




版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、DNA探針,王艷慧,什么是DNA探針 DNA探針是利用同位素、生物素等標(biāo)記的特定DNA片斷, 該片斷可大至寄生蟲基因組DNA,小至20個(gè)堿基。,原理,當(dāng)DNA探針與待測(cè)的非標(biāo)記單鏈DNA(或RNA)按堿基順序互補(bǔ)結(jié)合時(shí),以氫健將2條單鏈連接而形成標(biāo)記DNA-DNA(或標(biāo)記DNA-RNA)的雙鏈雜交分子。將未配對(duì)結(jié)合的核苷酸溶解后用檢測(cè)系統(tǒng)(放射自顯影或酶檢測(cè)等)檢測(cè)雜交反應(yīng)結(jié)果。,優(yōu)點(diǎn),這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中,可以無限繁殖,取之不盡,制備方法簡(jiǎn)便。 DNA探針不易降解(相對(duì)RNA而言),一般能有效抑制DNA酶活性。 DNA探針的標(biāo)記方法較成熟,有多種方法可供選擇,如缺口平移法、隨機(jī)引物法、
2、PCR標(biāo)記法等,能用于同位素和非同位素標(biāo)記。,雙鏈DNA探針的合成方法,切口平移法 隨機(jī)引物合成法,切口平移法,當(dāng)雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時(shí),E.coli DNA聚合酶就可將核苷酸連接到切口的3羥基末端。同時(shí)該酶具有從53的核酸外切酶活性,能從切口的5端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時(shí)又在切口的3端補(bǔ)上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動(dòng),用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸,將放射性同位素?fù)饺氲胶铣尚骆溨?。最合適的切口平移片段一般為50-500個(gè)核苷酸。,切口平移反應(yīng)受幾種因素的影響,(a) 產(chǎn)物的比活性取決于-32 PdNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。 (b)DNA酶的
3、用量和E.coli DNA聚合酶的質(zhì)量會(huì)影響產(chǎn)物片段的大小。 (c) DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會(huì)抑制酶的活性, 故應(yīng)使用仔細(xì)純化后的DNA。,注意,1、3H,32P及35S標(biāo)記的dNTP都可使用于探針標(biāo)記,但通常使用-32 P-dNTP。 2、DNA酶的活性不同,所得到的探針比活性也不同,DNA酶活性高,則所得探針比活性高,但長(zhǎng)度比較短。,隨機(jī)引物合成法,隨機(jī)引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結(jié)合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探針。合成產(chǎn)物的大小、產(chǎn)量、比活性依賴于反應(yīng)中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,產(chǎn)物平均長(zhǎng)度為400-600個(gè)核苷酸。,利用隨機(jī)引物進(jìn)行反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)
4、是:,(1)Klenow片段沒有53外切酶活性,反應(yīng)穩(wěn)定,可以獲得大量的有效探針。 (2)反應(yīng)時(shí)對(duì)模板的要求不嚴(yán)格,用微量制備的質(zhì)粒DNA模板也可進(jìn)行反應(yīng)。 (3)反應(yīng)產(chǎn)物的比活性較高,可達(dá)4109 cpm/g探針。 (4)隨機(jī)引物反應(yīng)還可以在低熔點(diǎn)瓊脂糖中直接進(jìn)行。,注意,1、引物與模板的比例應(yīng)仔細(xì)調(diào)整,當(dāng)引物高于模板時(shí),反應(yīng)產(chǎn)物比較短,但產(chǎn)物的累積較多;反之,則可獲得較長(zhǎng)片段的探針. 2、模板DNA應(yīng)是線性的,如為超螺旋DNA,則標(biāo)記效率不足50%。,單鏈DNA探針的合成方法,以M13載體衍生序列為模板,用Klenow片段合成單鏈探針; 以RNA為模板, 用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA探針,末
5、端標(biāo)記DNA探針,(1)25l反應(yīng)體系中用合適的限制酶酶切1g的DNA。 (2)按下列成分加入試劑并混勻: 已酶切的DNA 1mg (25ml) 10末端標(biāo)記緩沖液 5ml 2mmol/L 3種dNTP 1ml a-32P-dNTP 適量 加水至 50ml (3)加入1單位的Klenow片段,室溫下反應(yīng)30分鐘。 (4)加入1ml 2mmol/L 第四種核苷酸溶液, 室溫保溫15分鐘。 (5)70加熱5分鐘,終止反應(yīng)。 (6)用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀來分離標(biāo)記的DNA,或用Sephdadex G-50柱層析分離標(biāo)記的DNA。,注意事項(xiàng),1、利用本方法可對(duì)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)記,利用它可定
6、位因片段太小而無法在凝膠中觀察的DNA片段。2、對(duì)DNA的純度不很嚴(yán)格,少量制備的質(zhì)粒也可進(jìn)行末端標(biāo)記合成探針。 3、末端標(biāo)記還有其他的一些方法,如利用T4多核苷酸激酶標(biāo)記脫磷的5端突出的DNA和平末端凹缺DNA分子,也可利用該酶進(jìn)行交換反應(yīng)標(biāo)記5末端。,DNA親子鑒定,DNA是從幾滴血, 腮細(xì)胞或培養(yǎng)的組織纖內(nèi)提取而來。用疇素將DNA樣本切成小段, 放進(jìn)喱膠內(nèi), 用電泳槽推動(dòng)DNA小塊使之分離最細(xì)的在最遠(yuǎn), 最大的最近。之后, 分離開的基因放在尼龍薄膜上, 使用特別的DNA探針去尋找基因, 相同的基因會(huì)凝聚于一, 然后,利用特別的染料,在X光的環(huán)境下, 便顯示由DNA探針凝聚于一的黑色條碼。小孩這種肉眼可見的條碼很特別
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 網(wǎng)絡(luò)事故應(yīng)急預(yù)案
- 安全生產(chǎn)違規(guī)行為
- 安全生產(chǎn)十項(xiàng)硬措施
- 湖北省安全生產(chǎn)責(zé)任制清單
- 鐵路工程施工安全保證措施
- 2025屆昌都市高一物理第二學(xué)期期末經(jīng)典試題含解析
- 施工安全管控措施報(bào)審表
- 企業(yè)安全生產(chǎn)管理職責(zé)(完整版)
- 生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)單位安全生產(chǎn)主體責(zé)任有哪些
- 消防安全隱患知識(shí)
- 學(xué)霸提優(yōu)第四單元《我們講文明》重難點(diǎn)梳理 課件
- 安徽青碩建設(shè)有限公司招聘筆試真題2024
- 公司適用法律法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)清單2025年08月更新
- 火龍罐綜合灸技術(shù)課件
- 退役軍人事務(wù)系統(tǒng)公考綜合基礎(chǔ)知識(shí)考試能力測(cè)試(含答案)
- LS/T 3244-2015全麥粉
- GB/T 6414-2017鑄件尺寸公差、幾何公差與機(jī)械加工余量
- GB/T 20957.4-2007精密加工中心檢驗(yàn)條件第4部分:線性和回轉(zhuǎn)軸線的定位精度和重復(fù)定位精度檢驗(yàn)
- 電纜橋架施工圖集
- 信念的力量課件
- 接力初三贏在暑假-八年級(jí)下學(xué)期期末家長(zhǎng)會(huì)課件
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論