環(huán)境毒理學的基本研究方法ppt課件

1、環(huán)境毒理學的基本研究方法,毒理學試驗 調查研究,1,PPT學習交流,毒理學實驗基礎,2,PPT學習交流,研究方法 流行病學研究 受控的臨床研究 毒理學體內試驗 毒理學體外試驗 優(yōu)點 真實的暴露條件 規(guī)定的限定暴露條 易于控制暴露條件 影響因素少，易于控 在各化學物之間發(fā)生相 在人群中測定反應 能測定多種效應 制 互作用 對某組人群(如哮喘) 能評價宿主特征的作用 可進行某些深入的研 測定在人群的作用 的研究是有力的 (如：性別、年齡、遺 究(如：機制，代謝) 表示全部的人敏感性 能測定效應的強度 傳特征等和其他調控因 人力物力花費較少 素飲食等) 能評價機制 缺點 耗資、耗時多 耗資多 動物暴

2、露與人暴露相關 不能全面反映毒作用 多為回顧性，無健康 較低濃度和較短時 的不確定性 不能作為毒性評價和 保護 間的暴露 受控的飼養(yǎng)條件與人的 危險性評價的最后依 難以確定暴露，有混雜 限于較少量的人群 實際情況不一致 據 暴露問題 (一般50) 暴露的濃度和時間的模 難以觀察慢性毒作用 可檢測的危險性增加必 限于暫時、微小、 式顯著地不同于人群的 需達到2倍以上 可逆的效應 暴露 測定指標較粗(發(fā)病率， 一般不適于研究最 死亡率) 敏感的人群,毒理學研究方法的優(yōu)缺點,3,PPT學習交流,1 實驗動物和人對外源化學物的反應敏感 性不同，有時甚至存在著質的差別 2 高劑量向低劑量外推的不確定性

3、3 小數量實驗動物到大量人群外推的不確 定性 4 成年健康動物向年老體弱及患病個體外 推的不確定性,實驗動物的毒理學實驗資料外推到人群接觸的安全性時的不確定性,4,PPT學習交流,1 化學物在實驗動物產生的作用，可以外推 于人?；炯僭O 人是最敏感的動物物 種；人和實驗動物的生物學過程與體重 (或體表面積)相關。 2 實驗動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對 人潛在危害的必需的和可靠的方法。 3 成年的健康(雄性和雌性未孕)實驗動物和 人可能的暴露途徑是基本的選擇。,描述毒理學試驗的基本原則,5,PPT學習交流,1 受試物毒作用的表現(xiàn)和性質 2 劑量反應(效應)研究 3 確定毒作用的靶器官 4 確

4、定損害的可逆性,毒理學毒性評價試驗的基本目的,6,PPT學習交流,實驗動物（laboratory animal） 指經人工培育，對其攜帶微生物實行控制，遺傳背景明確，來源清楚，可用于科學研究的動物。,實驗動物的選擇,7,PPT學習交流,實驗動物的選擇,物種選擇 選擇對外液化學物的毒性反應及代謝特點與人類接近的物種； 選擇自然壽命不太長的物種； 選擇易于飼養(yǎng)和實驗操作的物種； 選擇經濟并易于獲得的物種。,8,PPT學習交流,近交系動物 連續(xù)20代以上兄妹交配或親子交配培育 突變系動物 突變的基因可世代相傳并保持遺傳基因特性 雜交群動物 兩個不同近交系之間有目的進行交配，所產生的第一代動物， 亦稱

5、雜交一代動物。 封閉群動物 5年以上不從外部引進新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所保存繁殖的動物群,實驗動物的選擇,品系選擇,9,PPT學習交流,無菌動物 體內外均無任何微生物和寄生蟲 無特定病原體動物（SPF）體內無特定微生物和寄生蟲存在的動物(無傳染病)。飼養(yǎng)于封閉的系統(tǒng)。 清潔動物 與SPF的不同：抗體檢查常有腦脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒等抗體滴度，但不應有臨床癥狀、病理改變及自然死亡。飼養(yǎng)在半屏蔽系統(tǒng)。,微生物控制的選擇,實驗動物的選擇,10,PPT學習交流,個體選擇 1 年齡 2 性別 3 生理狀態(tài) 4 健康狀況,實驗動物的選擇,11,PPT學習交流,品 系 周齡 Wistar SD

6、雌性雄性雌性雄性 354565052 4919786101 5134134130150 6166187172206 7209233210262 8214297240318 9232325258365 10246370272399,大鼠體重與周齡的關系,12,PPT學習交流,小鼠體重與周齡的關系 品 系 周齡 昆明 BALB/c C57BL/6 615 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 01.95 2.10 1.40 1.46 1.40 1.44 1.58 1.58 15.54 5.82 3.35 3.50 3.42 3.50 4.64 4.64 27.90 8.35 5.50 5

7、.60 5.55 5.60 7.96 7.96 313.55 14.80 7.32 7.40 6.40 6.90 9.83 9.83 421.35 22.6011.6012.4512.2012.5715.7519.00 527.90 33.2514.7516.1016.9018.1020.7522.58 632.80 39.2515.6017.4018.4020.5021.8825.96 734.70 39.9016.1018.6519.0021.6023.1227.96 834.80 40.0518.1620.2520.2522.4024.1628.83,13,PPT學習交流,1 未處理對照

8、組(空白對照組)：本底值， 質量控制 2 陰性(溶劑賦形劑)對照：與染毒組比 較的基礎 3 陽性對照：檢測試驗體系的有效性 4 歷史性對照：檢查試驗體系的穩(wěn)定性， 即進行實驗室質量控制和保證,毒理學試驗常用對照,14,PPT學習交流,對各個毒理學試驗應該用同一種、同一批號受 試物 受試物成分和配方必須固定 如是異構體混合物，異構體比例必須固定 活性成分的百分含量和可檢測的雜質的濃度也 應固定 受試物在貯存期內穩(wěn)定性和在飼料中的穩(wěn)定性 必須進行研究并報告 受試物應一次備齊全部實驗的用量,受試樣品,15,PPT學習交流,毒理學試驗設計的統(tǒng)計學要求 隨機、重復、對照原則 對常規(guī)毒理學試驗資料的統(tǒng)計學

9、方法 計量資料：一般用t檢驗或ANOVA 記數資料：卡方檢驗,毒理學試驗的統(tǒng)計學,16,PPT學習交流,1 處理組與對照組比較差別有無顯著性 2 有無劑量-反應關系 3 是否伴有其他相關參數的改變 4 是否在 “正?！敝捣秶?實驗結果的判斷,17,PPT學習交流,第一節(jié) 急性毒性試驗 一、急性毒性試驗的目的： 1、確定供試化學物急性毒性的劑量反應關系和中毒特征； 2、求LD50或LC50,為急性毒性評價提供依據。 3、研究毒物的毒動學和毒效學過程。,表示急性毒性大?。?LD50(對受試物的個體感受性影響較小，有更高的重現(xiàn)性),18,PPT學習交流,二、試驗程序與評價 1動物選擇：首選受試物在體

10、內代謝情況與人體內相近的或對受試物最敏感的品系。 一般：以哺乳動物為主，常用大鼠、小鼠； 經皮：兔、豚鼠、豬 應對兩種性別、成年和幼年動物進行測定。 選擇兩種以上的實驗動物，最好一為嚙齒類，一為非嚙齒類。(目的：核對種間差異),19,PPT學習交流,2染毒途徑與方式： 一般與人的接觸途徑相同。 (1)經口染毒：常用灌胃法，也可將受試物放在飲水中由動物自由攝取。 (2)經呼吸道染毒： 將實驗動物放在有毒氣或粉塵的染毒柜內進行染毒。急性吸入染毒采用靜式染毒瓶(柜)，染毒24h。 (3)經皮膚染毒：主要用于化學物經皮(或粘膜)吸收所引起的急性毒性。正式給藥前24h，背部脫毛，勿傷皮膚。將受試物均勻涂

11、布于皮膚表面，用紗布覆蓋，共敷24h。,20,PPT學習交流,3試驗程序： （1）劑量與分組 預試驗：找出受試物大致致死量范圍(死亡率為10%90%)； 例：欲做化合物A的經口預試驗。 化合物B的化學結構與A相似，已知B的=LD50 =40(預期毒性中值)。 則預試驗取2.5、10、40、160、640 (上下各推12組，組距應較大，初始4倍差),21,PPT學習交流, 求LD50正式試驗：在LD100與LD0之間設57個劑量組。 組距(對數) 或 式中：n-設計的劑量組數 （2）癥狀觀察 時間：24h或兩周內的反應,22,PPT學習交流,23,PPT學習交流,三、 LD50的計算與結果評價

12、計算方法：概率單位法和寇氏法。 LD50值愈小，毒性愈大。,24,PPT學習交流,25,PPT學習交流,26,PPT學習交流,概率單位法,27,PPT學習交流,28,PPT學習交流,存在正態(tài)曲線關系。 標準正態(tài)差d=(x-)/ 式中：x劑量對數； 劑量對數均數 標準差,29,PPT學習交流,d=0，左邊面積(死亡率)為50，右邊面積(存活率)50 d=1，死亡率為84.13， d=2，死亡率為97.73, d2，死亡率接近100。 d=一1，死亡率為15.87。 d=一2，死亡率為2.27。 d一3，死亡率接近0。,30,PPT學習交流,31,PPT學習交流,從上表，可以任一死亡率換算為相應的

13、概率單位。,32,PPT學習交流,A：劑量對數死亡百分率 B：劑量對數概率單位,33,PPT學習交流,34,PPT學習交流,LC50計算步驟如下： a.根據死亡率查概率單位(死亡率為100或0不計) b.繪圖求回歸方程。 c.求y=5的濃度對數（m），其反對數即為LC50,y=2.78x-2.76,同理可得LC5、 LC10、,35,PPT學習交流,d.求LC50的可信限 先求LC50的標準誤差(Sm)： S(校準差)=1/k 本例中：S=1/2.78,36,PPT學習交流,37,PPT學習交流,平均致死量法（又名寇氏法）,試驗要求： 每個試驗組動物數相同； 各組劑量按等比級數分組； 最大劑量

14、的死亡率最好為100或與之接近，最小劑量的死亡率最好為0或與之接近。,38,PPT學習交流,式中： Xm最大劑量的對數值； i相鄰劑量比值的對數； 各組死亡率的總和（以小數表示）。,39,PPT學習交流,例小鼠腹腔注射致百蟲急性毒性試驗結果如下表所示，求 LD50,40,PPT學習交流,式中： p一個組死亡率； q一個組存活率； i相鄰劑量比值的對數； h各組動物數。,41,PPT學習交流,42,PPT學習交流,第二節(jié) 亞慢性和慢性毒性試驗 一、蓄積試驗及其方法： （一）蓄積作用：某些物質以較小劑量反復作用于機體，可使機體對該物質的反應性增強，即一次染毒不引起明顯中毒反應或死亡的劑量，經分次重

15、復染毒后，可引起明顯中毒或死亡，此種現(xiàn)象稱為蓄積作用(accumulation)。 可分兩種： 物質蓄積：毒物在體內的排出量小于進入量，以致毒物在體內的貯留量增多為物質蓄積； 功能蓄積：毒物進入機體后，并未發(fā)現(xiàn)在體內明顯貯留，但可引起機體功能改變的逐漸累積，導致對該毒物的反應性增強。,43,PPT學習交流,耐受性(tolerance)：機體多次接觸化學物質后對該物質產生反應性減弱的現(xiàn)象，顯示不易發(fā)生慢性中毒。 （二）蓄積作用的測定方法 有多種，常用蓄積系數法。 蓄積系數(accumulation coefficient)K： ED50(n) 多次染毒使半數動物出現(xiàn)某種效應的總劑量; ED50(

16、1) 一次染毒引起同一效應半數效量。,44,PPT學習交流,若以死亡為毒效應指標，上式為 K越小，受試化合物的蓄積毒性越大。,45,PPT學習交流,1固定劑量法 ：固定每天染毒劑量為1/201/5 LD50，連續(xù)染毒，直至實驗動物半數死亡。如果染毒劑量累計已達5個LD50 動物死亡仍末達半數，實驗均可告結束，計算蓄積系數，作出評價。 2遞增劑量法 ：先測定LD50（1），然后對另一組動物每天染毒，以4天為一期，開始給予0.1LD50。以后每期按1.5倍遞增劑量，直至動物半數死亡，或實驗已達28天，可結束實驗，計算系數。 3. 二十天試驗法 ：選用大鼠或小鼠每個劑量組雌雄各10只，以1/2、l/

17、5、1/10、1/20 LD50分別對每組進行染毒，每日1次，共20天。如l/20LD50組動物有死亡，且有劑量反應關系，則有較強蓄積作用；如1/20 LD50組無死亡，則為弱蓄積。,蓄積系數的測定,46,PPT學習交流,二、亞慢性毒性作用及其試驗方法： 1、目的：確定化學物亞慢性毒性的閾劑量和NOEL。 2、試驗期限：3-6月； 呼吸道吸收：30-90天； 皮膚毒性：30天。 3、試驗動物的選擇、飼養(yǎng)環(huán)境及染毒途徑： 試驗動物選擇：對受試化學物敏感的物種或品系； 環(huán)境：營養(yǎng)合理，飲水清潔、充足、溫、光、濕適宜； 染毒途徑：盡量模擬人類在環(huán)境中接觸受試化學物的途徑，與急性毒性試驗相似。,47,

18、PPT學習交流,4、劑量選擇與分組 劑量：180I50LD50，對于在體內不產生蓄積作用而排泄又快的物質可適當加大劑量，反之則可減少劑量。 設34個實驗組和1個對照組。 實驗組要求：在實驗結束時 最低劑量組不產生可觀察到的毒性反應； 最高劑量組能引起明顯毒性反應，但不引起死亡； 中間劑量組產生輕微毒性反應。,48,PPT學習交流,5、癥狀觀察 一般性指標(非特異) 一般綜合性指標： 動物體重增長率、食物消耗率、活動能力等。 一般化驗性指標：主要指血和肝、腎功能的檢測。 (2)特異指標： 測定特異性反應。 更確切闡明該物質的閾劑量(濃度)及無作用劑量(濃度)。 (3) 病理組織學檢查： 實驗中死

19、亡動物的病理檢查及實驗結束時的尸檢。,49,PPT學習交流,三、慢性毒性作用及其試驗方法 1、目的：評價化學物在長期小劑量作用的條件下對機體產生的損害及其特點確定閾劑量和最大無作用劑量。 2、試驗方法： （1） 動物選擇、染毒方法、觀察指標等與亞慢性毒性試驗相似； （2）染毒期限：1-2年或終身染毒，也有人提出6月。 （3）劑量分組： 3個染毒組和一個對照組。 高劑量組：1/51/2亞慢性試驗閾值； 中間劑量：1/501/10； 低劑量組：1/100。,50,PPT學習交流,第四節(jié) 致突變實驗,一、目的 確定外源化學物對生物體是否具有致突變作用。 基因點突變試驗、染色體畸變試驗、DNA損傷試驗

20、。 二、供試生物： 微生物、動物細胞、昆蟲、動物或植物 三、試驗方法 體外基因突變試驗、細胞遺傳學試驗、體內基因突變試驗、DNA損傷試驗,51,PPT學習交流,（一）體外基因突變試驗,1、Ames試驗（鼠傷寒沙門氏菌/動物肝細胞微粒體試驗） （1）原理： 利用一種突變微生物菌株與被檢測化學物接觸，使突變型微生物回復突變，重新成為野生型微生物。,突變型微生物不具備合成組氨酸的能力，不能在不含（或低濃度）組氨酸培養(yǎng)基上生長。,52,PPT學習交流,（2）方法： 將突變型沙氏菌在不含（或低濃度）組氨酸培養(yǎng)基上培養(yǎng),以其生長狀況作為指標。 在培養(yǎng)基中加入哺乳動物的肝細胞微粒體：提高靈敏度。,53,PP

21、T學習交流,（3）特點： 優(yōu)點： 簡便、靈敏、快速（48h）、費用低； 檢測結果與對動物的致癌性的相符率達約90%。 缺點： 利用微生物作為供試物，不能全面反映哺乳動物的遺傳信息，僅1/6； 微生物的DNA修復系統(tǒng)與動物有差異； 微生物無免疫功能。,54,PPT學習交流,2、哺乳動物體細胞突變試驗 （1）方法原理與微生物突變類似。 常用的細胞株： 中國地鼠肺細胞V79 中國地鼠肺卵巢細胞(CHO） 小鼠淋巴瘤L5178Y細胞株。,55,PPT學習交流,V79、CHO細胞株 正常細胞：缺乏利用嘌呤堿的酶HGPRT，不能在加入類嘌呤堿類物質的培養(yǎng)基上生長； 突變細胞：可在加入類嘌呤堿類物質的培養(yǎng)基

22、上生長。 L5178Y突變細胞株 正常細胞：缺乏胸苷激酶（TK），不可在含有細胞毒物5-溴脫氧尿苷的培養(yǎng)基上生長。 突變細胞：可在此種培養(yǎng)基上生長。,56,PPT學習交流,（二）細胞遺傳學試驗,染色體畸變試驗： 直接在顯微鏡下觀察染色體結構和數目的改變情況。生殖細胞或體細胞、體外或體內試驗。 體外：CHO細胞: 分裂快、數目適中、形態(tài)清晰；人類外周血淋巴細胞 體內：受試動物骨髓細胞或其他（胸腺、脾、精原細胞）染色體畸變率的變化。,57,PPT學習交流,（1）試驗方法： a. 體外培養(yǎng)： CHO細胞或人類外周血淋巴細胞與化學物，在細胞培養(yǎng)液（DMEM, RPM, 1640或1999）中，370C

23、下培養(yǎng)24h(CHO)或72h(人類細胞）。觀察前2h加入秋水仙堿（中期分裂阻斷劑），制片，鏡檢觀察。 b. 體內染色體畸變分析：大鼠、小鼠，染毒飼養(yǎng)，觀察骨髓細胞染色體畸變情況。,58,PPT學習交流,第四節(jié) 環(huán)境流行病學方法 一、概念和特點： 流行病學：研究特定人群中有關健康的狀態(tài)和事件的分布以及影響這些分布的決定因素； 環(huán)境流行病學：應用流行病學的原理和方法，重點研究人們在生活和工作環(huán)境中各種因素與人群健康的關系。 一般流行病學研究的內容是疾病在人群中的分布，它要回答三個問題： (1)疾病在時間、地點、不同人群中是怎樣分布的? (2)什么因素是該病的主要決定因素? (3)怎樣控制該病的流

24、行?,59,PPT學習交流,環(huán)境流行病學除了上述一般內容，還有它本身的特點。 (1)它不僅研究疾病的分布規(guī)律，而且更經常地研究疾病前的狀態(tài)，即包括無異常健康)、微弱的功能改變、疾病的前期(亞臨床狀態(tài))等各種健康狀況，揭示環(huán)境污染或某些微量元素的健康效應。 (2)環(huán)境流行病學研究的暴露因素主要是理化因素。 已知暴露因素，研究其對健康的影響；環(huán)境毒理學工作者所進行的大量工作就屬于這種。例如金屬冶煉廠鉛污染大氣對居民健康影響，磷肥廠氟污染大氣對居民健康影響的調查等。 出現(xiàn)健康異常，追究引起異常的暴露因素，這屬于探討病因的研究。例如，近年來我國學者對于鼻咽癌、食道癌病因的研究，對克山病、大骨節(jié)病病因的研究，均屬于此種類型。日本的水誤病和痛痛病的病因是重金屬污染造成的公害病領域里的研究成果，影響深遠。 (3) 環(huán)境流行病學研究的最終日的是為消除污染、改造環(huán)境、保護居民健康服務。 (4)直接以人群為研究對象，研究結果最具有說服力。,60,PPT學習交流,二、環(huán)境流行病學研究的內容 環(huán)境流行病學主要研究兩方面的內容一是暴露，二是健康；同時還要研究二者的聯(lián)系。 (一) 暴露測量： 環(huán)境暴露水平是人群接觸的環(huán)境因素的平均水平，是通過對環(huán)境因子在環(huán)境中的時空分布的實測結果求出的平均值。