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1、第三章 轉錄基本知識 RNA的生物合成,RNA Biosynthesis, Transcription,遺傳信息傳遞的 中心法則,生物的遺傳信息以密碼的形式儲存在DNA分子上。細胞分裂過程中，DNA復制把親代細胞所含的遺傳信息忠實地傳遞給子細胞。 子代細胞的生長發(fā)育過程中，這些遺傳信息通過轉錄傳遞給RNA，再由RNA通過翻譯轉變成相應的蛋白質多肽鏈上的氨基酸排列順序，由蛋白質執(zhí)行各種各樣的生物學功能，使后代表現出與親代相似的遺傳特征。 一些RNA病毒能以自己的RNA為模板A為合成DNA，稱為逆轉錄這是中心法則的補充。,RNA 生物 合成主要內容,一， RNA 基本性質 1，RNA 化學結構 2

2、，RNA 分子結構 3，RNA 種類 及功能 二，轉錄的分子事件 1，轉錄概念 2，轉錄基本特點 3，轉錄發(fā)生過程（原核生物真核生物差異）： （1）轉錄的酶與蛋白因子 （2）轉錄啟動區(qū)域：啟動子 （3）轉錄的起始，延伸及結束 4，真核轉錄后加工 三：RNA降解 四：RNA轉錄應用,1，RNA 化學結構RNA /DNA Structure,RNA含有四種基本堿基，即腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。此外還有幾十種稀有堿基。,2 RNA的分子結構,RNA的一級結構主要是由AMP、GMP、CMP和UMP四種核糖核苷酸通過3，5磷酸二酯鍵相連而成的多聚核苷酸鏈。 天然RNA的二級結構，一般并不像DNA那

3、樣都是雙螺旋結構，只有在許多區(qū)段可發(fā)生自身回折，使部分A-U、G-C堿基配對，從而形成短的不規(guī)則的螺旋區(qū)。不配對的堿基區(qū)膨出形成環(huán)，被排斥在雙螺旋之外。RNA中雙螺旋結構的穩(wěn)定因素，也主要是堿基的堆砌力，其次才是氫鍵。每一段雙螺旋區(qū)至少需要46對堿基對才能保持穩(wěn)定。在不同的RNA中，雙螺旋區(qū)所占比例不同。 構。,3, RNA 種類及功能,RNA按功能不同分為三類，即 信使RNA(mRNA)、轉運RNA(tRNA)及核蛋白體RNA(rRNA)。 在大多數細胞中RNA的含量比DNA多58倍。,RNA理化特點,RNA與DNA最重要的區(qū)別一是RNA只有一條鏈，二是它的堿基組成與DNA的不同，RNA沒有

4、堿基T（胸腺嘧啶），而有堿基U（尿嘧啶）。所以導致他們有以下性質上的不同。 1.兩性解離：DNA無，只有酸解離，堿基被屏蔽（在分子內部形成了H鍵）。RNA有，有PI。 2.粘度大：DNA;RNA，粘度由分子長度/直徑決定，DNA為線狀分子，RNA為線團。 3.堿的作用：DNA耐堿RNA易被堿水解。 4.顯色反應： 鑒別DNA和RNA+濃HCl RNA - 綠色化合物 DNA - 藍紫色化合物苔黑酚 二苯胺啡啶溴紅（熒光染料）和溴嘧啶都可對DNA染色，原理是卡在分子中，DNA的離心和電泳顯色可用它們。,5.溶解性：都溶于水而不溶于乙醇，因此，常用乙醇來沉淀溶液中的DNA和RNA。DNA溶于苯酚而

5、RNA不溶，故可用苯酚來沉淀RNA。 6.紫外吸收：核酸的m260nm，堿基展開程度越大，紫外吸收就越厲害。當A1時，DNA：50ug/ml，RNA和單鏈DNA：40ug/ml，寡核苷酸：20ug/ml。用A260/A280還可來表示核酸的純度。 8.電泳：核苷酸、核酸均可以進行電泳，泳動速度主要由分子大小來決定，因此，電泳是測定核酸分子量的好方法。,紫外分光光度計 A260/A280和A260/A230的含義,A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波長，最佳測量值的范圍為0.1至1.0。 A280nm 是蛋白和酚類物質最高吸收峰的吸收波長，比值可進行核酸樣品純度評估：純DNA的A260/A280

6、比值為1.8，純RNA為2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質的污染，需要純化樣品。比值=1.5相當于50蛋白質/DNA溶液 A230nm ，是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長，比值可進行核酸樣品純度評估：純DNA和 RNA的A260/A230比值為2.5。若比值小于2.0標明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機溶劑污染，需要純化樣品。 A260/A280和A260/A230 ：是核酸純度的指示值，純度好的DNA，在pH7-8.5 下其比值應該在2.0 或2.5，A260 / A280的比值， 用于評估樣品的純度， 因為蛋白的吸收峰是280 nm。 純凈的樣品比值大于1.8（DNA

7、）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。 A230是多肽、芳香基團、苯酚和一些碳氫化合物的吸光度，A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0 。,在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA鏈為模板合成RNA，從而將DNA所攜帶的遺傳信息傳遞給RNA的過程稱為轉錄（transcription）。 經轉錄生成的RNA有多種，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA(small nuclear RNA和HnRNA等。,二，轉錄的分子事件 1，轉錄概念,mRNA攜帶了DNA的遺傳信息，

8、在蛋白質合成中作為合成蛋白質的模板起傳遞遺傳信息的作用。 tRNA的二級結構最具特色，呈三葉草型。其主要功能部位有二個，一是氨基酸臂的 3末端為-CCA-OH，起特異結合氨基酸作用；二是有一個反密碼環(huán)，環(huán)上有反密碼子，與mRNA上的密碼子反向互補，于是由tRNA攜帶的氨基酸可被轉運到與密碼子對應的部位，因此tRNA具有攜帶轉運氨基酸的作用。tRNA的三級結構為倒“L”型，是天然狀態(tài)下的構象。 rRNA不單獨存在，它與蛋白質結合為核蛋白體，分為大小亞基，存在于粗面內質網與胞漿中。核蛋白體是蛋白質生物合成的場所。 snRNA 參與RNA 剪輯,復制和轉錄的區(qū)別,轉錄是基因表達的中心環(huán)節(jié),轉錄是以

9、DNA為模板合成RNA, 并且只是以單股DNA 為模板，因此具有不對稱性； 用以轉錄的單鏈DNA, 稱為模板鏈, 與復制不同，轉錄是局部的,從啟動子開始到終止子結束,為一個轉錄單位; 轉錄不需要引物； 轉錄的忠實性相對弱； 轉錄首先得到RNA前體，然后再進行加工轉變?yōu)槌墒斓腞NA.,2，轉錄基本特點,Characters of RNA Biosynthesis,轉錄（transcription）的不對稱性就是指以雙鏈DNA中的一條鏈作為模板進行轉錄，從而將遺傳信息由DNA傳遞給RNA。 對于不同的基因來說，其轉錄信息可以存在于兩條不同的DNA鏈上。,（1）、轉錄的不對稱性,能夠轉錄RNA的那條

10、DNA鏈稱為模板鏈(template strand) ，也稱作反義鏈。 與模板鏈互補的另一條DNA鏈稱為編碼鏈(coding strand)，也稱為有意義鏈。,模板鏈,編碼鏈,編碼鏈,模板鏈,模板鏈和編碼鏈的相對性,模板鏈、編碼鏈與轉錄及翻譯的關系,RNA轉錄合成時，以DNA作為模板，在RNA聚合酶的催化下，連續(xù)合成一段RNA鏈，各條RNA鏈之間無需再進行連接。,（2）、轉錄的連續(xù)性,RNA轉錄合成時，只能向一個方向進行聚合，所依賴的模板DNA鏈的方向為35，而RNA鏈的合成方向為53。,（3）、轉錄的單向性,RNA轉錄合成時，只能以DNA分子中的某一段作為模板，故存在特定的起始位點和特定的終

11、止位點。 特定起始點和特定終止點之間的DNA鏈構成一個轉錄單位，通常由轉錄區(qū)和有關的調節(jié)順序構成。,（4）、有特定的起始和終止位點,3，轉錄發(fā)生過程（1）參與轉錄合成的酶和蛋白因子,Enzymes and Protein Factors for RNA Biosynthesis,原料：NTP （ATP, UTP, GTP, CTP）。 模板：單鏈DNA。 酶：RNA聚合酶（RNA-pol）。 其他蛋白質因子：如轉錄因子、終止因子等。,參與RNA轉錄合成的物質,這是一種不同于引物酶的依賴DNA的RNA聚合酶（DNA dependent RNA polymerase，DDRP）。 該酶在單鏈DNA

12、模板以及四種核糖核苷酸存在的條件下，不需要引物，即可從53聚合形成RNA。,RNA聚合酶（DDRP）,原核生物中的RNA聚合酶全酶由五個亞基構成，即2。 亞基與轉錄起始點的識別有關，在轉錄合成開始后被釋放；余下的部分（2）被稱為核心酶，與RNA鏈的聚合有關。,原核生物的RNA聚合酶,核心酶 (core enzyme),全酶 (holoenzyme),原核生物RNA聚合酶的核心酶和全酶,原核生物RNA聚合酶亞基的功能,單因子RNA 聚合酶,T3,T7，sp6噬菌體RNA 聚合酶 200多個氨基酸組成的多肽 特異性多噬菌體上幾個啟動子進行轉錄。 體外獲得單鏈或者雙鏈RNA的最好的工具！ 簡單，高效

13、。 RNA 聚合酶+T7/T3/T6啟動子+ DNA 雙聯模板+終止子+ NTP+Mg2+ H2O,真核生物中的RNA聚合酶可按其對-鵝膏蕈堿的敏感性而分為三種，它們均由1012個大小不同的亞基所組成，結構非常復雜，其功能也不同。,真核生物的RNA聚合酶,在真核生物中，轉錄的起始過程較為復雜，現已發(fā)現數百種蛋白因子與RNA轉錄合成有關。 凡是與基因表達調控相關的蛋白因子統(tǒng)稱為反式作用因子（transacting factor）。,轉錄因子,在反式作用因子中，直接或間接參與轉錄起始復合體的形成的蛋白因子被稱為轉錄因子（transcriptional factor, TF）。 不同的RNA聚合酶存

14、在相應的轉錄因子，如與RNA聚合酶相關的轉錄因子包括 TFA，TFB，TFD，TFE，TFF，TFH等。,真核生物RNA聚合酶轉錄因子及其功能,協助RNA聚合酶識別終止信號的輔助因子（蛋白質）則稱為終止因子 (termination factor)。 有的終止信號的作用可被特異的因子所阻止，使RNA聚合酶得以越過終止子繼續(xù)轉錄，這稱為通讀(readthrough)，這類引起抗終止作用的蛋白質稱為抗終止因子(antitermination)。 原核生物中的終止因子蛋白是一種六聚體的蛋白質，亞基的分子量為50kd。 蛋白能識別轉錄終止信號，并與RNA緊密結合，導致RNA的釋放。,終止因子,三：RN

15、A合成過程,起始,雙鏈DNA局部解開,磷酸二酯鍵形成,終止階段,解鏈區(qū)到達基因終點,延長階段,RNA,啟動子（promoter),終止子(terminator),轉錄起始需解決兩個問題： 必須準確地結合在轉錄模板的起始區(qū)域。 DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉錄的模板。,1 起始：RNA聚合酶識別起始區(qū),在原核生物中，若干功能相關的結構基因常常串聯在一起，由其上游的同一調控序列進行調控，這種基因的組織形式稱為操縱子（operon）。,1. 模板與酶的辨認識別：,DNA分子中參與轉錄調控的序列統(tǒng)稱為順式作用元件（cis-acting element）。 原核生物轉錄起始時，首先由RNA聚合酶中

16、的因子識別轉錄起始點，并促使核心酶結合形成全酶復合物。,位于基因上游，與RNA聚合酶識別、結合并起始轉錄有關的一些DNA調控序列被稱為啟動子（promoter）。 啟動子序列通常由一些帶共性的保守序列構成。,利用足跡法(footprint)和DNA測序法可以確定啟動子的序列結構。 原理:DNA和蛋白質結合以后便不會被DNAase分解，在測序時便出現空白區(qū)(即蛋白質結合區(qū))，從而了解與蛋白質結合部位的核苷酸對數目。在用酶移出與蛋白質結合的DNA后，又可測出被結合處DNA的序列。,足跡法確定啟動子序列,原核生物啟動子的保守序列,原核生物轉錄起始區(qū)的一致性序列,大腸桿菌啟動子共有序列的功能,起點,被

17、RNA聚合酶辨認的區(qū)段就是位于轉錄起始點-35區(qū)的TTGACA序列。 RNA聚合酶與該區(qū)結合后，即滑動至-10區(qū)的TATAAT序列（Pribnow盒），并啟動轉錄。,RNA聚合酶全酶在轉錄起始區(qū)的結合,氫鍵 結合于大小溝 解鏈區(qū)-9-+13, DNA局部雙鏈解開。, RNA聚合酶全酶(2)與模板（啟動子區(qū)）結合。, 在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應，形成轉錄起始復合物。產生第一個核苷酸(+1),RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3,轉錄起始復合物:,5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi,2. 轉錄的起始過程：,Transc

18、ription Initiation,Complex:RNA polymerase makes many small,abortive transcripts without ever leaving the Promoter.the abortive transcripts up to 9-10 nt in size 流產轉錄 通過啟動子（起始）快：強啟動子 慢： 弱啟動子,轉錄起始可被抑制,利福平rifamycin ：抑制亞基 利迪鏈霉素strepolydigin抑制亞基 注意鏈霉素strepomycin結合了細菌核糖體 30S 小亞基 放線菌素D actinomycin 抑制真核聚合酶I

19、，與DNA 結合，阻止延伸 （凋亡） -鵝膏蕈堿amanitin ：具有雙環(huán)結構的八肽毒素，真核聚合酶II 結合，抑制催化合成mRNA ，（致死）,因子從全酶上脫離，余下的核心酶繼續(xù)沿DNA鏈移動，按照堿基互補原則，不斷聚合RNA。 1. 亞基脫落，RNApol聚合酶核心酶變構，與模板結合松弛，沿著DNA模板前移； 2. 在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。,（二）轉錄延長,(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi,轉錄空泡(transcription bubble)的形成,原核生物轉錄過程中的羽毛狀現象,RNA轉錄合成的終止機制有兩種： 1，內在因子，非Rho

20、因終止子：轉錄的終止的特殊信號（一段RNA 序列） 2依賴Rho因子的轉錄終止： 由終止因子（因子）識別特異的終止信號，并促使RNA的釋放。,（三）轉錄終止：RNA 聚合酶停滯， RNA 解離,模板DNA鏈在接近轉錄終止點處存在相連的富含GC和AT的區(qū)域，使RNA轉錄產物形成寡聚U及發(fā)夾形的二級結構，引起RNA聚合酶變構及移動停止，導致RNA轉錄的終止。,1非依賴Rho的轉錄終止：,莖環(huán)結構使轉錄終止的機理,使RNA聚合酶變構，轉錄停頓； 使轉錄復合物趨于解離，RNA產物釋放。,大腸桿菌兩類終止子的回文結構,A. 不依賴于Rho（）的終止子,A. 依賴于Rho（）的終止子,富含G-C,系列U,

21、ATP,2，依賴 Rho因子的轉錄終止,DNA 序列缺乏共性，不能形成強的發(fā)卡結構,6聚體， 具有NTP酶 和解螺旋酶,原核轉錄和翻譯同時進行,mRNA 翻譯起始： SD 序列:AUG上游的7-12 和核苷酸，AGGAGG 與16S RNA互補 UCCUCC,真核生物的轉錄過程,1. 轉錄起始的上游區(qū)段：UAS 真核生物的轉錄起始點上游-35-25bp區(qū)也存在一段富含TA的順序，被稱為Hogness盒或TATA盒，通常認為是啟動子的核心序列。,（一）轉錄起始： 真核生物的啟動子,除此之外，在真核生物中還可見到其他帶共性的序列，如 -80-70, CAAT盒(ccaat)及-110-80GC盒(

22、gggcggg)等。 TATA盒上游的序列：UAS, 在遠離受控基因處存在的，能夠增強基因轉錄活性的調控序列稱為增強子（enhancer）。增強子特點：p79 遠距離效應；無方向性；順勢調控；廣泛性，相位性,真核生物啟動子保守序列,參與轉錄位點確定起始,控制轉錄起始頻率,真核生物中的RNA聚合酶可按其對-鵝膏蕈堿的敏感性而分為三種，它們均由1012個大小不同的亞基所組成，結構非常復雜，其功能也不同。,真核生物的三種RNA聚合酶,真核生物RNA聚合酶轉錄因子及其功能,真核轉錄起始需要各種轉錄因子,真核生物轉錄起始時，首先由TFD的TBP亞基識別并結合TATA盒，然后在其他轉錄因子的配合下，與RN

23、A聚合酶組裝形成轉錄起始前復合物(pre-initiation complex, PIC)。,2. 轉錄起始過程：,RNA聚合酶催化第一個磷酸二酯鍵形成。 RNA聚合酶的羧基末端結構域（CTD）被磷酸化修飾，大部分轉錄因子脫離，聚合酶向下游移動延伸RNA鏈。,（二）轉錄延長,真核生物轉錄延長過程與原核生物類似，但由于存在核小體的高級結構，故在轉錄延長過程中可觀察到核小體移位和解聚現象。,（三）轉錄終止,真核生物轉錄終止與轉錄后修飾，即poly A尾巴結構的添加密切相關。 在poly A修飾位點的下游存在一組共同序列AATAAA和GTGTGT，為轉錄終止的識別修飾位點。 在轉錄越過修飾點后，RN

24、A鏈在修飾點處被切斷，隨即進行加帽和加尾修飾。,真核生物RNA的轉錄終止,5-AAUAAA-,5 -AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,轉錄終止的修飾點,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,4 真核生物的轉錄后修飾,Post-transcriptional Modification in Eukaryote,1加帽（adding cap）： 即在mRNA的5-端加上m7GTP的結構。此過程發(fā)生在細胞核內，即HnRNA即可進行加帽。 加工過程首先是在磷酸酶的作用下，將5-端的磷酸基水解，然后再加上鳥苷三磷酸，形成GpppN的結

25、構，再對G進行甲基化。,1、真核生物mRNA的轉錄后加工,（一）首、尾的修飾,2加尾（adding tail）： 這一過程也是細胞核內完成，首先由核酸外切酶切去3-端一些過剩的核苷酸，然后再加入polyA。 polyA結構與mRNA的半壽期有關。,The 3 ends of mRNAs are generated by cleavage and polyadenylation；The sequence AAUAAA is necessary for cleavage to generate a 3 end for polyadenylation.,（二）mRNA的剪接（splicing）,雞卵

26、清蛋白成熟mRNA與DNA雜交電鏡圖,mRNA,DNA,1. 斷裂基因（splite gene）,編碼區(qū) A、B、C、D,真核生物結構基因，由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質，這些基因稱為斷裂基因。,外顯子(exon)和內含子(intron),外顯子在斷裂基因及其初級轉錄產物上出現，并表達為成熟RNA的核酸序列（結構基因中能夠指導多肽鏈合成的編碼順序）。 內含子隔斷基因的線性表達而在剪接過程中被除去的核酸序列（不能指導多肽鏈合成的非編碼順序）。,核內帶有外顯子和內含子編碼序列的初級RNA轉錄產物稱為雜化核RNA （he

27、tero-nuclear RNA, hnRNA）。 hnRNA經剪接加工除去內含子編碼序列并將外顯子編碼序列連接起來才能形成成熟的mRNA。,2. hnRNA和snRNA：,snRNA為核內小RNA，富含尿嘧啶，故以U作分類和命名，如 U1、U2等。snRNA與核內蛋白質組裝形成小核蛋白體（snRNP），參與hnRNA的剪接加工。,3. hnRNA的剪接過程：, snRNP與hnRNA結合成為剪接體。, 剪接體結構調整，U2和U6形成催化中心，發(fā)生轉酯反應。,pG-OH (ppG-OH, pppG-OH),剪接過程的二次轉酯反應,I 型內含子,II 型內含子,線粒體與葉綠體的rRNA 中 無需

28、自由Gpp 使用自身2-OH 進行攻擊 :(有酶催化活性的RNA分子命名為Ribozyme )!,雞卵清蛋 白基因,hnRNA,首、尾修飾,hnRNA剪接,成熟的mRNA,雞卵清蛋白基因及其轉錄、轉錄后修飾,4. mRNA的編輯和修飾,RNA的編輯(RNA editing): 某些RNA，特別是mRNA的一種加工方式，它導致了DNA所編碼的遺傳信息的改變（如 單堿基突變） RNA的修飾（RNA modification）： 有些RNA，特別是前體rRNA和tRNA可能有特異性的化學修飾。,RNA的編輯 :mRNA編輯是在mRNA水平上信息發(fā)生改變(堿基取代、插入或缺失)的過程。,在哺乳動物細胞

29、中，mRNA中有時會發(fā)生單個堿基的替換，導致它所編碼的蛋白質序列發(fā)生改變。在錐蟲線粒體中，當堿基有條理地增加或缺失時，在一些基因的轉錄物中會發(fā)生更大范圍的變化。 mRNA編輯機理：非剪切作用改變mRNA。,堿基取代,如哺乳動物載脂蛋白B mRNA的編輯：載脂蛋白B的mRNA含29個外顯子，有4563個code，第2153號code是CAA，在肝中mRNA 編碼4563AA的蛋白，小腸中存在的脫氫酶使C脫氫，將CAAUAA，小腸的mRNA中編輯產生UAA使翻譯停止在2153code處。,Apo100,Apo48:形成CM:乳糜顆粒,堿基的插入或缺失和移碼,移碼：錐蟲coxII(cytochrom

30、eoxidase,細胞色素氧化酶II)基因的mRNA相對于其DNA序列出現了讀碼框的偏移，通過插入4個U，才能產生正確的讀碼框。,插入或缺失：錐蟲線粒體的細胞色素氧化酶III mRNA序列分析表明，許多U并非在DNA中編碼（紅色）或在RNA中被除掉（用T表示）。這些U的專一性插入信息是由向導RNA(guide RNA)提供的，向導RNA含有和正確編輯的RNA互補的一段序列。,尿嘧啶殘基的添加或刪除過程：首先RNA切斷，添加或去除尿嘧啶，最后進行末端連接。該反應在向導RNA的指導下由一個酶復合體催化完成的。,二、tRNA的轉錄后加工,主要有以下幾種加工方式： 切斷。 剪接。 3-末端-CCA序列添加。 化學修飾。,tRNA前體,RNA pol ,tRNA前體的轉錄合成,tRNA前體的切斷和剪接加工,tRNA3-末端-CCA序列的添加,tRNA的堿基修飾,三、rRNA的轉錄后加工,真核生物中前體包括了18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA序列。在高等真核生物中，前體以沉降速率來命名，命名為45SRNA，在低等真核生物中，它比較?。ㄈ缃湍钢袨?5S）,rRNA前體的轉錄和剪接加工,原核生物中前體包括了16S rRNA、23S rRNA和5S rRNA和tRNA序列。前體為30S RNA。,RNA生物功能的多樣性,1、RNA在遺傳信息的翻譯中起著決定作用。 2、RNA