第一講-藥理實(shí)驗方法學(xué)概述.ppt

1、藥理實(shí)驗方法學(xué),主講 戴夢紅,簡介,藥理學(xué)是一門實(shí)驗性學(xué)科，其理論、學(xué)說、設(shè)想和結(jié)論都取決于實(shí)驗結(jié)果，沒有實(shí)驗數(shù)據(jù)，就沒有藥理學(xué)的知識和內(nèi)容； 沒有先進(jìn)的、科學(xué)的實(shí)驗方法，就沒有可靠的實(shí)驗數(shù)據(jù)，就沒有藥理學(xué)； 藥理實(shí)驗方法是促進(jìn)藥理學(xué)迅速發(fā)展的前提。,理論教學(xué)內(nèi)容（16學(xué)時）,藥理實(shí)驗方法概述 與藥理學(xué)有關(guān)的實(shí)驗動物的選擇和利用 分子生物學(xué)方法和體外試驗在藥理學(xué)中的應(yīng)用 毒理試驗方法,實(shí)驗教學(xué)內(nèi)容（32學(xué)時）,量效關(guān)系曲線測定（ED50和LD50測定） 動物體內(nèi)磺胺藥濃度測定 藥物血漿蛋白結(jié)合率測定 大鼠肝S9制備 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗 小鼠精原細(xì)胞染色體畸變分析 大鼠肝微粒體制備及其酶活性測

2、定 小鼠碳廓清試驗,第一講 藥理實(shí)驗方法學(xué)概述,一、實(shí)驗藥理學(xué)與藥理學(xué)實(shí)驗,實(shí)驗藥理學(xué)（experimental pharmaco-logy）是藥理學(xué)的重要組成部分，在藥理學(xué)的發(fā)展過程中占有極為重要的地位。 是以實(shí)驗研究為目的研究藥物作用及其作用機(jī)制的學(xué)科，是藥理學(xué)方向的一門應(yīng)用性專業(yè)課。其任務(wù)是培養(yǎng)學(xué)生掌握和熟悉實(shí)驗常用儀器的正確使用、實(shí)驗標(biāo)本的制備、條件的控制和指標(biāo)的選擇、實(shí)驗結(jié)果的分析、處理等基本技能。,藥理學(xué)：一門實(shí)驗科學(xué)，其發(fā)展和進(jìn)步都離不開實(shí)驗獲得的結(jié)果；而藥理學(xué)理論的形成也離不開實(shí)驗的驗證。 藥理學(xué)實(shí)驗：以實(shí)驗為基礎(chǔ)，按一定的方案，用相關(guān)的實(shí)驗方法或模型試驗，得到實(shí)驗結(jié)果，以說明

3、某一藥物的作用特點(diǎn)或作用規(guī)律。,目的,藥理學(xué)實(shí)驗：具體的實(shí)踐過程，通過藥理學(xué)實(shí)驗，實(shí)現(xiàn)實(shí)驗藥理學(xué)的研究目的，獲得藥理學(xué)的新知識，促進(jìn)藥理學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展 實(shí)驗藥理學(xué)：通過探討藥理學(xué)實(shí)驗的特點(diǎn)和規(guī)律，使藥理學(xué)實(shí)驗符合科學(xué)、規(guī)范、準(zhǔn)確的要求，有效地解決藥理學(xué)研究中的實(shí)際問題，為藥理學(xué)研究提供合理方法和技術(shù)保障,內(nèi)容,藥理學(xué)實(shí)驗: 解決具體技術(shù)問題，是具體的某種實(shí)驗方法 實(shí)驗藥理學(xué): 研究藥理學(xué)實(shí)驗過程中的共性問題，提供藥理學(xué)實(shí)驗研究的基本知識,用途 藥物（尤其是新藥）評價，如作用強(qiáng)度、量-效關(guān)系、時-效關(guān)系、毒副作用、作用機(jī)理等。 包括 主要藥效研究和一般藥理研究,主要藥效研究,原則 用體內(nèi)、體外兩

4、種以上實(shí)驗方法獲得證明，其中一種必須是整體的正常動物或動物病理模型；各項實(shí)驗均應(yīng)有空白對照和已知藥物對照；實(shí)驗結(jié)果需經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理。 應(yīng)有兩種以上劑量及不同的給藥方法，溶于水的藥物應(yīng)做靜脈注射。,一般藥理研究,應(yīng)用產(chǎn)生主要藥效作用的劑量與給藥途 徑，對清醒動物或麻醉動物進(jìn)行一般藥理研究 主要研究內(nèi)容（核心組合實(shí)驗） 中樞神經(jīng)系統(tǒng)：觀察活動情況和行為變化 心血管系統(tǒng)：心率、心電圖、血壓 呼吸系統(tǒng)：對呼吸頻率和深度的影響,二、藥理學(xué)實(shí)驗的常用方法,物理學(xué)方法 化學(xué)方法 數(shù)學(xué)方法 實(shí)驗動物學(xué)方法 細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)方法,三、藥理實(shí)驗設(shè)計的基本原則,重復(fù)（replicaton

5、) 隨機(jī)（randonmization) 對照（control) 三項統(tǒng)計學(xué)原則由實(shí)驗設(shè)計奠基者Fisher提出至今，基本精神未變，但內(nèi)容有發(fā)展,（一）重復(fù),重復(fù)是實(shí)驗設(shè)計的首要原則 精確可靠的實(shí)驗結(jié)果應(yīng)在相同條件下重復(fù)出來 能夠充分重現(xiàn)的實(shí)驗，才能稱為可靠的實(shí)驗 要有足夠的重復(fù)數(shù)（實(shí)驗次數(shù)或?qū)嶒灷龜?shù)），才有可能做出正確的結(jié)論。,重復(fù)原則的含義,重復(fù)穩(wěn)定性，或稱重現(xiàn)性 重復(fù)數(shù),減少干擾因素對實(shí)驗的影響,動物方面 品種、年齡、性別、飼養(yǎng)（條件）等 儀器方面 靈敏度、精確度、操作熟練程度等 藥物方面 批次、純度、劑量、注射速度等 環(huán)境方面 溫度、濕度、氣壓等氣候因素,重復(fù)數(shù)與重現(xiàn)性的辯證關(guān)系,只有

6、足夠的重復(fù)數(shù)才能取得較高的重現(xiàn)性； 為達(dá)到某一重現(xiàn)性，必須有相應(yīng)的適當(dāng)?shù)闹貜?fù)數(shù)。,重復(fù)數(shù)的數(shù)量與質(zhì)量的辯證關(guān)系,數(shù)量是保證重現(xiàn)性的基礎(chǔ) 質(zhì)量是保證實(shí)驗?zāi)軌蛑貜?fù)的重要條件 應(yīng)盡量采用精密準(zhǔn)確的實(shí)驗技術(shù)，減少實(shí)驗誤差，保證重復(fù)實(shí)驗在相同條件下進(jìn)行。,相同條件,同時 同地 實(shí)驗條件 同條件 同種（相同種屬品系的動物） 同批（同一廠家生產(chǎn)的同批號樣品） 材料條件 同病情（病理模型）,實(shí)驗條件嚴(yán)密性與代表性的辯證關(guān)系,實(shí)驗條件控制越嚴(yán)密，個體差異越小，越有利于獲得準(zhǔn)確的結(jié)論； 條件控制的過于嚴(yán)密，實(shí)驗結(jié)果的代表性就差，所得結(jié)論的適用范圍和重現(xiàn)范圍會受到限制。 在重復(fù)原則中，存在典型性和代表性或普遍性的關(guān)

7、系。,（二）隨機(jī),實(shí)際意義 使每個實(shí)驗對象在接受處理時，有相等的機(jī)會，以減少主觀因素的影響，減少或避免偏性誤差，不隨機(jī)即有系統(tǒng)誤差，顯著性檢驗就無意義。 隨機(jī)不是隨便 隨機(jī)必須按隨機(jī)原則采用隨機(jī)數(shù)字表，以保證實(shí)驗對象分組的機(jī)會相等，隨便分組不可能達(dá)到每個實(shí)驗對象機(jī)會均等。,絕對隨機(jī)與均衡隨機(jī),絕對隨機(jī) 又稱完全隨機(jī)，用于例數(shù)較多時優(yōu)越性較大; 均衡隨機(jī) 先將能控制的主要因素均衡分檔，再在每一檔中隨機(jī)取出等量動物分配到各組，使較難控制的因素得到隨機(jī)安排。,（三）對照,對照是比較的基礎(chǔ)，沒有對照就沒有比較和 鑒別，就談不上定量研究 自身對照 減少個體差異 組間對照 藥理實(shí)驗中最為常用 其他對照 正

8、常值對照 文獻(xiàn)值對照,組間對照,空白對照 不給藥，不作任何處理 實(shí)驗對照 不給藥，處理同實(shí)驗組 陽性對照 給予同類藥物或已知標(biāo)準(zhǔn)品 模型對照,陰性對照,不含研究中處理因素的對照組 空白對照 不給任何處理的對照 假處理對照 經(jīng)同樣的麻醉、注射，但不進(jìn)行關(guān)鍵處理 安慰劑 避免心理狀態(tài)對藥效的影響,陽性對照,藥物對照 用已肯定療效的藥物作對照，應(yīng)為陽性結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)品對照 用標(biāo)準(zhǔn)藥物或典型藥物作為對照，目的是提供對比標(biāo)準(zhǔn)，以評定藥物效價 弱陽性對照 用常規(guī)療法或老藥、老療法、老方案對照,四、實(shí)驗程序,1. 實(shí)驗動物的選擇 種屬差異 品系差異 性別差異 2. 給藥方法 3. 實(shí)驗水平（機(jī)體水平） 粗分：整

9、體、離體；細(xì)分：分子、（亞）細(xì)胞、組織、器官、整體動物等。 4. 正常動物和模型動物實(shí)驗 5. 預(yù)防實(shí)驗和治療實(shí)驗 6. 比較試驗,五、藥效評價標(biāo)準(zhǔn),1. 藥效評價的定量方法 量-效關(guān)系分析 為基本分析 量反應(yīng)的量-效關(guān)系 劑量與效應(yīng) 質(zhì)反應(yīng)的量-效關(guān)系 劑量與藥效反應(yīng)率 時反應(yīng)的量-效關(guān)系 劑量與潛伏期或持續(xù)期 時-效關(guān)系分析 藥效經(jīng)時變化的動態(tài)規(guī)律 構(gòu)-效關(guān)系分析 結(jié)構(gòu)與藥效 藥-靶關(guān)系分析 與酶、受體、蛋白質(zhì)、載體、膜通道等的關(guān)系,2. 藥物作用強(qiáng)度與量-效關(guān)系 3. 藥物作用持續(xù)時間與時效關(guān)系 藥物作用時間包括起效時間和持續(xù)時間。 比較藥物作用強(qiáng)度 用達(dá)到最大作用時的作用強(qiáng)度為指標(biāo)；

10、比較作用出現(xiàn)時間 用達(dá)到最大作用的時間為指標(biāo)； 比較作用持續(xù)時間 用消除速率或?qū)嶋H作用延續(xù)時間為指標(biāo)； 用作用-時間曲線下面積作為綜合評價指標(biāo)，既考慮到作用最大值，又考慮到作用持續(xù)時間。,六、實(shí)驗樣本數(shù),影響實(shí)驗樣本數(shù)的因素 藥物效果：藥效強(qiáng)，例數(shù)可相應(yīng)減少 生物差異：個體差異小，標(biāo)準(zhǔn)差小，可少 實(shí)驗技術(shù)：實(shí)驗手段、儀器和設(shè)備嚴(yán)格精密，可少 統(tǒng)計處理：可提高實(shí)驗效率 兩組例數(shù)相等時，總例數(shù)可適當(dāng)減少 計量比計數(shù)資料實(shí)驗效率高 同體實(shí)驗比分組實(shí)驗實(shí)驗效率高 特殊的實(shí)驗設(shè)計實(shí)驗效率高： 拉丁方、正交、交叉等，效率高，信息多，優(yōu)先采用,藥理實(shí)驗的基本例數(shù) 按統(tǒng)計學(xué)規(guī)定的P0.05及P0.01和藥理專

11、業(yè)上的實(shí)際例數(shù)習(xí)慣性規(guī)定，確定基本例數(shù)。 小動物 1030例 （計量10，計數(shù)30） 中等動物 820例 大動物 515例,七、實(shí)驗劑量的確定,安全劑量的探索 由該藥與已知藥物的效價比值推算 由劑量折算系數(shù)法計算,七、實(shí)驗劑量的確定,劑量遞增方案： 應(yīng)用開始試用量（ds）后，如未出現(xiàn)療效，也未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)，則按下述方案遞增：對于動物實(shí)驗，按ds、2ds、3.3ds遞增，24次可達(dá)到預(yù)期量，以后均按增長率3033遞增。,多劑量實(shí)驗中劑量間距的確定,整體動物實(shí)驗 1:3:9 或 1:2:4:8（3或2倍遞增），太小，相鄰組藥效倒置；太大，藥效易處于S形曲線平坦處，不利于對比分析 離體器官實(shí)驗

12、1 : 10:100 :1000（10倍遞增） 計算 LD50或ED50的實(shí)驗 要求0及100之間有36個劑量組，量反應(yīng)資料取1：0.11：0.5的組間比值，質(zhì)反應(yīng)資料取1：0.61：0.85的組間比值,按體表面積計算 A=K(W2/3/10000) A：體表面積（m2） W：體重(g) K：體表面積系數(shù),人與動物及各類動物間藥物劑量的換算,如：某藥大鼠劑量為250mg/kg，問犬的給藥劑量？ （假設(shè)一般實(shí)驗大鼠0.2 kg，實(shí)驗犬10 kg） 算大鼠體表面積：A=0.031 m2 將mg/kg 劑量換算為mg/ m2劑量： （250mg/kg 0.2 kg）/ 0.031 m2=1608 m

13、g/ m2 算犬體表面積： A=0.5198m2 算犬給藥劑量： 1608 mg/ m2 0.5198m2 /10 kg =84 mg/kg,按體型系數(shù)換算 dA=dBRA/RB（wA/wB）1/3 dA和dB分別是A、B兩種動物的每kg體重劑量（mg/kg) RA和RB分別是A、B兩種動物的體型系數(shù) wA和wB分別是A、B兩種動物的體重,八、實(shí)驗的穩(wěn)定性和靈敏度 及其實(shí)驗誤差的控制,實(shí)驗的穩(wěn)定性,影響因素 樣本的代表性 如年齡與體重 分組上的差異 體重、年齡、健康狀況等不同，分組不均勻，反應(yīng)性差別明顯 實(shí)驗條件 時間、溫度、操作誤差等 實(shí)驗順序 給藥順序、交叉順序,表示方法,用變異系數(shù)（CV

14、） 或 相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）表示。 CV越小，實(shí)驗波動越小，穩(wěn)定性越好。 CV0.05 穩(wěn)定性好 CV0.3 波動較大，應(yīng)改進(jìn)實(shí)驗方法或更換測量指標(biāo)。,提高穩(wěn)定性的基本原則,從實(shí)踐和理論上認(rèn)識受試藥物對所用實(shí)驗動物的生物反應(yīng)差異性的規(guī)律： 實(shí)驗的專屬性 即反應(yīng)指標(biāo)在多大程度上體現(xiàn)藥物的作用強(qiáng)度 研究劑量-效應(yīng)關(guān)系，應(yīng)該選擇劑量與效應(yīng)的直線范圍寬、劑量增減一定程度后效應(yīng)增減幅度較明顯、相同劑量各次反應(yīng)之間差異較小的實(shí)驗方法、模型和指標(biāo)；,調(diào)整樣本數(shù) 生物差異大的實(shí)驗，用較多的動物，以提高實(shí)驗的準(zhǔn)確性； 加強(qiáng)實(shí)驗條件的控制 動物條件：年齡、體重、性別和窩別一致 實(shí)驗設(shè)計方法：合適，以減少實(shí)驗誤差,

15、實(shí)驗方法的反應(yīng)類型 量反應(yīng)或直接測定最小數(shù)量，信息量大 質(zhì)反應(yīng) 信息量小 統(tǒng)計方法的應(yīng)用 刪除、舍棄由于不正常操作或某些難以預(yù)測的因素的影響 重復(fù)實(shí)驗、合并計算等手段提高實(shí)驗結(jié)果的正確性,實(shí)驗的靈敏性,意義：考察藥效方法或模型對藥物劑量變化的敏感程度的一項指標(biāo)。 影響因素： 模型或方法的選擇 實(shí)驗動物 年齡、性別、健康狀況 實(shí)驗設(shè)計 量效曲線1684 表示方法：因變系數(shù),因變系數(shù),因變系數(shù)即回歸系數(shù)或回歸線斜度,實(shí)驗誤差控制,誤差： 指非設(shè)計因素帶來的使標(biāo)準(zhǔn)差增大的所有差異 認(rèn)識誤差來源從而控制誤差,誤差來源,1. 抽樣誤差 存在于任何實(shí)驗，是實(shí)驗中的重要誤差。 控制方法： 一定數(shù)量的樣本數(shù)

16、重復(fù)實(shí)驗 隨機(jī)化 使樣本具有代表性,2. 非均勻性誤差 主要由樣本代表性誤差所造成，因樣本不是來 源于均勻總體，僅在某一范圍內(nèi)抽樣。 控制方法：分層隨機(jī)法分組，既可得到總平均值，又可得到各層平均值。 3. 分配誤差 發(fā)生在將樣本個體分配在一定空間及不同性質(zhì)的組內(nèi)。 控制方法：隨機(jī)化是唯一消除的方法。,4. 條件誤差 影響因素：時間、溫度、濕度、氣壓、儀器的穩(wěn)定性和靈敏度、操作者技術(shù)水平和熟練程度、實(shí)驗動物的狀況等。 控制方法：對照、隨機(jī) 5. 順序誤差 是特殊形式的條件誤差，發(fā)生在實(shí)驗進(jìn)行時。 控制方法：在任何順序中均應(yīng)采用隨機(jī)化，無法隨機(jī)時，采用對照與實(shí)驗個體交叉設(shè)計。,6. 估計誤差 是主

17、觀誤差，由實(shí)驗者的主觀愿望所造成， 搜集材料、測定數(shù)據(jù)偏向有利實(shí)驗結(jié)果的方向 控制方法： 實(shí)驗者必須有實(shí)事求是、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ髯黠L(fēng)； 盡可能采用現(xiàn)代化、自動化的實(shí)驗儀器，讓儀器作出準(zhǔn)確的紀(jì)錄。,九、實(shí)驗數(shù)據(jù)的整理與處理,1. 讀 數(shù),數(shù)據(jù)計算和取值遵循有效數(shù)字法則及數(shù)字修約規(guī)則。,精密度：儀表的最小刻度稱為儀器的精密度。讀數(shù)時，由儀表最小刻度值向下估讀一位，數(shù)據(jù)最末位允許上下一個單位的誤差。 存疑數(shù)字：指最后一位估讀的數(shù)字 有效數(shù)字：數(shù)字中決定數(shù)量大小的有意義的數(shù)字，即由數(shù)字左側(cè)第一個非零數(shù)字開始直到最后包括0在內(nèi)的數(shù)字。與儀器的靈敏度有關(guān)，反映數(shù)據(jù)的測量誤差,有效數(shù)字與儀器精密度,有效數(shù)字：儀器

18、最小刻度是準(zhǔn)確的，前面的準(zhǔn)確數(shù)字和末位的存疑數(shù)字統(tǒng)稱有效數(shù)字。 要求： 根據(jù)儀器實(shí)際具有的精密度正確讀數(shù)、正確記錄實(shí)驗結(jié)果的有效數(shù)字，多讀和少讀均是錯誤的。 計算過程中允許多保留一位有效數(shù)字，但結(jié)果必須按規(guī)定修約。,例如： 稱取小鼠的體重是21.4g，表示體重的真值在21.3521.45g之間，其中，21g是準(zhǔn)確的，4 是估計的，3個數(shù)字均有意義，因此該數(shù)據(jù)的有效數(shù)字是3位。,2. 有效數(shù)字與誤差傳遞,稱取 指用分析天平稱量，精密度為0.1g 精密稱取或準(zhǔn)確稱取 指用微量天平稱取，其精密度為 0.0001g,“0”在數(shù)字中的雙重性,數(shù)據(jù)左側(cè)的0起定位作用，僅表示小數(shù)點(diǎn)位數(shù)，不是有效數(shù)字，如0.

19、0214 數(shù)據(jù)右側(cè)的0，即數(shù)字末尾的0是有效數(shù)字，不能舍去，如21.40 在儀器中，數(shù)字末尾的0表示儀器的精密度，且有1個單位的誤差。如0.0618與0.06180，前者為0.000 1，后者為0.000 01。,誤差傳遞規(guī)律加減計算,得數(shù)的最大絕對誤差是各實(shí)測值絕對誤差之和。 加減得數(shù)的小數(shù)位數(shù)等于或小于實(shí)測值中最少的小數(shù)位數(shù) 如 8.340.03561.1007.2756 最大絕對誤差是 0.01+0.0001+0.0010.0111 取舍為 7.2756 7.28,誤差傳遞規(guī)律乘除計算,積商的最大相對誤差是各實(shí)測值相對誤差之和。 乘除得數(shù)的有效位數(shù)等于或小于實(shí)測值中最少的有效位數(shù)。,如

20、藥物 800.0mg , 藥液容量50.00mL，動物體重19.5g(0.0195kg)，注射用量0.68mL，則： 用藥量為（800.0mg /50.00mL)(0.68mL/0.0195kg)=557.95mg/kg 最大相對誤差為0.1/800.0+0.01/50.00+0.01/0.68 +0.0001/0.0195=0.02016=2.016% 最大誤差 557.952.01611.25mg/kg 用藥劑量應(yīng)為 0.56g/kg 不能寫為560mg/kg，因560有三位有效數(shù)字,誤差傳遞規(guī)律乘方開方計算,乘方開方計算值的有效位數(shù)與原有效位數(shù)相同,誤差傳遞規(guī)律對數(shù)反對數(shù)計算,對數(shù)反對數(shù)計算值的有效位數(shù)與實(shí)測值相同，但對數(shù)的整數(shù)部分（首數(shù)）不算有效數(shù)字，不參與計算 即對數(shù)尾數(shù)的有效數(shù)字與實(shí)測值相同。 如：log27.21.43461.435,誤差傳遞規(guī)律均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差計算,均數(shù)由許多實(shí)測值組成，其絕對誤差大于各實(shí)測值 一般規(guī)定均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差的有效位數(shù)，應(yīng)根據(jù)1/3 標(biāo)準(zhǔn)差的第一位數(shù)取舍。