DNA探針.ppt

1、DNA探針,王艷慧,什么是DNA探針 DNA探針是利用同位素、生物素等標(biāo)記的特定DNA片斷, 該片斷可大至寄生蟲基因組DNA，小至20個堿基。,原理,當(dāng)DNA探針與待測的非標(biāo)記單鏈DNA（或RNA）按堿基順序互補結(jié)合時，以氫健將2條單鏈連接而形成標(biāo)記DNA-DNA（或標(biāo)記DNA-RNA）的雙鏈雜交分子。將未配對結(jié)合的核苷酸溶解后用檢測系統(tǒng)（放射自顯影或酶檢測等）檢測雜交反應(yīng)結(jié)果。,優(yōu)點,這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。 DNA探針不易降解（相對RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。 DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移法、隨機引物法、

2、PCR標(biāo)記法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。,雙鏈DNA探針的合成方法,切口平移法 隨機引物合成法,切口平移法,當(dāng)雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時,E.coli DNA聚合酶就可將核苷酸連接到切口的3羥基末端。同時該酶具有從53的核酸外切酶活性,能從切口的5端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3端補上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動,用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素摻入到合成新鏈中。最合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。,切口平移反應(yīng)受幾種因素的影響,(a) 產(chǎn)物的比活性取決于-32 PdNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。 (b)DNA酶的

3、用量和E.coli DNA聚合酶的質(zhì)量會影響產(chǎn)物片段的大小。 (c) DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性, 故應(yīng)使用仔細純化后的DNA。,注意,1、3H，32P及35S標(biāo)記的dNTP都可使用于探針標(biāo)記，但通常使用-32 P-dNTP。 2、DNA酶的活性不同，所得到的探針比活性也不同，DNA酶活性高，則所得探針比活性高，但長度比較短。,隨機引物合成法,隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結(jié)合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探針。合成產(chǎn)物的大小、產(chǎn)量、比活性依賴于反應(yīng)中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,產(chǎn)物平均長度為400-600個核苷酸。,利用隨機引物進行反應(yīng)的優(yōu)點

4、是：,(1)Klenow片段沒有53外切酶活性,反應(yīng)穩(wěn)定,可以獲得大量的有效探針。 (2)反應(yīng)時對模板的要求不嚴格,用微量制備的質(zhì)粒DNA模板也可進行反應(yīng)。 (3)反應(yīng)產(chǎn)物的比活性較高,可達4109 cpm/g探針。 (4)隨機引物反應(yīng)還可以在低熔點瓊脂糖中直接進行。,注意,1、引物與模板的比例應(yīng)仔細調(diào)整，當(dāng)引物高于模板時，反應(yīng)產(chǎn)物比較短，但產(chǎn)物的累積較多；反之，則可獲得較長片段的探針. 2、模板DNA應(yīng)是線性的，如為超螺旋DNA，則標(biāo)記效率不足50%。,單鏈DNA探針的合成方法,以M13載體衍生序列為模板,用Klenow片段合成單鏈探針; 以RNA為模板, 用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA探針,末

5、端標(biāo)記DNA探針,(1)25l反應(yīng)體系中用合適的限制酶酶切1g的DNA。 (2)按下列成分加入試劑并混勻： 已酶切的DNA 1mg (25ml) 10末端標(biāo)記緩沖液 5ml 2mmol/L 3種dNTP 1ml a-32P-dNTP 適量 加水至 50ml (3)加入1單位的Klenow片段,室溫下反應(yīng)30分鐘。 (4)加入1ml 2mmol/L 第四種核苷酸溶液, 室溫保溫15分鐘。 (5)70加熱5分鐘,終止反應(yīng)。 (6)用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀來分離標(biāo)記的DNA,或用Sephdadex G-50柱層析分離標(biāo)記的DNA。,注意事項,1、利用本方法可對DNA分子量標(biāo)準進行標(biāo)記，利用它可定

6、位因片段太小而無法在凝膠中觀察的DNA片段。2、對DNA的純度不很嚴格，少量制備的質(zhì)粒也可進行末端標(biāo)記合成探針。 3、末端標(biāo)記還有其他的一些方法，如利用T4多核苷酸激酶標(biāo)記脫磷的5端突出的DNA和平末端凹缺DNA分子，也可利用該酶進行交換反應(yīng)標(biāo)記5末端。,DNA親子鑒定,DNA是從幾滴血, 腮細胞或培養(yǎng)的組織纖內(nèi)提取而來。用疇素將DNA樣本切成小段, 放進喱膠內(nèi), 用電泳槽推動DNA小塊使之分離最細的在最遠, 最大的最近。之后, 分離開的基因放在尼龍薄膜上, 使用特別的DNA探針去尋找基因, 相同的基因會凝聚于一, 然后,利用特別的染料,在X光的環(huán)境下, 便顯示由DNA探針凝聚于一的黑色條碼。小孩這種肉眼可見的條碼很特別