質(zhì)粒DNA的抽提、純化與檢測(cè)

1、YL-1,分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（綜合性）,質(zhì)粒DNA的抽提、酶切及電泳鑒定,常規(guī)PCR技術(shù),感受態(tài)細(xì)胞的制備及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化,真核細(xì)胞基因組DNA的分離、純化與檢測(cè),YL-2,質(zhì)粒DNA的抽提、酶切及 電泳鑒定,實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)安排,上午：質(zhì)粒DNA 的提取與純化,中午：質(zhì)粒DNA 的酶切 下午：電泳鑒定,質(zhì)粒(plasmid)：是細(xì)菌、酵母菌和放線(xiàn)菌中自然存在的獨(dú)立于染色體外、具有復(fù)制能力的小分子共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA。 現(xiàn)在常用的質(zhì)粒大多數(shù)是經(jīng)過(guò)改造或人工構(gòu)建的，常含抗生素抗性基因。 是重組DNA技術(shù)中重要的載體。,質(zhì)粒,作為載體的質(zhì)粒： 多克隆位點(diǎn) 選擇標(biāo)記 容納較大的外源DNA,質(zhì)粒的特性： 相對(duì)

2、獨(dú)立性 獨(dú)立的復(fù)制單位 賦予宿主細(xì)胞一些表型 與宿主菌染色體DNA不同,質(zhì)粒,提取質(zhì)粒DNA的目的與意義,基因載體/基因克隆/基因工程： 在基因工程中，常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。人工構(gòu)建的質(zhì)?？梢约喾N有用的特征于一體，如含多種單一酶切位點(diǎn)、抗生素耐藥性等。,如何獲得批量的純化質(zhì)粒DNA分子？,（一）載體的制備 ： 質(zhì)粒DNA的提取與純化,提取方法概述,堿裂解法分離純化質(zhì)粒DNA,基本原理：利用質(zhì)粒DNA與染色質(zhì)DNA變性與復(fù)性的 差異。,當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性；當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速?gòu)?fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DN

3、A不復(fù)性而呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來(lái)。,原理示意圖,溶液： 50mmol/L葡萄糖, （pH8.0 ） 10mmol/L EDTA ， 25mmol/L Tris-HCl 溶液： 0.2mmol/L NaOH, 1% SDS 溶液： pH4.8, K+=3mol/L, （pH4.8 ） Ac-=5mol/L,重要試劑,堿裂解法提取質(zhì)粒的流程,離心收集菌體,溶液III中和,溶液I充分重懸,溶液II裂解,上清液,抽提,離心洗滌,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,質(zhì)粒DNA溶液,1. 取1mL菌液于1.5mL離心管中，10000rpm離心1min，棄上清。 2. 將細(xì)菌沉淀懸浮于100L冰預(yù)冷的 溶液I 中，

4、振蕩混勻。 3. 加200L新鮮配制的溶液II，蓋緊管蓋，上下輕柔顛倒離心管混勻5次（勿強(qiáng)烈振蕩），冰上放置2min。 4. 加入150L預(yù)冷的溶液III，將管輕柔上下顛倒數(shù)次（6-8次）混勻，見(jiàn)白色絮狀沉淀，冰上放置3min。,堿裂解法提取質(zhì)粒操作步驟,步驟1中可用移液槍將殘留液體吸取，勿吸到沉淀。 步驟2中應(yīng)充分懸浮，使細(xì)胞分散混勻。 步驟3、4中切記動(dòng)作輕柔，應(yīng)緩慢上下顛倒離心管混 勻 ，勿強(qiáng)烈振蕩，否則質(zhì)粒容易斷裂。,菌液：E coli JM109菌株(含pUC19-X基因重組質(zhì)粒),5. 12000rpm離心5min，小心吸取上清至干凈的1.5mL離心管中。 6. 加等體積（約450

5、L）酚:氯仿，混勻，12000rpm離心5min，取上清移至另一1.5mL離心管中。 7. 加1mL冰預(yù)冷無(wú)水乙醇，上下顛倒混勻幾次，室溫放置10min；12000rpm離心5min，棄上清。 8. 加1mL冰預(yù)冷70%乙醇漂洗沉淀，12000rpm離心5min。 9. 棄上清，室溫放置5-10min，晾干沉淀。 10. 加20L含RNase（無(wú)DNase）的TE溶解DNA，37水浴消化 15-30min以去除RNA。,堿裂解法提取質(zhì)粒操作步驟,步驟5、6中吸取上清液時(shí)應(yīng)避免將交界面的蛋白、染 色體DNA也吸走。 不要讓質(zhì)粒完全干燥，否則將難以溶解。,下一步實(shí)驗(yàn)用,提取質(zhì)粒后分裝,每人最終得到

6、20L質(zhì)粒DNA，其中10L用于酶切， 5L用于電泳，其余5L用于下次的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，切記！,實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng),移液槍的正確使用 標(biāo)記好自己的離心管 加不同溶液要換槍頭 轉(zhuǎn)移上清時(shí)不要吸到沉淀 使用酚:氯仿注意安全 離心機(jī)的使用：嚴(yán)格平衡,注意,（二）質(zhì)粒DNA的酶切及 電泳鑒定,識(shí)別特異的DNA序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈DNA的一類(lèi)內(nèi)切酶。 常用限制性?xún)?nèi)切核酸酶有高度特異的堿基識(shí)別序列和切割點(diǎn)。 例如 EcoR的切割位點(diǎn)： G A A T T C C T T A A G Hind 的切割位點(diǎn)： AA G C T T T T C G AA ,限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endon

7、uclease）,本實(shí)驗(yàn)所提取的質(zhì)粒為重組質(zhì)粒，含有插入的目的片段。如果用EcoR和Hind 同時(shí)切割重組質(zhì)粒（含兩個(gè)單一酶切位點(diǎn)），就產(chǎn)生兩條帶相應(yīng)酶切位點(diǎn)的線(xiàn)性DNA分子。,使用限制性?xún)?nèi)酶切的原則,限制酶的熱不穩(wěn)定性，選擇合適的條件； 避免反復(fù)凍融，保持低溫（冰?。┫逻M(jìn)行； 酶的用量可參照酶單位的定義確定； 兩種以上的酶切割DNA時(shí)應(yīng)選擇合適的緩沖液； 酶切反應(yīng)必須使用無(wú)菌離心管及吸頭號(hào)，避免交叉污染。,質(zhì)粒DNA 10L 10M Buffer 2L EcoR 1L Hind 1L ddH2O 6L,21,合計(jì) 20L,準(zhǔn)備室老師已將其配成2限制性酶反應(yīng)混合液,雙酶切體系的建立,重組質(zhì)粒的

8、酶切反應(yīng),2限制性酶反應(yīng)液包含：10酶反應(yīng)緩沖液、EcoR I、Hind III,核酸電泳,核酸分子是兩性解離分子，在pH8.0pH8.5時(shí)，磷酸全部解離，使得核酸分子帶負(fù)電荷，向電場(chǎng)正極移動(dòng)。,具有不同的相對(duì)分子 質(zhì)量的DNA片段在凝膠中泳動(dòng)速度不一樣，因而可依據(jù)DNA分子的大小或構(gòu)型來(lái)使其分離。,質(zhì)粒的三種構(gòu)型,電泳時(shí)，三者泳動(dòng)速度大小關(guān)系（？）,最快,中,最慢,重組質(zhì)粒雙酶切電泳,DNA 標(biāo)準(zhǔn)（Marker） 是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA 分子凝膠電泳時(shí)，加樣用做對(duì)比來(lái)檢測(cè)瓊脂糖凝膠是否有問(wèn)題以及估算條帶的大小。,質(zhì)粒DNA電泳步驟,制膠 取酶切后的質(zhì)粒DNA溶液20 L

9、 、酶切對(duì)照的質(zhì)粒DNA溶液20L，各加5上樣緩沖液5 L ，混勻后，用移液槍慢慢將混合物加至樣品孔中；另加入 5 L DNA Marker至另一樣品孔中。 電壓120V，電泳約40min-1h。,點(diǎn)樣：,開(kāi)環(huán)構(gòu)型 線(xiàn)性構(gòu)型 超螺旋構(gòu)型（希望得到最多）,預(yù)期電泳結(jié)果,酶切后,提取的質(zhì)粒,2.5Kb,0.9Kb,小結(jié),1質(zhì)粒的提?。簤A裂解法分離純化質(zhì)粒DNA，利用質(zhì)粒 DNA與染色質(zhì)DNA變性與復(fù)性的差異。 2質(zhì)粒的酶切：限制性核酸內(nèi)切酶可以識(shí)別特異 的DNA序 列，并切割雙鏈DNA。本實(shí)驗(yàn)中EcoR I、Hind III將3.4 Kb的質(zhì)粒雙酶切為2.5 Kb和0.9Kb的兩個(gè)片段。 3電泳分析：利用不同的分子量的DNA片段在瓊脂糖凝膠 中泳動(dòng)速度不一樣使其分離