(shí)，它們需要經(jīng)歷平移自由度和旋轉(zhuǎn)自由度的損失，導(dǎo)致熵的急劇降低和S的負(fù)值，這意味著將會(huì)有大的活化自由能(G)，這顯然不利于反應(yīng)。然而，在酶促反應(yīng)中，當(dāng)ES中間體復(fù)合物在進(jìn)入過(guò)渡態(tài)(ex)之前形成時(shí)，自由度損失發(fā)生，并且當(dāng)酶和底物非共價(jià)結(jié)合時(shí)釋放的自由能(稱為結(jié)合能，Gb)補(bǔ)償了由自由度損失引起的熵減少，因此當(dāng)進(jìn)入過(guò)渡態(tài)時(shí)，S的絕對(duì)值降低，因此G與非催化反應(yīng)相比降低。熵因子是：對(duì)于大多數(shù)反應(yīng)，當(dāng)襯底進(jìn)入過(guò)渡狀態(tài)時(shí)，它將變形，并且反應(yīng)鍵將被拉伸和扭曲，這將處于電子應(yīng)變或電子張力狀態(tài)。襯底變形需

3、要向反應(yīng)系統(tǒng)提供能量(h)。然而，在酶促反應(yīng)中底物變形所需的能量也是由形成氟和硫之間的弱相互作用時(shí)釋放的結(jié)合自由能(內(nèi)能)提供的，因此減少了進(jìn)入過(guò)渡態(tài)所需的氫。當(dāng)?shù)孜锱c酶結(jié)合時(shí)，酶分子通常發(fā)生變形或構(gòu)象變化，以滿足底物進(jìn)入過(guò)渡狀態(tài)的需要，這被稱為誘導(dǎo)結(jié)合。誘導(dǎo)偶聯(lián)將酶分子上的催化基團(tuán)帶到合適的位置，包括向底物提供廣泛的酸堿催化和共價(jià)催化基團(tuán)以削弱反應(yīng)鍵，這也是降低焓因子的一種方法。酶研究簡(jiǎn)史(自學(xué))2。酶是生物催化劑3。酶的化學(xué)本質(zhì)4。酶5的命名和分類。酶特異性6。酶活性的測(cè)定。非蛋白生物催化劑核酶8。酶分子工程，教學(xué)內(nèi)容3。酶的化學(xué)本質(zhì)，除了具有催化能力的核糖核酸。酶的經(jīng)典概念：酶是一種具有

4、催化功能的蛋白質(zhì)，因此酶具有蛋白質(zhì)的所有共性。(1)酶的化學(xué)組成(2)酶的四級(jí)結(jié)合，分為簡(jiǎn)單蛋白和結(jié)合蛋白；有些酶只由蛋白質(zhì)組成，如脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等。有些酶不僅含有蛋白質(zhì)(酶蛋白)，還含有非蛋白質(zhì)成分(輔因子)，以及酶蛋白輔因子復(fù)合物，使全酶顯示出酶活性，如超氧化物歧化酶(Cu2，Zn2)和乳酸脫氫酶(NAD)。(1)酶的化學(xué)組成，酶的輔因子主要包括：金屬離子和有機(jī)化合物。輔助因子分為兩類：輔酶(與酶蛋白松散結(jié)合，可通過(guò)透析去除)和輔助基團(tuán)(與酶蛋白緊密結(jié)合)。酶蛋白決定酶的特異性，而輔助因素決定酶反應(yīng)的類型和性質(zhì)。例如，NAD可以與各種酶蛋白結(jié)合形成具有強(qiáng)特異性的乳

5、酸脫氫酶、乙醇脫氫酶、蘋果酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶。酶的種類很多，但輔因子的種類很少，因?yàn)橐粋€(gè)輔因子可以與多種酶蛋白結(jié)合。單體酶：由一個(gè)或多個(gè)共價(jià)連接的肽鏈組成的酶分子，催化水解反應(yīng)。例如，牛胰腺RNase(單鏈)、雞蛋清溶菌酶(單鏈)、糜蛋白酶(三肽鏈)寡聚化酶：一種由兩個(gè)或多個(gè)亞基組成的酶，亞基可以相同或不同，一般是均勻的，亞基與3360個(gè)相同的亞基非共價(jià)鍵合，如蘋果脫氫酶(小鼠肝臟)和兩個(gè)相同的亞基；不同的亞基，如琥珀酸脫氫酶(牛心)，兩種亞基寡聚化酶中的亞基聚合與酶的特異性、酶活性中心的形成和調(diào)節(jié)性能有關(guān)。(2)酶的四階段結(jié)合，多酶復(fù)合物：兩種或多種酶通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合，催化一系列連續(xù)反

6、應(yīng)，構(gòu)成代謝途徑或代謝途徑的一部分。如脂肪酸合成酶復(fù)合物和丙酮酸脫氫酶復(fù)合物；多酶融合：多肽鏈包含兩種或兩種以上具有催化活性的酶，通常是基因融合的產(chǎn)物。例如，天冬氨酸激酶1高絲氨酸脫氫酶1融合物(雙頭酶)是一個(gè)四聚體4，每個(gè)肽鏈包含兩個(gè)活性區(qū)域：在氮末端的天冬氨酸激酶和在碳末端的高絲氨酸脫氫酶。(2)酶的四級(jí)關(guān)聯(lián)，(1)酶的命名，(2)酶的分類和編號(hào)，(4)酶的命名和分類，(1)根據(jù)底物如蛋白酶和淀粉酶來(lái)命名酶。根據(jù)催化反應(yīng)的性質(zhì)命名，例如，水解酶和轉(zhuǎn)氨酶是根據(jù)上述兩個(gè)原理命名的，琥珀酸脫氫酶。有時(shí)，添加酶的來(lái)源，如胃蛋白酶和牛糜蛋白酶，來(lái)命名與作用底物結(jié)合的酶的來(lái)源。例如，酶作用的底物是淀粉

7、和蛋白質(zhì)，當(dāng)它們來(lái)自細(xì)菌時(shí)，被稱為細(xì)菌淀粉酶和細(xì)菌蛋白酶。1961年以前使用的酶是根據(jù)慣用的命名系統(tǒng)命名的。習(xí)慣性命名，將酶作用的最佳酸堿度與底物結(jié)合起來(lái)。例如，底物是蛋白質(zhì)，最適的酸堿度是中性的，這就是所謂的中性蛋白酶；最佳的酸堿度是堿性的，這被稱為堿性蛋白酶。催化水解的酶。通常，反應(yīng)類型從酶的名稱中省略。例如，水解蛋白質(zhì)的酶叫蛋白酶，水解淀粉的酶叫淀粉酶。此外，還有酯酶、脲酶、酰胺酶等。有時(shí)，為了工廠區(qū)分同一種酶，還可以在酶的名稱前標(biāo)明來(lái)源。如胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶。酶的習(xí)慣名稱使用方便，但也容易混淆。例如，-淀粉酶，也稱為液化淀粉酶或糊精淀粉酶或淀粉-1，4-糊精酶，經(jīng)常出現(xiàn)。系

8、統(tǒng)的名稱應(yīng)清楚地表明酶的底物和催化反應(yīng)的性質(zhì)。如草酸氧化酶(俗稱)，系統(tǒng)名稱：草酸：氧氧化酶。另一個(gè)例子是丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(習(xí)慣名稱)，系統(tǒng)名稱：丙氨酸：-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶。如果其中一種基質(zhì)是水，則水被省略。2.國(guó)際系統(tǒng)命名，(2)酶的分類和數(shù)量(酶代碼)，原理：根據(jù)它們的性質(zhì)，它們被分為六類，分別用1、2、3、4、5和6表示；然后，根據(jù)底物中作用基團(tuán)或鍵的特征，將每一類分為若干子類，編號(hào)為1、2和3，每一子類又可分為若干子類，由編號(hào)1、2和3表示；每種酶的數(shù)量由4個(gè)數(shù)字組成，用隔開。第一個(gè)數(shù)字代表主要類別，第二個(gè)數(shù)字代表子類別，第三個(gè)數(shù)字代表子類別，第四個(gè)數(shù)字代表子類別中的數(shù)字。第一個(gè)數(shù)字

9、代表主要類別：氧化還原；第二個(gè)數(shù)字表示反應(yīng)基團(tuán)：醇基團(tuán)；第三個(gè)數(shù)字表示電子受體：NAD或NADP第四個(gè)數(shù)字表示這種酶的底物：乙醇、乳酸和蘋果酸。前三個(gè)數(shù)字表示這種酶的特征：反應(yīng)特性、底物特性(鍵的類型)和電子或基團(tuán)的受體，第四個(gè)數(shù)字用于區(qū)分不同的底物。國(guó)際系統(tǒng)分類和編號(hào)的例子，乙醇脫氫酶：EC1.1.1.1，乳酸脫氫酶：EC1.1.1.27，蘋果酸脫氫酶：EC1.1.1.37，1。酶研究簡(jiǎn)史(自學(xué))2。酶是生物催化劑。酶的化學(xué)性質(zhì)。酶的命名和分類。酶促5。酶特異性，(1)酶對(duì)底物的特異性，(2)酶特異性假說(shuō)，包括光學(xué)異構(gòu)，幾何異構(gòu)，絕對(duì)，相對(duì)，結(jié)構(gòu)特異性，立體異構(gòu)特異性，酶特異性和特異性可分為

10、兩種類型：(1)酶對(duì)底物的特異性、結(jié)構(gòu)特異性：絕對(duì)特異性和相對(duì)特異性例如，淀粉酶只能催化淀粉的水解，但不能催化淀粉以外的任何物質(zhì)的水解。脲酶、琥珀酸脫氫酶、脫氧核糖核酸聚合酶、碳酸酐酶、麥芽糖酶等。是相對(duì)特定的：它們催化具有相同化學(xué)鍵或基團(tuán)的底物進(jìn)行某些類型的反應(yīng)。鍵兩端的基團(tuán)需要的是“家族特異性或基團(tuán)特異性”，例如-葡萄糖苷酶，它需要糖苷鍵和-葡萄糖；化學(xué)結(jié)構(gòu)的唯一要求是“鍵特異性”。例如，脂肪酶催化脂鍵水解，但對(duì)底物中的R and R基團(tuán)沒(méi)有嚴(yán)格要求。此外，各種蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶、二肽酶等。立體異構(gòu)特異性：光學(xué)異構(gòu)特異性和幾何異構(gòu)特異性，其中酶只能作用于一種異構(gòu)體(D-或L-構(gòu)型)，這

11、是相當(dāng)普遍的現(xiàn)象。如：谷氨酸脫氫酶為左旋谷氨酸，左旋氨基酸氧化酶，蛋白水解酶通常為左旋氨基酸肽；乳酸脫氫酶只催化乳酸，但對(duì)乳酸沒(méi)有影響。幾何異構(gòu)特異性：反式-，順式-。富馬酸水合酶只能被反式水合。手性原始對(duì)稱碳原子：四個(gè)相連基團(tuán)中只有兩個(gè)相同的對(duì)稱碳原子。光學(xué)異構(gòu)體特異性：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸C4(手性碳)有兩個(gè)氫原子，一個(gè)是R- pro (HR)另一個(gè)是S- pro (HS)，而R- pro(或S- pro)氫原子意味著如果它的優(yōu)先性增加，例如，D(.該酶可以區(qū)分兩個(gè)相同的手性碳原子組(或原子):煙酰胺C4(手性碳)的兩個(gè)氫原子，例如：輔酶(NAD)或輔酶(NADP)，煙酰胺C4發(fā)生脫氫或氫

12、化。一類脫氫酶，如乙醇脫氫酶和蘋果酸脫氫酶，專門作用于R-原-氫原子，被稱為A型脫氫酶。另一種只對(duì)硫原子起作用，如谷氨酸脫氫酶和甘油-3-磷酸脫氫酶，被稱為B型脫氫酶。酶可以區(qū)分兩個(gè)相同的手性碳原子組(或原子):(2)酶特異性假說(shuō)，“鎖定-關(guān)鍵”模型(剛性模板理論):三點(diǎn)組合理論：底物分子和酶活性中心組必須在三點(diǎn)互補(bǔ)和匹配，酶才能作用于該底物。誘導(dǎo)楔入模型：當(dāng)酶分子靠近底物分子時(shí)，酶蛋白被底物分子誘導(dǎo)，構(gòu)象發(fā)生改變，有利于與底物結(jié)合。在此基礎(chǔ)上，酶和底物互補(bǔ)楔入并反應(yīng)。首先，酶研究的簡(jiǎn)史(自學(xué))。第二，酶是生物催化劑。第三，酶的化學(xué)本質(zhì)。第四，酶的命名和分類。第五，酶的特異性。第六，酶活性的測(cè)

13、定。第八，非蛋白生物催化劑核酶。六.酶活性的測(cè)定：(1)酶活性、活性單位和比活性；(2)反應(yīng)速率、初始速率和酶活性的測(cè)定；(1)酶活性、活性單位和比活性、酶活性或酶活性：催化某種化學(xué)反應(yīng)的能力。代表酶的量。酶活性單位：測(cè)量酶活性的單位。傳統(tǒng)酶單位：在一定條件下和一定時(shí)間內(nèi)將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量(常規(guī)單位)。酶濃度可以用單位體積的酶單位數(shù)來(lái)表示，如單位/毫升、單位/升等。1961年，國(guó)際單位(IU)被用作酶活性單位：酶的國(guó)際單位，通常稱為酶單位，是在特定條件下(溫度一般為25，其他條件為最佳條件)每分鐘催化1摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量。1972年，酶活性單位Katal(縮寫Kat)被引

14、入。1 Katal定義為在最佳條件下每秒催化形成lmol產(chǎn)物所需的酶量(mols)。1吉=6107國(guó)際單位.習(xí)慣單位不是統(tǒng)一的，但它們實(shí)際上有自己的便利。酶的比活性或比活性定義為每毫克蛋白質(zhì)的酶活性單位數(shù)(單位/毫克)。比活性代表酶的純度。(2)反應(yīng)速率、初始速率和酶活性的測(cè)定。在定容體系中，反應(yīng)速率可以用單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)物濃度或產(chǎn)物濃度的變化速率來(lái)表示。對(duì)于簡(jiǎn)單的非催化反應(yīng)?；瘜W(xué)反應(yīng)速率及其測(cè)定、酶活性測(cè)定方法：分光光度法和熒光法是最簡(jiǎn)單、最靈敏、便于自動(dòng)化、且不干擾反應(yīng)連續(xù)測(cè)量的方法。其他方法，如同位素測(cè)定和電化學(xué)方法，必須在反應(yīng)系統(tǒng)中取樣，反應(yīng)才能終止。如果在反應(yīng)開始時(shí)溶液中只存在，其初始

15、濃度稱為A0，那么原點(diǎn)的切線斜率(或A0)就是初始速率或初始速度，即：2.初始反應(yīng)速率的概念是，底物不過(guò)量，其濃度將顯著降低，并且在反應(yīng)過(guò)程中速率將持續(xù)降低；該反應(yīng)具有明顯的可逆性，逆反應(yīng)速率將隨著產(chǎn)物濃度的增加而增加，底物轉(zhuǎn)化率的凈速率將降低；酶的穩(wěn)定性差，產(chǎn)品會(huì)抑制酶的活性，酶的活性會(huì)降低，酶反應(yīng)的速率也會(huì)減慢。反應(yīng)速率隨時(shí)間變慢的可能原因是：為了準(zhǔn)確反應(yīng)酶活性，最好測(cè)量酶反應(yīng)的初始速率v0。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間盡可能短(一般不超過(guò)5分鐘)并且底物濃度的變化不超過(guò)初始濃度的5%時(shí)，產(chǎn)物產(chǎn)率幾乎與時(shí)間成正比。過(guò)程曲線的最早段是一條直線，因此通常不需要通過(guò)原點(diǎn)的切線找到初始速率。3.酶活性的測(cè)定，反應(yīng)條

16、件如溫度和酸堿度必須保持恒定并加以解釋；s和e輔因子應(yīng)該過(guò)量，s應(yīng)該至少是酶的KM的5倍。初始速率v0是對(duì)S的零級(jí)反應(yīng)，v0與S無(wú)關(guān)，v0是對(duì)e的一級(jí)反應(yīng)。此時(shí)，每個(gè)酶分子都被S完全飽和，酶的催化能力得以充分發(fā)揮，酶濃度成為化學(xué)反應(yīng)速率的唯一限制因素。當(dāng)測(cè)量酶活性時(shí)，通常需要繪制兩條曲線(:)來(lái)確定酶反應(yīng)時(shí)間(線性范圍)以找到初始速率；酶濃度曲線，即v0作為e函數(shù)的曲線，被確定為線性關(guān)系e范圍；待測(cè)樣品e應(yīng)在此范圍內(nèi)。必須同時(shí)制作質(zhì)控品或空白品。對(duì)照試驗(yàn)與樣品試驗(yàn)相同，除了在反應(yīng)前酶通過(guò)煮沸或其他方法變性和失活。雖然酶的活性是由酶催化的化學(xué)反應(yīng)速率決定的，但它不是由反應(yīng)速率直接表示的。酶活性單位的維數(shù)是兩個(gè)物理量，即物質(zhì)質(zhì)量/時(shí)間；反應(yīng)速率單位的維數(shù)是三個(gè)物理量，即物質(zhì)的質(zhì)量/(體積時(shí)間)。酶濃度單位的維數(shù)與反應(yīng)速率單位的維數(shù)相同，因此反應(yīng)速率直接代表酶濃度。在酶活性測(cè)定中需要解釋的一些問(wèn)題，(1)核酶的發(fā)現(xiàn)，(2) L19RNA是核酶，(RNaseP的RNA成分是核酶，(7)非蛋白生物催化劑核酶，1981，Cech T等發(fā)現(xiàn)原生動(dòng)物嗜熱四膜蟲的rrna前體通過(guò)自身剪接切斷插入序列或內(nèi)