質粒DNA的抽提、純化與檢測

1、YL-1,分子生物學實驗（綜合性）,質粒DNA的抽提、酶切及電泳鑒定,常規(guī)PCR技術,感受態(tài)細胞的制備及重組質粒的轉化,真核細胞基因組DNA的分離、純化與檢測,YL-2,質粒DNA的抽提、酶切及 電泳鑒定,實驗,實驗安排,上午：質粒DNA 的提取與純化,中午：質粒DNA 的酶切 下午：電泳鑒定,質粒(plasmid)：是細菌、酵母菌和放線菌中自然存在的獨立于染色體外、具有復制能力的小分子共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA。 現(xiàn)在常用的質粒大多數(shù)是經過改造或人工構建的，常含抗生素抗性基因。 是重組DNA技術中重要的載體。,質粒,作為載體的質粒： 多克隆位點 選擇標記 容納較大的外源DNA,質粒的特性： 相對

2、獨立性 獨立的復制單位 賦予宿主細胞一些表型 與宿主菌染色體DNA不同,質粒,提取質粒DNA的目的與意義,基因載體/基因克隆/基因工程： 在基因工程中，常用人工構建的質粒作為載體。人工構建的質?？梢约喾N有用的特征于一體，如含多種單一酶切位點、抗生素耐藥性等。,如何獲得批量的純化質粒DNA分子？,（一）載體的制備 ： 質粒DNA的提取與純化,提取方法概述,堿裂解法分離純化質粒DNA,基本原理：利用質粒DNA與染色質DNA變性與復性的 差異。,當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質與DNA發(fā)生變性；當加入中和液后，質粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中；蛋白質與染色體DN

3、A不復性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。,原理示意圖,溶液： 50mmol/L葡萄糖, （pH8.0 ） 10mmol/L EDTA ， 25mmol/L Tris-HCl 溶液： 0.2mmol/L NaOH, 1% SDS 溶液： pH4.8, K+=3mol/L, （pH4.8 ） Ac-=5mol/L,重要試劑,堿裂解法提取質粒的流程,離心收集菌體,溶液III中和,溶液I充分重懸,溶液II裂解,上清液,抽提,離心洗滌,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,質粒DNA溶液,1. 取1mL菌液于1.5mL離心管中，10000rpm離心1min，棄上清。 2. 將細菌沉淀懸浮于100L冰預冷的 溶液I 中，

4、振蕩混勻。 3. 加200L新鮮配制的溶液II，蓋緊管蓋，上下輕柔顛倒離心管混勻5次（勿強烈振蕩），冰上放置2min。 4. 加入150L預冷的溶液III，將管輕柔上下顛倒數(shù)次（6-8次）混勻，見白色絮狀沉淀，冰上放置3min。,堿裂解法提取質粒操作步驟,步驟1中可用移液槍將殘留液體吸取，勿吸到沉淀。 步驟2中應充分懸浮，使細胞分散混勻。 步驟3、4中切記動作輕柔，應緩慢上下顛倒離心管混 勻 ，勿強烈振蕩，否則質粒容易斷裂。,菌液：E coli JM109菌株(含pUC19-X基因重組質粒),5. 12000rpm離心5min，小心吸取上清至干凈的1.5mL離心管中。 6. 加等體積（約450

5、L）酚:氯仿，混勻，12000rpm離心5min，取上清移至另一1.5mL離心管中。 7. 加1mL冰預冷無水乙醇，上下顛倒混勻幾次，室溫放置10min；12000rpm離心5min，棄上清。 8. 加1mL冰預冷70%乙醇漂洗沉淀，12000rpm離心5min。 9. 棄上清，室溫放置5-10min，晾干沉淀。 10. 加20L含RNase（無DNase）的TE溶解DNA，37水浴消化 15-30min以去除RNA。,堿裂解法提取質粒操作步驟,步驟5、6中吸取上清液時應避免將交界面的蛋白、染 色體DNA也吸走。 不要讓質粒完全干燥，否則將難以溶解。,下一步實驗用,提取質粒后分裝,每人最終得到

6、20L質粒DNA，其中10L用于酶切， 5L用于電泳，其余5L用于下次的轉化實驗，切記！,實驗注意事項,移液槍的正確使用 標記好自己的離心管 加不同溶液要換槍頭 轉移上清時不要吸到沉淀 使用酚:氯仿注意安全 離心機的使用：嚴格平衡,注意,（二）質粒DNA的酶切及 電泳鑒定,識別特異的DNA序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。 常用限制性內切核酸酶有高度特異的堿基識別序列和切割點。 例如 EcoR的切割位點： G A A T T C C T T A A G Hind 的切割位點： AA G C T T T T C G AA ,限制性核酸內切酶（restriction endon

7、uclease）,本實驗所提取的質粒為重組質粒，含有插入的目的片段。如果用EcoR和Hind 同時切割重組質粒（含兩個單一酶切位點），就產生兩條帶相應酶切位點的線性DNA分子。,使用限制性內酶切的原則,限制酶的熱不穩(wěn)定性，選擇合適的條件； 避免反復凍融，保持低溫（冰?。┫逻M行； 酶的用量可參照酶單位的定義確定； 兩種以上的酶切割DNA時應選擇合適的緩沖液； 酶切反應必須使用無菌離心管及吸頭號，避免交叉污染。,質粒DNA 10L 10M Buffer 2L EcoR 1L Hind 1L ddH2O 6L,21,合計 20L,準備室老師已將其配成2限制性酶反應混合液,雙酶切體系的建立,重組質粒的

8、酶切反應,2限制性酶反應液包含：10酶反應緩沖液、EcoR I、Hind III,核酸電泳,核酸分子是兩性解離分子，在pH8.0pH8.5時，磷酸全部解離，使得核酸分子帶負電荷，向電場正極移動。,具有不同的相對分子 質量的DNA片段在凝膠中泳動速度不一樣，因而可依據DNA分子的大小或構型來使其分離。,質粒的三種構型,電泳時，三者泳動速度大小關系（？）,最快,中,最慢,重組質粒雙酶切電泳,DNA 標準（Marker） 是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA 分子凝膠電泳時，加樣用做對比來檢測瓊脂糖凝膠是否有問題以及估算條帶的大小。,質粒DNA電泳步驟,制膠 取酶切后的質粒DNA溶液20 L

9、 、酶切對照的質粒DNA溶液20L，各加5上樣緩沖液5 L ，混勻后，用移液槍慢慢將混合物加至樣品孔中；另加入 5 L DNA Marker至另一樣品孔中。 電壓120V，電泳約40min-1h。,點樣：,開環(huán)構型 線性構型 超螺旋構型（希望得到最多）,預期電泳結果,酶切后,提取的質粒,2.5Kb,0.9Kb,小結,1質粒的提?。簤A裂解法分離純化質粒DNA，利用質粒 DNA與染色質DNA變性與復性的差異。 2質粒的酶切：限制性核酸內切酶可以識別特異 的DNA序 列，并切割雙鏈DNA。本實驗中EcoR I、Hind III將3.4 Kb的質粒雙酶切為2.5 Kb和0.9Kb的兩個片段。 3電泳分析：利用不同的分子量的DNA片段在瓊脂糖凝膠 中泳動速度不一樣使其分離