造血干細胞的研究及應用.ppt

1、造血干細胞的研究與應用,一：造血干/祖細胞的研究 1.造血活動與造血假設 2.造血干細胞與造血祖細胞 3.造血干/祖細胞的性能測試 4.造血干/祖細胞的分離純化 5.造血祖細胞的體外擴增與定向誘導分化 二.造血干祖細胞的應用與前景,內容,造血活動,血細胞的生成 在胎兒，血細胞的生成開始于卵黃囊（02月），之后，在肝臟和脾臟（27月），骨髓（59月）為造血的主要場所。出生后，骨髓成為終身造血的大本營。,血細胞類型與壽命 類型 1.淋巴系細胞： B淋巴細胞,T淋巴細胞 2.髓系細胞: 單核/巨噬細胞，粒細胞，巨核細胞，紅細胞 3.血小板 壽命 人類紅細胞120d,中性粒細胞36 h,血小板9.6d

2、,造血假設,以上事實都支持了這樣的假設：在造血細胞中存在著一類原始的造血干細胞，它們能自我更新，并向各系細胞分化，從而維持機體正常的造血功能，使人體有恒定的血細胞數量。,一 造血干細胞（HSC）,概念的提出： 1. 20世紀50年代，Lorentz等的骨髓移植實驗成功，表明在造血細胞中存在一類原始的造血細胞即造血干細胞。,2. 1961年，Till和McCulloch發(fā)現(xiàn)將正常小鼠的骨髓細胞輸注給受致死劑量X線照射小鼠，經911天后，受者小鼠脾臟表面生成了肉眼可見的由骨髓紅系細胞，粒系細胞，巨核系細胞或三者混合組成的脾集落，又稱脾結節(jié)。每一個脾集落稱為一個脾集落生成單位（CFU-S)。,應用染

3、色體C帶顯色和單個脾集落移植技術證明，每個脾集落中的細胞都是起源于單一細胞，通過它的增殖和分化而形成集落。這類生成脾集落的原始細胞稱為脾集落生成細胞，它具備了多能造血干細胞或淋巴系-髓系干細胞的基本特性。 脾集落生成細胞是一類最早被認識的造血干細胞，也是目前惟一能被測試的一類造血干細胞。然而，各個脾集落生成細胞的功能又是不均一的。,造血干細胞（HSC）與造血祖細胞（HPC）,HSC 主要區(qū)別：高度的自我更新和維持能力 不能擴增 在體內長期或永久地重建造血，永不消亡,HPC 高度擴增能力 部分早期HPC和全部的晚期HPC喪失自我更新和自我維持能力 分化到終末必然調亡,關系： HSC,HSC 所有

4、特征不變 HPC 邊增殖邊分化來維持成熟血細胞的數量,造血干/ 祖細胞的性能測試,造血干細胞性能測試 1.經典方法-脾集落測試法 2.HSC的自我更新和造血重建能力的測試 3.HSC的無限增殖和多向分化能力的測試 造血祖細胞性能測試,Till和McCulloch于1961年建立的脾集落技術到目前為止只能應用于小鼠等嚙齒類動物，諸如兔，犬和人等均不能用這一方法檢測。只能通過測定造血祖細胞的數量來相對說明造血干細胞的數量，至于性能則更難說明。 一般利用一些具有細胞遺傳標志的HSC來生成脾集落，根據脾集落遺傳標志的情況來研究造血干細胞的性能，主要有兩種細胞遺傳標志： 1.輻射誘發(fā)的畸變染色體：可能對

5、細胞的正常增殖與分化有影響，因此很難評估造血干細胞的性能。 2.吳祖澤等利用天然性染色體作為細胞遺傳標志,1.經典方法-脾集落測試法,2.HSC的自我更新和造血重建能力的測試,早期，根據存在于骨髓，脾臟及肝臟等造血組織和器官中，以及的形態(tài)類似于淋巴細胞等特點，通過分離單個核細胞，以此群體細胞的特性研究來推測的性能。 人類移植技術的成功，無疑是對人類HSC具有自我更新能力和長期造血重建能力的最有力證明。 隨著現(xiàn)代化技術手段的迅猛發(fā)展，實驗動物學的發(fā)展為HSC的研究提供了很好的模型，為性能研究提供了更為直接的證據。,動物體內實驗驗證,1.HSC 羊胎內移植 2.重癥聯(lián)合免疫缺陷癥(SCID) 或人

6、免疫缺陷（HID）小鼠體內移植 3. SCID-Hu Thymus 動物模型體內移植 4.SCID-Hu Bone動物模型體內移植,4.SCID-Hu Bone動物模型體內移植 （1）先將一小段人胎肱骨埋于 SCID小鼠皮下，約8周后移植物的血管已基本長好。 （2）小鼠經射線全身照射后，把HLA不相符合的人類HSC待測樣品立即注射到移植物的骨髓腔內。 （3）再過8周，取出移植物，一部分樣品用作檢測骨髓腔內細胞中的人類HSC和HPC，另一部分樣品再一次注入第二個受射線照射的帶有人肱骨移植物的SCID-HU Bone 動物模型體內。 （4）再過8周，檢測第2次移植物內是否有人類HSC，早期HPC，

7、髓系祖細胞，B細胞祖細胞及其前體細胞，便可證明注入第1個胎骨移植物的原始樣品是否含有高度自我更新能力的人類造血干細胞。,3.HSC的無限增殖和多向分化能力的測試,早期研究還是以脾集落入手。1984年，吳祖澤等以天然性染色體作為標志物，研究了小鼠骨髓中HSC的增殖與分化特性。具體過程如下： （1）取與受體小鼠性別相反的正常小鼠骨髓的有核細胞輸入到經致死劑量射線照射的受者小鼠，第13天后，受者小鼠生成脾集落。 （2）之后將取自一個脾集落的細胞輸入到經致死劑量射線照射的，與第一受者小鼠性別相同的第二受者小鼠體內，經過78周后，測試第二受者小鼠脾，淋巴結的T 細胞，B細胞,骨髓中的細胞及脾集落的雄，雌

8、核型分布，并將其骨髓細胞輸注到經致死劑量照射的，與第一，二受者小鼠性別相同的第三受者 （3）經8周后再測試第三只受者小鼠脾，淋巴結的T細胞，B細胞，骨髓中的細胞及脾集落的雌，雄核型分析。,結果表明： 1.通過最初一個脾集落生成細胞在第一受者小鼠脾臟內生成的一個脾集落，在第二，三受者小鼠中不斷增殖，脾集落生成細胞在數量上以指數形式不斷增加。每一個脾集落都是單一細胞增殖和分化的結果。 2.脾集落生成細胞不僅在經射線照射的受者小鼠內具有重建髓細胞的能力，同時，也具有重建淋巴組織中T細胞，B細胞的能力。,隨著各種實驗技術手段的不斷發(fā)展 裴雪濤等利用FACS自動細胞分選系統(tǒng)分選出單個CD34+細胞亞群細

9、胞CD34+CD38+及CD34+CD38-，在96孔板無血清體系中加入各種細胞因子（如SCF,IL,GM-CSF,G-CSF及EPO）刺激，進行培養(yǎng)。 結果表明: CD34+CD38-單個細胞可形成原代集落，并可向紅系，粒系，巨噬系，巨核系等細胞分化。并證明了它的性能接近于造血干細胞，同時也證明了HSC具有多向分化的能力。,造血祖細胞性能測試,起始于1965年Pluznik和Sachs建立的小鼠骨髓細胞體外瓊脂培養(yǎng)技術。即在CSF 的作用下，造血細胞可在瓊脂上形成集落，每一個集落稱為一個集落生成單位。（CFU）. 造血細胞在體外培養(yǎng)時，在不同刺激因子的作用下，可形成人們可以辨認的各系細胞。生

10、成各系集落的細胞被稱為各系的祖細胞，或各系的集落生成細胞（CFC）,如粒系-巨噬系祖細胞或稱粒細胞-巨噬細胞集落生成細胞（CFC-GM）。,培養(yǎng)體系如下：有核細胞+培養(yǎng)液 3.9ml 馬血清 2.5ml GM-CSF 0.8ml(2U) 5%瓊脂 0.4ml,人們可以根據各系祖細胞的體外培養(yǎng)，對其性能加以研究。近年來HSC/HPC表面標志（即CD抗原）研究的發(fā)展大大促進他們的分離，純化，鑒定及性能等研究。CD34抗原表達一直持續(xù)到晚期HPC。用CD33,CD38,HLA-DR及系特異性單克隆抗體（Lin）可進一步精選HSC和HPC。,近年來，對造血干細胞的深入研究表明，HSC除了具有自我更新和

11、多向分化的基本特性外，還具有以下特點: 1.絕大多數干細胞處于Go期 2.高度表達CD34和CDw90抗原 3.缺乏 CD33，CD71等系相關抗原 4.具有 HLA,CD45RA高相對分子質量形式 5.低表達或不表達HLA-DR 6.羅丹明123 低吸收率,Rh123可選擇性的結合在各種活細胞的線粒體上，增殖的細胞都含有更多更大更活躍的線粒體，故可吸收RH123，顯示明亮的熒光,目前認為，高增殖潛能集落生成細胞（HPP-CFC）和長期培養(yǎng)啟動細胞（LTC-IC）為早期的造血祖細胞。 HPP-CFC的性能： 研究表明：可以在體外形成較大的集落，自我更新能力比 CFU-Mix 更強，細胞多處于靜

12、止狀態(tài)，很少進入增殖周期，對細胞周期S期毒劑有耐受性。在較晚時期形成集落的細胞則為更為早期的細胞。 有如下特性： 1.具有體內外抗細胞毒藥物5-Fu的作用 2.可重建受致死劑量射線照射小鼠的骨髓造血 3.具有向巨噬系，紅系，粒系以及巨核系等多向分化的潛能 4.應答各種細胞因子,長期培養(yǎng)啟動細胞（LTC-IC)是指在長期培養(yǎng)體系中培養(yǎng)5周后所測得的集落細胞，到目前為止，長期培養(yǎng)體系是模仿人體內造血微環(huán)境的最佳體外模式。LTC-IC在有基質細胞層的培養(yǎng)中可以維持造血達幾個月。 最近又發(fā)現(xiàn)了較LTC-IC更為原始的造血祖細胞群延長長期培養(yǎng)啟動細胞（ELTC-IC），增殖期出現(xiàn)晚，生成更多的子細胞。,

13、4.造血干/祖細胞的分離純化,方法: 造血干 /祖細胞在增殖，分化過程中表面抗原的變化是其分離純化的標志，而高親和力單克隆抗體的制備和相關分離純化技術的完善是其基礎。其中，CD34抗原是HSC/HPC分離純化的主要標志。,CD34細胞及其亞群的分離純化與性能,細胞表面 CD34抗原是高度糖基化型膜蛋白，主要存在于幼稚造血干/祖細胞，部分骨髓基質細胞和少量的內皮細胞表面，其表達的水平與細胞的分化密切相關。 目前用于CD34細胞純化的方法主要有： 1.熒光激活細胞分選（FACS） 2.免疫吸附分離 （1）單克隆抗體鋪展貼壁 （2）生物素-抗生物素免疫親和層析吸附 （3）免疫磁珠細胞分選 3.利用細

14、胞物理學特性分離 （1）密度梯度離心 （2）淘洗離心,一：CD34+細胞的陰性富集,定義：利用各種方法去除成熟的血細胞和免疫活性細胞，從而達到HSC/HPC 的富集。 方法： 1.使用不同密度梯度的Ficoll，Percoll淋巴細胞分離液富集單個核細胞（MNC），會得到明顯的富集。 2.淘洗離心技術 3.利用花生凝集素和大豆凝集素富集。 由于這幾種富集方法均屬非特異性分離，分選細胞的純度和產率均較低。故目前極少用于CD34+細胞的富集。,CD34+細胞的陽性富集,定義：直接利用 HSC /HPC在增殖，分化過程中表面抗原的變化，通過其特異性單克隆抗體將其分離純化出來，從而達到的富集，即為陽性

15、富集。 方法： 1.FACS分選可獲得高純度的CD34+細胞，并可對其他方法分選的靶細胞進行純度檢測和25個參數同時標志的亞群細胞進行分選。但該儀器價格昂貴，分選速率較慢，因此主要用于CD34+細胞亞群（如CD34+CD38-,CD34+HLA-DR-等）的分選。 2.廣泛應用于CD34+細胞純化的方法是抗CD34單克隆抗體介導的免疫吸附，這類方法具有分離速度快，純度高，分離細胞量大以及經濟和操作簡便等優(yōu)點。,例如： 利用FACS對不同來源的造血細胞進行CD34和CD38雙標志參數分析和分選。得到CD34+CD38+和CD34+CD38-兩個亞群在骨髓，臍帶血和外周血MNC中所占的比例明顯不同

16、。 結果表明：CD34+CD38+細胞大多處于造血祖細胞階段，可形成大量的各系造血細胞集落，但不能維持長期造血；而CD34+CD38-細胞則更幼稚或更接近于造血干細胞。,造血祖細胞體外擴增與定向誘導分化,造血祖細胞體外擴增 不同的造血因子組合，SCF加IL-1,IL-3,IL-6,EPO 等可刺激造血細胞擴增。但是，這些細胞因子的組合在擴增造血細胞的同時也明顯地加速了造血干/祖細胞的分化，到21天時絕大部分細胞已分化成為較成熟的血細胞。 因此，如何在擴增造血細胞的同時，又盡可能地保留造血干細胞，并擴增早期造血祖細胞，使其在數量上和功能上滿足臨床治療的需要，這就成為體外擴增研究的重點。,今年來，

17、經過各國學者的不斷努力，這方面的研究已取得了明顯的進展。 1.造血生長因子的合理組合。 早期造血細胞的細胞因子（SCF，IL-3，GM-SCF） 抑制細胞凋亡的存活因子（SCF，IL-1，IL-6） 晚期系特異性細胞因子（G-CSF，EPO，TPO） 2.CD34+CD38-亞群造血祖細胞的擴增 3.造血負調控因子的應用 例如：利用TGF-，TNF-，白血病抑制因子阻止細胞分化的作用。 4.基質細胞支持的體外擴增 5.持續(xù)灌注培養(yǎng)體系,造血祖細胞定向誘導分化,利用造血干/ 祖細胞具有多向分化的潛能，通過細胞因子的不同組合，定向地誘導其分化，產生大量所需的功能細胞（如紅細胞，粒細胞，血小板，樹突狀細胞），以滿足基礎研究及臨床應用的需要，這在新一代的細胞免疫治療中將具有十分重要的意義。 例如：粒系細胞的定向誘導分化 利用SCF加IL-3，G-CSF，GM-CSF或TPO的組合誘導CD34+細胞向粒系細胞分化。,造血祖細胞體外擴增及定向誘導分化的應用前景,1.造血祖細胞的體外擴增 （1）外周血干細胞移植時減少動員次數和分離時間。 （2）自體造血干細胞移植時的腫瘤進化。 （3）臍帶血造血干細胞移植 （4）造血干細胞作為靶細胞的基