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文檔簡介
1、糖的薄層層析,實驗原理 薄層層析是一種微量而快速的層析方法。該法是把吸附劑或支持劑涂布在玻璃板上成為一薄層,將要分析的樣品滴加到薄層上,然后用合適的溶劑進行展開,使樣品各個成分分離,然后進行定性鑒定和定量測定。 根據(jù)原理的不同薄層層析通常有4種類型:吸附薄層層析,分配薄層層析,離子交換薄層層析和薄層電泳。,實驗操作 硅膠薄板的制備:注意膠要均勻。 1.2 g硅膠H加4.0 ml0.5%CMC溶液,研磨數(shù)分鐘后,倒在預(yù)先準(zhǔn)備好的玻璃板上,鋪開,使?jié){液分部均勻,放在水平臺上,自然晾干。,2. 板的處理: 薄板的活化:105,0.5h 薄板的刮分:徑向?qū)游龅膬?yōu)點是:樣品展層后圖譜呈弧形帶狀,使Rf值
2、相近的化合物也能清楚地分開。 3. 點樣:樣品為鼠李糖、木糖和葡萄糖。點樣量8-10l。注意:點樣點的直徑小于5mm,點樣要少量多次,吹風(fēng)機風(fēng)力不能過大。 4. 展層:展層溶劑為:乙酸乙酯:甲醇:乙酸:水=12:3:3:2(體積比),新鮮配制。 5. 顯色:顯色劑:苯胺-二苯胺-磷酸試劑。,20mm,10mm,30mm,8mm,苯丙氨酸解氨酶的提取純化,實驗原理 苯丙氨酸解氨酶(L-phenylalanine:ammonia lyase,簡稱PAL;EC4.3.1.5)是植物體內(nèi)苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶,與一些重要的次生物質(zhì)如木質(zhì)素、異黃酮類植保素、黃酮類色素等合成密切有關(guān),在植物正常生長發(fā)育和抵
3、御病菌侵害過程中起重要作用。 本次實驗是以銀杏葉為原料采用分步鹽析、透析脫鹽、離子交換等方法得到苯丙氨酸解氨酶。,儀器 高速冷凍離心機;恒溫水?。浑娮犹炱?;柱層析系統(tǒng) 試劑 酶提取液:0.1mol/L硼酸-硼砂緩沖液(含1mmol/LEDTA、20mmol/L-巰基乙醇) 固體硫酸銨 0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(pH8.0,含0.5mmol/LEDTA,2.5%甘油,20mmol/L-巰基乙醇); DEAE纖維素52,操作步驟 酶液提取 (1)植物材料2g,剪成小段,加入5倍體積的酶提取液,于冰浴上用研缽研磨。 (2)將已勻漿的酶液轉(zhuǎn)入離心管,4000r冷凍離心30min。 (3)取離心后
4、的上清液(酶粗提液),量出其體積,留樣 0.5ml 。 硫酸銨分級沉淀酶蛋白 (1)根據(jù)實際體積、溫度和硫酸銨飽和度用量表,算出達到38%飽和度應(yīng)加入酶粗提液中的硫酸銨量,并稱硫酸銨。(240g/L) (2)將酶液倒入燒杯內(nèi),邊緩慢攪拌邊緩慢加入稱好的固體硫酸銨,待全部加完后,再緩慢攪拌10min;然后于9000r離心15min,保留上清液于燒杯內(nèi)。 (3)根據(jù)硫酸銨飽和度用量表,算出從38%到75%飽和度所需硫酸銨用量。 (222g/L) (4)按上述(2)步同法處理,離心后,棄去上清液,保留沉淀。 (5)將沉淀溶于2ml酶抽提液中,留樣 0.5ml 。 透析脫鹽 酶液裝入透析袋,放入低鹽溶
5、液中透析過夜,留樣 0.5ml 。,銀杏葉2g +10ml酶提取液研磨 4000rpm、30min 取上清液 加硫酸銨至飽和度38% 9000rpm、15min 取上清液 加硫酸銨至飽和度75% 9000rpm、15min 取沉淀 溶于2ml酶抽提液 透析,純化 離子交換層析-DEAE纖維素 (1)稱取DEAE纖維素52干粉11.5g,加20ml的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(pH8.0)浸泡4h以上(或浸泡過夜)。 (2)裝柱:把預(yù)處理的DEAE纖維素52裝柱。裝柱完成后,用23個床體積的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(pH8.0)洗脫平衡該柱。 (3)上樣:把所得的酶洗脫液小心地注入柱床
6、面中央,上樣結(jié)束后,在床面以上小心地加入0.02mol/L磷酸鹽緩沖液23cm厚液層。注意上樣開始就收集流出液。 (4)洗柱:約用2倍床體積的A液(0.02mol/L磷酸鹽緩沖液)及B液(含1mol/LNaCl 的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液)洗柱, 按洗脫管編號,取A280值高的管中洗脫液測其PAL的活力;合并主要含有PAL活力的各管洗脫液,并量出其體積(ml)。,苯丙氨酸解氨酶的活力測定,PAL催化L-苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸,反式肉桂酸在290nm處有最大吸收值。若酶的加入量適當(dāng),A290升高的速率可在幾小時內(nèi)保持不變,因此通過測定A290升高的速率以測定PAL活力。規(guī)定1h內(nèi)A290
7、增加0.01為PAL的一個活力單位。,取試管2支,按表中所述(0號為調(diào)零管,1號為測定管。注意按表格從上到下的順序加入試劑)。(單位:ml),將各管混勻,放入40恒溫水浴保溫1h(準(zhǔn)確計時),到時各加0.2 ml 2 mol/LHCl終止反應(yīng)。 紫外分光光度于波長290nm處測定1號管的A290。,蛋白質(zhì)測定(考馬斯亮藍染色法) 取酶液0.1ml,用蒸餾水稀釋至5ml 取試管8支,按下表加入各溶液: 將上述各試管混勻,靜置2min,測定各管的A595。,PAL總活力、比活力、蛋白質(zhì)含量的計算,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)測定蛋白質(zhì)分子量,原理: SDS PAGE是最常用的定性分析
8、蛋白質(zhì)的電泳方法,特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測和測定蛋白質(zhì)分子量。 電泳遷移率與顆粒的電荷、形狀、大?。ǚ肿恿浚┯嘘P(guān),如電荷、形狀都一樣,則電泳遷移率只與分子量有關(guān)。,SDS-PAGE是在PAG系統(tǒng)中引進SDS(十二烷基磺酸鈉)。 SDS的作用:1.能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵,破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu),強還原劑(巰基乙醇)能使二硫鍵斷裂,使蛋白質(zhì)完全變性。 2.能與變性的蛋白質(zhì)按比例結(jié)合,形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。 SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的特點:1. 由于結(jié)合大量的SDS,使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài),從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異。 2.復(fù)合物都是橢圓棒狀,從而降低或消除了各種蛋
9、白質(zhì)分子之間天然的形狀差異。 因此在進行電泳時,蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。,測定各條帶的相對遷移率,根據(jù)已知蛋白質(zhì)分子量和它們的相對遷移率,以相對遷移率為橫坐標(biāo),lgMr為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)未知蛋白質(zhì)的相對遷移率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它們的lgMr,再換算成蛋白質(zhì)分子量,在一定范圍內(nèi),蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW為分子量,X為遷移率,k、b均為常數(shù)。 若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖,可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳,根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。,操作如同PAGE。 樣品:蛋白質(zhì)
10、要完全變性。 蛋白質(zhì)+SDS+巰基乙醇 100 2-5分鐘 標(biāo)準(zhǔn)蛋白市場有售,被測蛋白質(zhì)的分子量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量以內(nèi)。 染色:考馬氏亮藍、銀染色 該法測定蛋白質(zhì)分子量的局限性: 1.蛋白質(zhì)是由亞基(如血紅蛋白)或兩條以上肽鏈(如胰凝乳蛋白酶)組成的,測定時只是它們的亞基或單條肽鏈的MW。 2. 電荷異常的蛋白質(zhì)(如組蛋白,帶大量正電荷) 3.結(jié)構(gòu)異常,不于分子量呈線性關(guān)系(如膠原蛋白) 4.帶有較大輔基的蛋白質(zhì)(如糖蛋白),實驗操作,膠的制備,樣品的處理:按0.5mg蛋白質(zhì)/1mL溶液的比例向標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)或待測樣品中加入樣品溶解液(小試管),充分溶解后,置沸水浴3min,取出冷至室溫。 加樣量:20l,標(biāo)準(zhǔn)蛋白(M)全加。 電泳:點樣端負極,恒壓:開始80V,待樣品進入分離膠后120V。 電極緩沖液:pH 8
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