中山大學(xué)人類X染色質(zhì)標(biāo)本的制備與觀察報(bào)告

1、人類X染色質(zhì)標(biāo)本的制備與觀察張皓予 15335203一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.掌握人體口腔黏膜上皮細(xì)胞制備的方法。2.正確識(shí)別巴氏小體的特征及其所在位置。3.說明人體細(xì)胞中核內(nèi)X染色體的數(shù)目和性染色體數(shù)目之間存在的關(guān)系。二、實(shí)驗(yàn)原理 X染色質(zhì)呈現(xiàn)于女性體細(xì)胞間期細(xì)胞核內(nèi)。在口腔黏膜細(xì)胞、羊水脫落細(xì)胞、皮膚結(jié)締組織等細(xì)胞中均可檢出。用苯酚品紅改良染液染色后，便可觀察到染色較濃，多位于核膜內(nèi)側(cè)緣，呈凸平形、卵圓形、扁平或三角形，直徑約1m大小的小體。女性細(xì)胞核中出現(xiàn)率為40%60%。Barr和Bertram首先（1949）在雌性貓的神經(jīng)細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)，在多數(shù)核中部有一個(gè)小的深染的小體，而在雄性貓的同樣細(xì)胞中

2、只能偶而觀察到這種小體，此后許多人的研究指出這種與性別有關(guān)的兩型現(xiàn)象在有袋類、偶蹄類、食肉類和靈長類等動(dòng)物的多數(shù)組織細(xì)胞中存在，而在噬齒類中只在少數(shù)組織中可以觀察到。這種染色質(zhì)小體現(xiàn)在稱為“性染色質(zhì)”(sex chromatin)，或稱為“巴氏小體”(Barr body)。這種小體常位于核膜的內(nèi)表面，呈Feulgen陽性反應(yīng)，表明是DNA的成分，有證據(jù)表明，性染色質(zhì)的存在是由于在雌性哺乳動(dòng)物核中存在兩個(gè)X染色體，其中一個(gè)X染色體處于失活狀態(tài)。雄性個(gè)體只有一個(gè)X染色體。因此原則上男性不應(yīng)有性染色質(zhì)。但如果一個(gè)男人有XXY染色體，那就會(huì)有一個(gè)性染色質(zhì)，雖然表現(xiàn)為男性。同樣，XXX的三體應(yīng)當(dāng)有兩個(gè)巴

3、氏小體。因此，性染色質(zhì)實(shí)質(zhì)上是一個(gè)失活的X染色體。為什么失活的X染色體會(huì)以巴氏小體的形式顯示出來?目前，已有許多證據(jù)證明，在雌性個(gè)體中那根失活的X染色體已經(jīng)異染質(zhì)化，成為功能性異染質(zhì)。使用放射自顯影的方法已經(jīng)證明，失活的X染色體的固縮周期與其它染色體是不同步的，它在S期是晚復(fù)制的。此外，人們也已發(fā)現(xiàn)，晚復(fù)制的這根X染色體常位于核的邊緣，這個(gè)位置也正好是巴氏小體出現(xiàn)的位置。三、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 1.儀器與用具顯微鏡，水浴鍋，牙簽，載玻片，蓋玻片，鑷子，吸水紙。2.試劑95%乙醇，1mol/L鹽酸，改良苯酚品紅染色液四、實(shí)驗(yàn)材料男性和女性人體口腔黏膜細(xì)胞。五、實(shí)驗(yàn)步驟 1.受檢者用水漱口，用牙簽刮取

4、受檢者口腔頰部黏膜，把第一次刮取物棄去，然后再次用牙簽刮取黏膜，將第二次刮取物均勻涂布到干凈的載玻片上，晾干。2.將涂片放入95%的乙醇中固定20min，取出晾干。3.將涂片放入1M HCl中37攝氏度下水解20min，取出后自來水緩緩沖洗。4.用改良品紅染液染色8min，不干燥，輕輕蓋上蓋玻片，用吸水紙蓋住輕輕壓片。5.鏡檢，從低倍鏡到高倍鏡依次觀察。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖1、2、3 女性口腔上皮細(xì)胞被染色的細(xì)胞核與巴氏小體（箭頭）圖4 男性口腔上皮細(xì)胞被染色的細(xì)胞核如圖1、2所示，可在染成淡紫色的女性上皮細(xì)胞細(xì)胞核的邊緣較清楚地觀察到一顆染色較深的小體，即巴氏小體。圖3右下角的有一不明顯的深色斑塊

5、，可能是巴氏小體。圖4為染成紫色的男性上皮細(xì)胞細(xì)胞核，沒有觀察到明顯的巴氏小體。 經(jīng)觀察男性、女性細(xì)胞個(gè)五十個(gè)發(fā)現(xiàn)：50個(gè)女性細(xì)胞有21個(gè)有巴氏小體，占42%；50個(gè)男性細(xì)胞有0個(gè)有巴氏小體。七、討論1、鏡檢時(shí)發(fā)現(xiàn)女性上皮細(xì)胞標(biāo)本中的細(xì)胞數(shù)較少，密度低較分散（圖3對(duì)比圖4）?？赡苁怯捎谕科瑫r(shí)不夠均勻，大部分涂在玻片邊緣導(dǎo)致在后續(xù)固定、沖洗、染色、壓片等步驟時(shí)有細(xì)胞流失。也有可能是染色時(shí)間不夠或者刮取細(xì)胞時(shí)刮得太少所致。2、觀察發(fā)現(xiàn)女性上皮細(xì)胞當(dāng)中的巴氏小體形態(tài)多有些模糊，且染色較淺，可能是由于染色時(shí)間較短導(dǎo)致。本實(shí)驗(yàn)染色時(shí)間為8min，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以適當(dāng)延長染色時(shí)間（10min）以使實(shí)驗(yàn)效果更加

6、明顯。八、思考題 1、男性沒有巴氏小體的理論基礎(chǔ)為維持雌雄兩性生物基因表達(dá)一致，細(xì)胞中存在一種劑量補(bǔ)償效應(yīng)，使細(xì)胞中只含有一份有活性的X染色體，而多余的染色體失活形成巴氏小體，雌性的兩個(gè)X染色體所攜帶的兩份基因的遺傳效應(yīng)即可與雄性一個(gè)X染色體所具有的一份基因的遺傳效應(yīng)基本相當(dāng)。而由于男性本身就只有一條X染色體，所以不需要使多出的X染色體失活，從而也就沒有巴氏小體。2、男變女的變性手術(shù)后，該女性有無巴氏小體？沒有，因?yàn)樽冃允中g(shù)只是改變了個(gè)體的外在表型如個(gè)別器官的形狀和功能等，不能改變其細(xì)胞內(nèi)染色體的構(gòu)成，故該個(gè)體仍只有一條X染色體，不可能形成巴氏小體。3、鑒定巴氏小體有什么臨床意義？巴氏小體的臨床意義在于能夠用來鑒別性別。例如可以通過對(duì)胎兒羊水中取得的脫落的細(xì)胞的檢查判斷性別，如有巴氏小體，胎兒為女性，如果細(xì)胞中無巴氏小體，胎兒為男性。原男性變性運(yùn)動(dòng)員參加女子項(xiàng)目，可通過檢查其白細(xì)胞中有無巴氏小體而確定其性別。通過巴氏小體檢查可確定胎兒性別和查出性染色體異常的患者，如克氏（Klinefelters）綜合征患者外貌為男性，但有一個(gè)巴氏小體，可判定患