獸藥殘留檢測技術磺胺類.ppt

1、第六章 獸藥殘留檢測技術,第五節(jié) 磺胺類藥物殘留的危害分析與檢測方法,一、概述,磺胺類(Slfonamides)藥物是獸醫(yī)上較常用的一類合成抗感染藥物,具有抗病原體范圍廣、化學性質穩(wěn)定、使用方便、易于生產等優(yōu)點。 磺胺藥種類繁多,獸醫(yī)上常用的有10余種(圖) 。 磺胺藥單獨使用,病原體易產生耐藥性,與抗菌增效劑如TMP(甲氧芐啶)等聯(lián)用,抗菌范圍擴大,療效明顯增強,用來治療畜禽腸道感染、乳腺炎、肺炎等疾病。 同時也被廣泛的用作飼料添加劑,用來增肥 犢牛和豬。,危害,這種藥物可以殘留在動物的體內,人食用后對人體產生耐藥性等副作用,尤其是致癌性物質磺胺二甲嘧啶,能引起人的再生障礙性貧血,粒細胞缺乏

2、癥等疾病。 再生障礙性貧血:骨髓造血干細胞和/或造血微環(huán)境損傷性血液病。 粒細胞缺乏癥又叫白細胞減少癥,本病多起病緩慢，慢性經(jīng)過，少數(shù)可無癥狀?；颊呖捎蓄^暈、乏力、頭痛、四肢無力、食欲不振、低熱、失眠等；可有易感染傾向，如易患癤癰、肺炎、尿路感染，甚至發(fā)生敗血癥等。,根據(jù)腸道吸收的程度和臨床用途,分為內服難吸收用于腸道感染的磺胺藥、外用磺胺藥、內服易吸收用于全身感染的磺胺藥三大類。 除磺胺脒(琥磺胺噻唑、酞磺胺噻唑現(xiàn)已少用)用于腸道感染、磺胺嘧啶銀局部外用外,其他均用于全身性細菌感染,某些品種亦用于弓形體病、球蟲病和住白細胞原蟲病的治療。 不同的磺胺藥抗菌作用強度不同,一般依次為磺胺-6-甲氧

3、嘧啶(SMM)磺胺甲基異惡唑(SMZ) 磺胺異惡唑(SIZ)磺胺嘧啶(SD) 磺胺二甲氧嘧啶(SDM)磺胺對甲氧嘧啶(SMD) 磺胺二甲嘧啶(SM2) 磺胺鄰二甲氧嘧啶(SDM)。,吸收后存在形式,磺胺藥吸收后,一部分在血漿中保持游離狀態(tài)(游離型),一部分與血漿蛋白相結合(結合型),另一部分在肝臟中高度乙?；兂梢阴；前?。 游離型具抗菌作用,且能透過毛細血管進入各種體液和組織。 結合型無抗菌活性,也不能透入體液或組織中,但結合較疏松,能不斷分解出游離型磺胺。 乙?；腔前返闹饕x產物,無抗菌活性。,體內分布、代謝,磺胺藥在體內分布相當廣泛。各種組織和體液均能到達。以血液中含量最高,肝、腎次之

4、,胸水、腹水、滑膜液、房水中濃度也較高,并能透過胎盤進入胎兒體內。 磺胺藥在神經(jīng)、肌肉及脂肪組織中的含量則較低。 磺胺藥主要在肝臟代謝,代謝方式有乙?；?、羥基化、結合等,其中以乙?；癁橹?。 磺胺藥乙酰化后失去抗菌作用,且在尿中的溶解度降低,易在腎小管析出結晶,造成對泌尿道的損害。應注意同服碳酸氫鈉,并增加飲水,可減少或避免其對泌尿道的損害。 部分磺胺藥及代謝產物在肝內成為水溶性的葡萄糖醛酸結合物而失去活性。,排泄,內服難吸收的磺胺藥,主要由糞便排出; 內服易吸收的磺胺藥主要通過腎臟排泄,通過腎小球濾過或腎小管分泌到達腎小管腔內的藥物,有一部分被腎小管重吸收。重吸收少、排泄快的藥物如磺胺異惡唑在

5、尿中濃度較高,適用于治療泌尿道感染。主要由腎小管分泌,重吸收多的藥物在尿中濃度低,但在血中有效濃度維持時間較長,多屬長效如SMZ、SMM等。 磺胺藥尚可經(jīng)腸液、膽汁分泌排出,也可由乳汁排泄,但量較少。,常見磺胺藥,磺胺嘧啶 三甲氧芐啶 磺胺二甲嘧啶 磺胺二甲氧嘧啶 磺胺喹惡啉 磺胺噻唑 巴喹普林,磺胺嘧啶,屬廣譜抑菌劑,用于各種動物敏感菌的全身感染。 內服易吸收,排泄較緩慢,血藥濃度易達到有效水平。 磺胺嘧啶與血漿蛋白的結合率低,腦脊液中的濃度比其他磺胺藥高,因此是磺胺類藥中治療腦部細菌性感染的首選藥。 鰻魚內服放射性標記磺胺嘧啶后,以膽和皮中含量最高,血液、肝和腎次之。,磺胺嘧啶/甲氧芐啶,

6、豬內服磺胺嘧啶/甲氧芐啶后,胃腸道吸收甲氧芐啶較磺胺嘧啶快,但甲氧芐啶消除期較磺胺嘧啶消除期緩慢。休藥1天甲氧芐啶殘留最高的靶組織為肝臟(0.29g/kg),但磺胺嘧啶殘留最高的靶組織為腎臟(0.23mg/kg)。休藥8天所有組織均檢測不出磺胺嘧啶和甲氧芐啶的殘留量。 在8 的水溫,海水鱒魚投喂混合魚料(添加磺胺嘧啶和甲氧芐啶)后,開始時藥物消除很快,但到達某一殘留量時基本不再下降,即使休藥90天魚體內的殘留量仍可被檢出。因此,在10以上的水溫,鱒魚用藥(磺胺嘧啶/甲氧芐啶)后的休藥期應為60天,在10 以下的水溫不得使用。,三甲氧芐啶,屬化學合成抗菌藥,曾稱“磺胺增效劑”。 抗菌譜與磺胺相近

7、,它能抑制二氫葉酸還原酶,而磺胺藥則抑制二氫葉酸合成酶。兩者合用,可使細菌的葉酸代謝受到雙重阻斷,因而可大幅度提高抗菌活性(可增效數(shù)倍至數(shù)十倍),并可減少抗菌菌株的出現(xiàn)。 內服吸收快而完全,體內分布廣,組織中濃度一般比血中濃度高,肺、腎中濃度分別比血中濃度高17倍和10倍,膽汁中濃度分別比血中濃度高2.5倍和2倍。,三甲氧芐啶,三甲氧芐啶以非離子形式從腎排出,24h排出內服量的40%60%。少量從膽汁排泄,其濃度比血濃度高。 馬、水牛、黃牛、奶山羊和豬靜脈注射的消除半衰期分別為4.2h、3.4h、o.94h、1.43h和2.5h。雞、鴨約2h。體內代謝較少,代謝過程包括氮氧化和羥基化,所有代謝

8、物之和不超過總殘留的5%。 豬按規(guī)定劑量肌注后310天,組織中未檢出殘留量。連續(xù)飼喂10日劑量5mg/(kgd),休藥3天只有一個肌肉樣品能檢測到殘留量34g/kg(方法檢測限15釅kg),休藥5天有兩個皮/脂肪樣品的殘留量為31g/kg,休藥10天為27g/kg。,三甲氧芐啶,魚體內吸收和消除取決于水溫。鱒魚喂服20mg/kg,15 水溫、用藥后6h內血漿中可以檢測到殘留量,但7水溫、血漿中檢測不到殘留量,即使延長到12h也是如此。魚體內腎中殘留量最高,皮和血液次之。血藥濃度是肌肉濃度的23倍。消除半衰期約24h。主要通過膽汁排泄。 三文魚飼喂30mg/(kgd),連喂10日,休藥710天血

9、漿中殘留量約12mg/kg,肌肉在喂服后立刻采樣測定,測得平均殘留量10740g/kg,停藥30天和40天肌肉中平均殘留量為100g/kg和10g/kg。,磺胺二甲嘧啶,近年來細菌對本品的耐藥性增高,尤其是鏈球菌屬、奈瑟菌屬以及腸桿菌科細菌。主要用于巴氏桿菌病、乳腺炎、子宮炎、呼吸道及消化道感染,亦用以防治兔、禽球蟲病和豬弓形蟲病。 內服后吸收迅速而完全,維持有效血藥濃度時間較長。 磺胺二甲嘧啶在牛體內的代謝方式有乙酰化、羥基化、結合等,其中以羥基化為主,其次為乙?；?代謝物為6-羥甲基磺胺二甲嘧啶和N-乙?；前范奏奏?。 血液和奶中藥物濃度最高,肌肉、腎和肝次之。 肌肉、腎和肝中的N-乙?；?/p>

10、胺二甲嘧啶濃度比母藥濃度低,但腎中的6-羥甲基磺胺二甲嘧啶濃度超過母藥濃度。,磺胺二甲嘧啶,奶牛內服或肌注后,奶中母藥殘留量內服較肌注高,但殘留消除期基本相同。例如,休藥3天奶中的乳糖結合物和乙?；x物均低于10g/kg,休藥4天奶中母藥殘留量均低于10g/kg。 豬體內代謝主要以乙?；癁橹?血漿和組織中N-乙?；前范奏奏ごx物濃度最高,其他代謝物(如磺胺二甲嘧啶-寡糖綴和物、脫氨基磺胺二甲嘧啶等)則次之。組織消除半衰期1014h,血漿消除半衰期39天。休藥18天血漿中殘留量接近允許限量值(0.1mg/kg)。 羊一次靜注107mg/kg后,體內殘留消除很快,休藥5天組織(肉、肝、腎、脂肪

11、)中殘留量低于0.1mg/kg。 魚體內的代謝物主要為N-乙?；前范奏奏?少量為羥基化衍生物和?；苌?。,磺胺二甲氧嘧啶,主要用于防治犢牛、雞、兔球蟲病,亦用于防治雞傳染性鼻炎、禽霍亂、卡氏住白細胞原蟲病、豬狗的弓形體病及諾卡菌病。 家禽飼服后吸收快而排泄慢,作用維持時間長。肝和腎中有較高的藥物濃度,血漿蛋白結合率為80%85%。 除腎臟外,其他組織中藥物濃度降低至0.1mg/kg或以下需休藥8天。蛋雞或火雞內服后,蛋雞休藥6天、火雞休藥8天,這樣組織殘留可低于允許限量值(0.1mg/kg)。 體內乙?；实?代謝物N4-乙?；前范奏奏ぶ饕嬖谟谘獫{、組織和糞中,消除期約7天。,磺胺二

12、甲氧嘧啶,蛋雞飲服1.0g/L/日或0.5g/L/日,連續(xù)5日,蛋中有較高的殘留,蛋清和蛋黃的最高殘留可達30mg/kg和9mg/kg;殘留降至0.1mg/kg,蛋清需體藥46天,蛋黃需休藥7天。 與奧美普林(ormethoprim)聯(lián)用,三文魚用藥后38天,兩種藥物在血漿和組織中達到一個相對穩(wěn)定的殘留量?；前范籽踵奏さ淖罡咂骄鶜埩袅?血漿14.3mg/kg、肌肉17.7mg/kg、肝7.4mg/kg、腎6.8mg/kg;消除半衰期:血漿h、肌肉19h、肝62h、腎45h。 奧美普林的最高平均殘留量:血漿1.5mg/kg、肌肉3.7mg/kg、肝9.1mg/kg、腎166.0mg/kg;消除

13、半衰期:血漿63h、肌肉143h、肝95h、腎410h。,磺胺喹惡啉,別名磺胺喹沙啉,為類白色或淡黃色粉末,無臭,不溶于水,溶于甲醇、乙醇,易溶于堿性溶液。 磺胺喹惡啉屬磺胺類藥兼有抗球蟲作用,廣泛用于養(yǎng)禽業(yè),治療雞鴨的家禽霍亂及球蟲病。 家禽內服后吸收迅速,但排泄緩慢,殘留在組織器官及雞蛋中時間長。 兔飼喂100mg/kg,一日兩次、連喂5日,肝和腎中殘留量較高,第4天達峰值。休藥78天,肝、腎和血漿中的殘留量降到0.1mg/kg。,磺胺噻唑,抗菌作用比磺胺嘧啶強,能抑制細菌的二氫葉酸合成酶,阻礙細菌的葉酸合成,抑制細菌生長和繁殖。 對溶血性鏈球菌、肺炎桿菌、淋球菌、葡萄球菌、腦膜炎球菌、大

14、腸桿菌及痢疾桿菌等有抗菌作用。 用于敏感菌所致的肺炎、出血性敗血癥、子宮內膜炎及禽霍亂、雛白痢等。對感染創(chuàng)可外用其軟膏劑。同時也被用作飼料添加劑,增肥犢牛和豬。,磺胺噻唑,內服吸收不完全,馬、牛、豬、羊一次內服0.1mg/kg,其血藥峰濃度僅為20mg/L。 其可溶性鈉鹽肌肉注射后迅速吸收。吸收后排泄迅速,單胃動物內服后,在12h內經(jīng)腎排出約50%,24h約90%。其半衰期短,不易維持有效血濃度。 在體內與血漿蛋白的結合率和乙酰化程度均較高,其乙?；锶芙舛缺仍幍?易產生結晶尿而損害腎臟。,巴喹普林,巴喹普林(BQP)是一種新型動物專用的磺胺類藥物,最早由美國Wellcome Foundat

15、ion 公司于1989年創(chuàng)制,1991年美國Malhnd Rrodt公司將其與磺胺類藥物配成復方制劑上市。 BQP抗菌譜與其他磺胺類藥相近,同時又是磺胺等抗菌藥物的增效劑。主要用于牛的肺炎及腸炎、腐蹄病、臍部感染、感染性外傷、感染性角膜結膜炎、非泌乳期牛的木舌病和放線菌下頜腫塊;豬胃及腸道感染、胸膜肺炎、乳腺炎、子宮炎、無乳綜合癥等;狗的泌尿系、呼吸系、胃腸道及皮膚感染。,巴喹普林,內服生物利用度高且分布廣泛、體內的消除半衰期長。豬肌注的休藥期為28天,牛肌注和內服的休藥期分別為28天和21天。奶牛用藥后的棄乳期為4天。主要經(jīng)膽汁和腎排泄。 豬、牛用藥后1442天,肝、腎和注射部位的母藥殘留在

16、總殘留中占很低的百分比,同時肌肉和脂肪的殘留量低于檢測方法的測定限。豬皮中含相當高的母藥殘留,而且降解和消除都比?？?殘留量相應亦低。,二、樣品處理,常用的磺胺類藥物,除少數(shù)外,一般具有以下的基本結構:,其化學性質可從四部分結構上表現(xiàn)出來, 即:磺酰胺基( SO2NHR)、 芳伯氨基( NH2)、芳環(huán)、N1及N4上的取代基。,(R=H),兩性化合物,可溶于酸或堿溶液。,磺酰氨基的酸性表現(xiàn)在N1上的活潑氫原子,其酸性的大小取決于N1上的取代基R。R的吸電性越大,則其酸性越強。,化學性質,本類藥物水溶性較低,易溶于極性有機溶劑如乙醇、丙酮、乙腈、氯仿和二氯甲烷,難溶于非極性有機溶劑。 由于磺胺藥具

17、有酸堿兩性,通過調節(jié)溶液的pH值(pH79),可以使磺胺藥呈不同狀態(tài),即中性分子還是離子分子,從而改變水相和有機相的分配系數(shù)。 例如,磺胺的中性分子,在二氯甲烷等有機溶劑中分配系數(shù)大;離子態(tài)分子,則水性溶液中分配系數(shù)大。 生物樣品通過多次液-液萃取,可達到凈化的目的。,1、提取,液體樣品(如牛奶)可用水稀釋過濾后,熒光直接檢測,亦可用水性緩沖液或氯化鈉溶液稀釋,再進行凈化處理。 蜂蜜樣品可用水或水性緩沖液稀釋。 組織樣品(如肌肉、腎臟、肝臟)的預處理相對復雜些,一般采取均質、液-液萃取或固相萃取凈化等步驟。 液-液萃取操作煩瑣,而蛋白沉淀后直接進樣,雖操作簡便、并具有較高的回收率,但對色譜柱的

18、損害較為嚴重。,溶劑提取,溶劑提取時,應盡可能使組織中結合態(tài)的殘留物溶解,并且除去大部分的蛋白質。 一般可采用酸性水溶液、乙腈、氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮或混合溶劑等極性溶劑進行提取。 二氯甲烷中加入離子對試劑四丁基銨(pH10),對魚肉和動物組織的提取,發(fā)現(xiàn)磺胺二甲氧嘧啶和奧美普林的提取率很高。 另外,提取過程中加入無水硫酸鈉可脫去組織樣品中的水分,有助于樣品的充分提取。,2、凈化,初提取液中含大量的內源性干擾雜質,在痕量分析時會干擾組分的測定,因此還需要凈化處理。 凈化方法有液-液萃取、固相萃取、基質固相分散、在線痕量富集、液相色譜、在線透析和超臨界流體萃取等。 有時為了獲得高的凈化效

19、果,幾種方法相結合應用。,液-液萃取,液-液萃取盡管操作煩瑣、耗費溶劑,但在所有凈化方法中應用最廣。 通過調節(jié)樣液的pH值,使磺胺類藥物有選擇性地在有機相與水相之間進行分配。 例如,有機相提取液中的磺胺類藥物可以被強酸溶液或堿性溶液抽提,若將水相提取液調節(jié)pH至5.15.6,可用二氯甲烷或乙酸乙酯進行再抽提。 離子對提取法亦有應用,例如,水相提取液調節(jié)pH至1011,加入四丁基銨離子對試劑,形成磺胺類離子對,可以被二氯甲烷提取。 用正己烷或乙醚進行液-液萃取,可以脫脂肪。,固相萃取,由于甲氧芐啶常和其他磺胺藥物同時使用,而它們具有不同的pKa和溶劑親和力,難以在給定的pH值和溶劑系統(tǒng)中同時提取

20、,宜采用固相萃取法(SPE)。 常用的SPE柱,如C18和C8、硅膠柱、離子交換柱、Florisil柱和堿性氧化鋁柱等。 該法操作較為簡便、并對生物樣品具有較高的“凈化”能力,可提高方法的提取回收率和精密度。亦可將幾種小柱串聯(lián)應用,可獲得更高的凈化效果。 基質固相分散法目前只使用C18吸附劑,該方法簡便、提取率和凈化能力均高,已應用于魚肉、牛肉、豬肉和牛奶樣品的預處理。,柱切換技術,在線痕量富集技術可分離/凈化牛奶樣品中9種磺胺類藥物： 磺胺類藥物在預富集柱RP-C18(10m)中被保留濃縮,干擾雜質用淋洗劑洗去后,預柱中的磺胺類藥物再用洗脫液洗脫,進入分析柱中分離。 有研究者將TSK凝膠滲透

21、柱和PLRP-S預富集柱串聯(lián)使用,用于凈化豬組織中的磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑和甲氧芐啶。,在線透析,采取在線透析、富集的方法,可測定動物源食品(肌肉、牛奶和蛋)中的13種磺胺類藥物： 利用纖維素膜選擇性滲過分析物,到達預富集柱(C18、XAD-2或XAD-4),干擾雜質用淋洗劑洗去,濃縮后的分析物被洗脫后,進入分析柱分離。,超臨界流體萃取,超臨界流體萃取法被用于豬腎臟樣品中甲氧芐啶和3種類固醇激素的提取分離。 CO2提取時,分析物被保留在柱的進樣端,大部分內源性干擾物被洗去后,分析物和一些極性干擾物用加入改性劑的CO2洗脫。,三、分析方法,生物樣品中磺胺類藥物的分析,光譜法(分光光度法、熒光

22、光譜法)和色譜法（薄層色譜、氣相色譜、液相色譜、超臨界流體色譜）具有靈敏、快速、方便等優(yōu)點。 例如：分光光度法測定牛組織中的磺胺甲嘧啶，蜂蜜中的磺胺噻唑，奶中的乙酰磺胺、 N-乙?；前范奏奏?； 薄層色譜法測定動物組織、豬肝、奶中的磺胺甲嘧啶，蜂蜜中的磺胺噻唑。,1、光譜法,光譜法主要用于樣品中個別磺胺類藥物的分析,最常用的方法為重氮化-偶合反應分光光度法。 無N4取代基的磺胺類藥物,或N4為酰氨基的磺胺類藥物,經(jīng)水解,在酸性介質中經(jīng)重氮化后,可在堿性中與酚類(如-萘酚、麝香草酚)偶合,在中性中與變色酸偶合,或在弱酸性中與胺類偶合呈色,于空白校正下,在一定波長處測其吸收度。與標準品對照,即可測

23、定其含量。 最常應用的是酸性偶合試劑,如N-(1-萘基)乙二胺(Bratton Marshall方法),測定波長隨組分的不同略有不同,一般為540545nm,已應用于牛組織和奶中的磺胺二甲嘧啶檢測、蜂蜜中的磺胺噻唑檢測。,也有應用1-(-二乙氨基-乙基-氨基)萘,優(yōu)點為偶合形成的偶氮染料是水溶性的,且其吸收系數(shù)也較大。這兩種偶合試劑遇亞硝酸都能變色,所以,經(jīng)重氮化后,應以氨基磺酸鹽將剩余的亞硝酸分解除去。 光譜法選擇性差,但可作為一種篩選法應用,如牛奶中磺胺醋酰和磺胺脒啶的篩選測定。,2、薄層色譜法,薄層色譜(TLC)經(jīng)常作為樣品篩選方法。 經(jīng)薄層色譜分離后的磺胺類藥物,可按兩種方法進行定量分

24、析：洗脫定量法和薄層掃描定量法。 洗脫定量法：從板上洗脫后,可按分光光度法,或與熒光胺、對二甲氨基苯甲醛反應后的比色法,或重氮化-偶合后的比色法進行。其中,以重氮化-偶合法最好。 但與實際相比,測得值尚低5%15%。結果偏低的主要原因是薄層色譜條件不穩(wěn)定,吸附劑可能部分損失。板上洗脫后重氮化-偶合法如下:,刮下的薄層用1mol/L HCl 10mL提取,所得提取液先加0.1%NaNO2液1mL,5min后,再加0.5%氨基磺酸銨液1mL,強烈振搖后,加入0.1% N, N-乙基-N (1-萘基)乙二胺草酸鹽溶液1mL,10min后,用3cm的吸收池,以同法所得的試劑空白為對照,于546mm處(

25、SMP、SIZ、ST的max)或542nm處為SM2 、SPZ(磺胺苯吡唑）的max進行測定。,薄層掃描定量法,薄層掃描法（TLCS）系指用一定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中有紫外或可見吸收的斑點或經(jīng)照射能激發(fā)產生熒光的斑點進行掃描，將掃描得到的圖譜及積分值用于藥品的質量檢查的方法。 隨著制板、點樣、展開等操作的儀器化及儀器性能的改進，薄層掃描法檢測的靈敏度，結果的精密度與準確度均大大提高。 與高效液相色譜法相比，具有多通道效應，可同時平行分離分析多個樣品；流動相用量少且選擇范圍寬、更換方便；固定相為一次性使用，對樣品的預處理要求不高等優(yōu)點。,應用TLC紫外分光光度法進行磺胺類藥物定量分

26、析時,有7%11%的損失。 如用無黏合劑的硅膠,以0.1mol/L NaOH調糊制板,可以獲得較好的回收率。 TLC的優(yōu)點是設備簡單、可以同時在多塊板上點樣,處理大量樣品時間短,適合飼料、組織、體液樣品的篩選分析。,3、氣相色譜法,氣相色譜法(GC)具有高的靈敏度和選擇性,但由于磺胺類藥物難揮發(fā), 測定時需要衍生化。 一般用重氮甲烷甲基化,或甲基化后再用N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)進行硅烷化或N-甲基雙(三氟乙酰胺)(MBTFA)乙酰化,以增加揮發(fā)性,改善色譜特性(熱穩(wěn)定性、降低極性),氫火焰離子化檢測器測定。 除了甲基化外,也可利用水解法將磺胺類藥物水解成相應的揮發(fā)性胺

27、類,繼之以GC法測定, 也可與適宜的鹵化試劑反應,生成相應的衍生物,如三氟乙?；蚱叻□；苌锏?以電子捕獲檢測器測定。,GC分離柱,磺胺類藥物的分離柱可用填充柱和石英毛細管柱,通常毛細管柱(DB-5)分離效果更好。 樣品確證分析時,一般用質譜檢測器測定,離子源采用化學電離和電子轟擊接口。 多數(shù)磺胺類藥物含有對氨基苯磺?；Y構部分,它們的結構差異只是N1取代基的不同,所以本類藥物的質譜有許多共有的特征峰,如m/z 56、l40、108、92、65和39等碎片離子峰。,4、超臨界色譜法,Ramsey等用超臨界流體色譜法測定豬腎組織中的甲氧芐啶和三種類固醇激素,分析柱為Spherisorb 5

28、氨基鍵合柱,含甲醇的CO2作流動相,熱噴霧電離串聯(lián)質譜檢測器測定,檢測限約10mg/kg,對于組織和奶中g/kg級殘留量的檢測,靈敏度不夠。,5、高效液相色譜法,20世紀80年代以來,普遍采用反相色譜法,使用C18、C8和苯基柱,尤以C18應用最廣,以甲醇(或乙腈)-水(含醋酸或偏磷酸)系統(tǒng)為流動相,可分離檢測數(shù)種磺胺類藥物及其代謝物,樣品可用甲醇或堿性緩沖液溶解制備。 流動相中加入適量戊磺酸、己磺酸和辛磺酸離子對試劑,可以改變磺胺類藥物的保留時間和改善峰形。 HPLC的洗脫方式,一般采用等度洗脫,若需同時檢測數(shù)種磺胺類藥物或多種代謝物,可采用梯度洗脫,通過改變流動相流速或配比,實現(xiàn)在較短的時

29、間內對生物樣品中混合組分或代謝物的分離。,由于甲氧芐啶分子結構中不含磺酰胺結構,其堿性較其他磺胺類藥物強,在HPLC分離檢測時,在ODS柱上會產生一定的拖尾現(xiàn)象,可采用反相離子對色譜法,以十二烷基磺酸或四丁基銨鹽作為反離子,也可使用掃尾劑三乙胺改善其拖尾現(xiàn)象。但離子對色譜法對色譜柱有一定的損害作用,應予注意。,有些用通常的HPLC法難以分離的磺胺類藥物,使用-環(huán)糊精化學鍵合固定相很容易達到分離。 其分離原理,是基于當磺胺藥物分子接近或透入到-環(huán)糊精疏水腔內時可形成包合物,改變了磺胺類藥物分子的某些理化性質。包合物的穩(wěn)定性與磺胺類藥物分子和-環(huán)糊精分子的大小有關,與-環(huán)糊精作用強的磺胺類藥物洗脫

30、較難,有較長的保留時間;與-環(huán)糊精作用弱的磺胺類藥物洗脫容易,有較短的保留時間,據(jù)此,可將磺胺類藥物分離。 本法選擇的流動相為磷酸鹽緩沖液(pH7.0)-甲醇(85+15),可分離7種磺胺類藥物的混合物。,紫外檢測器,磺胺類藥物在250290nm波長區(qū)間有強的紫外吸收,因此HPLC的在線檢測,一般采用紫外檢測。 為提高檢測靈敏度,可使用對二甲氨基苯甲醛(DMAB) 柱后衍生化,于450nm處紫外-可見光檢測,已應用于蛋、奶和肌肉組織中13種磺胺類藥物的測定,以及動物組織中6種磺胺類藥物的測定。,熒光檢測器,磺胺類藥物本身具有弱的熒光特性,但熒光檢測時還需要熒光衍生化。 常用的熒光衍生劑有鄰苯二

31、甲醛(OPA)、熒胺和巰基乙醇等。 磺胺類藥物與OPA或其衍生物(如4-羥基-鄰苯二甲醛)在酸性介質中反應呈現(xiàn)藍色熒光,檢出量可達1 10-9810-8mol/mL的濃度范圍。,熒胺作為熒光衍生劑,可選擇性地用于具有脂肪族伯胺基團藥物共存時芳伯胺藥物的微量測定,其檢測限量可達0.810-9mol/mL。 此外,也有人采用2,6二氨基吡啶作為熒光衍生劑,其檢出量可達10-9 10-10mol/mL。 衍生化方式有柱前衍生化和柱后衍生化。,電化學檢測器,亦可使用電化學檢測器,但在尿中甲氧芐啶代謝物的測定中,與紫外檢測比較,電化學檢測器的檢測靈敏度并無顯著提高,且不能同時檢測甲氧芐啶。 若需同時檢測

32、甲氧芐啶,可通過提高工作電位實現(xiàn),但此時檢測靈敏度將顯著下降。,例子1,Horie等報道了蜂蜜中10種磺胺類藥物的LC-UV測定方法。 5g蜂蜜樣品中加入50mL 30%氯化鈉溶液,用二氯甲烷提取,提取液中加入無水硫酸鈉脫水,過Sep-Pak Florisil固相萃取柱,用10mL乙腈-二氯甲烷(2+8)淋洗,用10mL甲醇-二氯甲烷(2+8)洗脫,濃縮至干,用1mL流動相溶解,進樣。 色譜柱為LiChrosphere RP-18e(25cm,5m),以0.05mol/L 磷酸二氫鈉-乙腈(2+1)作流動相,流速0.5mL/min,275nm處紫外檢測,能檢測到蜂蜜中磺胺類藥物濃度50g/kg。,標準品和蜂蜜樣品色譜圖,1一磺胺噻唑;2一磺胺嘧啶;3一磺胺甲嘧啶;4一磺胺甲氧噠嗪; 5一磺胺二甲嘧啶;6-磺胺間甲氧嘧啶;7一磺胺氯達嗪; 8一磺胺甲蟋唑;9一磺胺喹嗯啉;10一磺胺二甲氧嘧啶,例子2,Simeon