生化實驗技術(shù)與方法.ppt

1、糖的薄層層析,實驗原理 薄層層析是一種微量而快速的層析方法。該法是把吸附劑或支持劑涂布在玻璃板上成為一薄層，將要分析的樣品滴加到薄層上，然后用合適的溶劑進(jìn)行展開，使樣品各個成分分離，然后進(jìn)行定性鑒定和定量測定。 根據(jù)原理的不同薄層層析通常有4種類型：吸附薄層層析，分配薄層層析，離子交換薄層層析和薄層電泳。,實驗操作 硅膠薄板的制備：注意膠要均勻。 1.2 g硅膠H加4.0 ml0.5%CMC溶液，研磨數(shù)分鐘后，倒在預(yù)先準(zhǔn)備好的玻璃板上，鋪開，使?jié){液分部均勻，放在水平臺上，自然晾干。,2. 板的處理： 薄板的活化：105，0.5h 薄板的刮分：徑向?qū)游龅膬?yōu)點是：樣品展層后圖譜呈弧形帶狀，使Rf值

2、相近的化合物也能清楚地分開。 3. 點樣：樣品為鼠李糖、木糖和葡萄糖。點樣量8-10l。注意：點樣點的直徑小于5mm，點樣要少量多次，吹風(fēng)機風(fēng)力不能過大。 4. 展層：展層溶劑為：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=12：3：3：2（體積比），新鮮配制。 5. 顯色：顯色劑：苯胺-二苯胺-磷酸試劑。,20mm,10mm,30mm,8mm,苯丙氨酸解氨酶的提取純化,實驗原理 苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine：ammonia lyase，簡稱PAL；EC4.3.1.5）是植物體內(nèi)苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶，與一些重要的次生物質(zhì)如木質(zhì)素、異黃酮類植保素、黃酮類色素等合成密切有關(guān)，在植物正常生長發(fā)育和抵

3、御病菌侵害過程中起重要作用。 本次實驗是以銀杏葉為原料采用分步鹽析、透析脫鹽、離子交換等方法得到苯丙氨酸解氨酶。,儀器 高速冷凍離心機；恒溫水?。浑娮犹炱?；柱層析系統(tǒng) 試劑 酶提取液：0.1mol/L硼酸-硼砂緩沖液（含1mmol/LEDTA、20mmol/L-巰基乙醇） 固體硫酸銨 0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH8.0，含0.5mmol/LEDTA，2.5%甘油，20mmol/L-巰基乙醇）； DEAE纖維素52,操作步驟 酶液提取 （1）植物材料2g，剪成小段，加入5倍體積的酶提取液，于冰浴上用研缽研磨。 （2）將已勻漿的酶液轉(zhuǎn)入離心管，4000r冷凍離心30min。 （3）取離心后

4、的上清液（酶粗提液），量出其體積，留樣 0.5ml 。 硫酸銨分級沉淀酶蛋白 （1）根據(jù)實際體積、溫度和硫酸銨飽和度用量表，算出達(dá)到38%飽和度應(yīng)加入酶粗提液中的硫酸銨量，并稱硫酸銨。（240g/L) （2）將酶液倒入燒杯內(nèi)，邊緩慢攪拌邊緩慢加入稱好的固體硫酸銨，待全部加完后，再緩慢攪拌10min；然后于9000r離心15min，保留上清液于燒杯內(nèi)。 （3）根據(jù)硫酸銨飽和度用量表，算出從38%到75%飽和度所需硫酸銨用量。 （222g/L) （4）按上述（2）步同法處理，離心后，棄去上清液，保留沉淀。 （5）將沉淀溶于2ml酶抽提液中,留樣 0.5ml 。 透析脫鹽 酶液裝入透析袋，放入低鹽溶

5、液中透析過夜,留樣 0.5ml 。,銀杏葉2g +10ml酶提取液研磨 4000rpm、30min 取上清液 加硫酸銨至飽和度38% 9000rpm、15min 取上清液 加硫酸銨至飽和度75% 9000rpm、15min 取沉淀 溶于2ml酶抽提液 透析,純化 離子交換層析-DEAE纖維素 （1）稱取DEAE纖維素52干粉11.5g，加20ml的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH8.0）浸泡4h以上（或浸泡過夜）。 （2）裝柱：把預(yù)處理的DEAE纖維素52裝柱。裝柱完成后，用23個床體積的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH8.0）洗脫平衡該柱。 （3）上樣：把所得的酶洗脫液小心地注入柱床

6、面中央，上樣結(jié)束后，在床面以上小心地加入0.02mol/L磷酸鹽緩沖液23cm厚液層。注意上樣開始就收集流出液。 （4）洗柱：約用2倍床體積的A液（0.02mol/L磷酸鹽緩沖液）及B液（含1mol/LNaCl 的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液）洗柱， 按洗脫管編號，取A280值高的管中洗脫液測其PAL的活力；合并主要含有PAL活力的各管洗脫液，并量出其體積（ml）。,苯丙氨酸解氨酶的活力測定,PAL催化L-苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸，反式肉桂酸在290nm處有最大吸收值。若酶的加入量適當(dāng)，A290升高的速率可在幾小時內(nèi)保持不變，因此通過測定A290升高的速率以測定PAL活力。規(guī)定1h內(nèi)A290

7、增加0.01為PAL的一個活力單位。,取試管2支，按表中所述（0號為調(diào)零管，1號為測定管。注意按表格從上到下的順序加入試劑）。（單位：ml）,將各管混勻，放入40恒溫水浴保溫1h（準(zhǔn)確計時），到時各加0.2 ml 2 mol/LHCl終止反應(yīng)。 紫外分光光度于波長290nm處測定1號管的A290。,蛋白質(zhì)測定（考馬斯亮藍(lán)染色法） 取酶液0.1ml，用蒸餾水稀釋至5ml 取試管8支，按下表加入各溶液： 將上述各試管混勻，靜置2min，測定各管的A595。,PAL總活力、比活力、蛋白質(zhì)含量的計算,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）測定蛋白質(zhì)分子量,原理： SDS PAGE是最常用的定性分析

8、蛋白質(zhì)的電泳方法，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測和測定蛋白質(zhì)分子量。 電泳遷移率與顆粒的電荷、形狀、大?。ǚ肿恿浚┯嘘P(guān)，如電荷、形狀都一樣，則電泳遷移率只與分子量有關(guān)。,SDS-PAGE是在PAG系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基磺酸鈉）。 SDS的作用：1.能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強還原劑（巰基乙醇）能使二硫鍵斷裂，使蛋白質(zhì)完全變性。 2.能與變性的蛋白質(zhì)按比例結(jié)合，形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。 SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的特點：1. 由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異。 2.復(fù)合物都是橢圓棒狀，從而降低或消除了各種蛋

9、白質(zhì)分子之間天然的形狀差異。 因此在進(jìn)行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。,測定各條帶的相對遷移率，根據(jù)已知蛋白質(zhì)分子量和它們的相對遷移率，以相對遷移率為橫坐標(biāo)，lgMr為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)未知蛋白質(zhì)的相對遷移率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它們的lgMr，再換算成蛋白質(zhì)分子量,在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)。 若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。,操作如同PAGE。 樣品：蛋白質(zhì)

10、要完全變性。 蛋白質(zhì)+SDS+巰基乙醇 100 2-5分鐘 標(biāo)準(zhǔn)蛋白市場有售，被測蛋白質(zhì)的分子量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量以內(nèi)。 染色：考馬氏亮藍(lán)、銀染色 該法測定蛋白質(zhì)分子量的局限性： 1.蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，測定時只是它們的亞基或單條肽鏈的MW。 2. 電荷異常的蛋白質(zhì)（如組蛋白，帶大量正電荷） 3.結(jié)構(gòu)異常，不于分子量呈線性關(guān)系（如膠原蛋白） 4.帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（如糖蛋白）,實驗操作,膠的制備,樣品的處理：按0.5mg蛋白質(zhì)/1mL溶液的比例向標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)或待測樣品中加入樣品溶解液（小試管），充分溶解后，置沸水浴3min，取出冷至室溫。 加樣量：20l，標(biāo)準(zhǔn)蛋白（M）全加。 電泳：點樣端負(fù)極，恒壓：開始80V，待樣品進(jìn)入分離膠后120V。 電極緩沖液：pH 8