轉(zhuǎn)錄基本知識(shí).ppt

1、第三章 轉(zhuǎn)錄基本知識(shí) RNA的生物合成,RNA Biosynthesis, Transcription,遺傳信息傳遞的 中心法則,生物的遺傳信息以密碼的形式儲(chǔ)存在DNA分子上。細(xì)胞分裂過程中，DNA復(fù)制把親代細(xì)胞所含的遺傳信息忠實(shí)地傳遞給子細(xì)胞。 子代細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，這些遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄傳遞給RNA，再由RNA通過翻譯轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的蛋白質(zhì)多肽鏈上的氨基酸排列順序，由蛋白質(zhì)執(zhí)行各種各樣的生物學(xué)功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳特征。 一些RNA病毒能以自己的RNA為模板A為合成DNA，稱為逆轉(zhuǎn)錄這是中心法則的補(bǔ)充。,RNA 生物 合成主要內(nèi)容,一， RNA 基本性質(zhì) 1，RNA 化學(xué)結(jié)構(gòu) 2

2、，RNA 分子結(jié)構(gòu) 3，RNA 種類 及功能 二，轉(zhuǎn)錄的分子事件 1，轉(zhuǎn)錄概念 2，轉(zhuǎn)錄基本特點(diǎn) 3，轉(zhuǎn)錄發(fā)生過程（原核生物真核生物差異）： （1）轉(zhuǎn)錄的酶與蛋白因子 （2）轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)域：?jiǎn)?dòng)子 （3）轉(zhuǎn)錄的起始，延伸及結(jié)束 4，真核轉(zhuǎn)錄后加工 三：RNA降解 四：RNA轉(zhuǎn)錄應(yīng)用,1，RNA 化學(xué)結(jié)構(gòu)RNA /DNA Structure,RNA含有四種基本堿基，即腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。此外還有幾十種稀有堿基。,2 RNA的分子結(jié)構(gòu),RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由AMP、GMP、CMP和UMP四種核糖核苷酸通過3，5磷酸二酯鍵相連而成的多聚核苷酸鏈。 天然RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，一般并不像DNA那

3、樣都是雙螺旋結(jié)構(gòu)，只有在許多區(qū)段可發(fā)生自身回折，使部分A-U、G-C堿基配對(duì)，從而形成短的不規(guī)則的螺旋區(qū)。不配對(duì)的堿基區(qū)膨出形成環(huán)，被排斥在雙螺旋之外。RNA中雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素，也主要是堿基的堆砌力，其次才是氫鍵。每一段雙螺旋區(qū)至少需要46對(duì)堿基對(duì)才能保持穩(wěn)定。在不同的RNA中，雙螺旋區(qū)所占比例不同。 構(gòu)。,3, RNA 種類及功能,RNA按功能不同分為三類，即 信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)及核蛋白體RNA(rRNA)。 在大多數(shù)細(xì)胞中RNA的含量比DNA多58倍。,RNA理化特點(diǎn),RNA與DNA最重要的區(qū)別一是RNA只有一條鏈，二是它的堿基組成與DNA的不同，RNA沒有

4、堿基T（胸腺嘧啶），而有堿基U（尿嘧啶）。所以導(dǎo)致他們有以下性質(zhì)上的不同。 1.兩性解離：DNA無，只有酸解離，堿基被屏蔽（在分子內(nèi)部形成了H鍵）。RNA有，有PI。 2.粘度大：DNA;RNA，粘度由分子長(zhǎng)度/直徑?jīng)Q定，DNA為線狀分子，RNA為線團(tuán)。 3.堿的作用：DNA耐堿RNA易被堿水解。 4.顯色反應(yīng)： 鑒別DNA和RNA+濃HCl RNA - 綠色化合物 DNA - 藍(lán)紫色化合物苔黑酚 二苯胺啡啶溴紅（熒光染料）和溴嘧啶都可對(duì)DNA染色，原理是卡在分子中，DNA的離心和電泳顯色可用它們。,5.溶解性：都溶于水而不溶于乙醇，因此，常用乙醇來沉淀溶液中的DNA和RNA。DNA溶于苯酚而

5、RNA不溶，故可用苯酚來沉淀RNA。 6.紫外吸收：核酸的m260nm，堿基展開程度越大，紫外吸收就越厲害。當(dāng)A1時(shí)，DNA：50ug/ml，RNA和單鏈DNA：40ug/ml，寡核苷酸：20ug/ml。用A260/A280還可來表示核酸的純度。 8.電泳：核苷酸、核酸均可以進(jìn)行電泳，泳動(dòng)速度主要由分子大小來決定，因此，電泳是測(cè)定核酸分子量的好方法。,紫外分光光度計(jì) A260/A280和A260/A230的含義,A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)，最佳測(cè)量值的范圍為0.1至1.0。 A280nm 是蛋白和酚類物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評(píng)估：純DNA的A260/A280

6、比值為1.8，純RNA為2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質(zhì)的污染，需要純化樣品。比值=1.5相當(dāng)于50蛋白質(zhì)/DNA溶液 A230nm ，是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評(píng)估：純DNA和 RNA的A260/A230比值為2.5。若比值小于2.0標(biāo)明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機(jī)溶劑污染，需要純化樣品。 A260/A280和A260/A230 ：是核酸純度的指示值，純度好的DNA，在pH7-8.5 下其比值應(yīng)該在2.0 或2.5，A260 / A280的比值， 用于評(píng)估樣品的純度， 因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80 nm。 純凈的樣品比值大于1.8（DNA

7、）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。 A230是多肽、芳香基團(tuán)、苯酚和一些碳?xì)浠衔锏奈舛?，A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0 。,在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA鏈為模板合成RNA，從而將DNA所攜帶的遺傳信息傳遞給RNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄（transcription）。 經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成的RNA有多種，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA(small nuclear RNA和HnRNA等。,二，轉(zhuǎn)錄的分子事件 1，轉(zhuǎn)錄概念,mRNA攜帶了DNA的遺傳信息，

8、在蛋白質(zhì)合成中作為合成蛋白質(zhì)的模板起傳遞遺傳信息的作用。 tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)最具特色，呈三葉草型。其主要功能部位有二個(gè)，一是氨基酸臂的 3末端為-CCA-OH，起特異結(jié)合氨基酸作用；二是有一個(gè)反密碼環(huán)，環(huán)上有反密碼子，與mRNA上的密碼子反向互補(bǔ)，于是由tRNA攜帶的氨基酸可被轉(zhuǎn)運(yùn)到與密碼子對(duì)應(yīng)的部位，因此tRNA具有攜帶轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的作用。tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)為倒“L”型，是天然狀態(tài)下的構(gòu)象。 rRNA不單獨(dú)存在，它與蛋白質(zhì)結(jié)合為核蛋白體，分為大小亞基，存在于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與胞漿中。核蛋白體是蛋白質(zhì)生物合成的場(chǎng)所。 snRNA 參與RNA 剪輯,復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)別,轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的中心環(huán)節(jié),轉(zhuǎn)錄是以

9、DNA為模板合成RNA, 并且只是以單股DNA 為模板，因此具有不對(duì)稱性； 用以轉(zhuǎn)錄的單鏈DNA, 稱為模板鏈, 與復(fù)制不同，轉(zhuǎn)錄是局部的,從啟動(dòng)子開始到終止子結(jié)束,為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位; 轉(zhuǎn)錄不需要引物； 轉(zhuǎn)錄的忠實(shí)性相對(duì)弱； 轉(zhuǎn)錄首先得到RNA前體，然后再進(jìn)行加工轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腞NA.,2，轉(zhuǎn)錄基本特點(diǎn),Characters of RNA Biosynthesis,轉(zhuǎn)錄（transcription）的不對(duì)稱性就是指以雙鏈DNA中的一條鏈作為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，從而將遺傳信息由DNA傳遞給RNA。 對(duì)于不同的基因來說，其轉(zhuǎn)錄信息可以存在于兩條不同的DNA鏈上。,（1）、轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱性,能夠轉(zhuǎn)錄RNA的那條

10、DNA鏈稱為模板鏈(template strand) ，也稱作反義鏈。 與模板鏈互補(bǔ)的另一條DNA鏈稱為編碼鏈(coding strand)，也稱為有意義鏈。,模板鏈,編碼鏈,編碼鏈,模板鏈,模板鏈和編碼鏈的相對(duì)性,模板鏈、編碼鏈與轉(zhuǎn)錄及翻譯的關(guān)系,RNA轉(zhuǎn)錄合成時(shí)，以DNA作為模板，在RNA聚合酶的催化下，連續(xù)合成一段RNA鏈，各條RNA鏈之間無需再進(jìn)行連接。,（2）、轉(zhuǎn)錄的連續(xù)性,RNA轉(zhuǎn)錄合成時(shí)，只能向一個(gè)方向進(jìn)行聚合，所依賴的模板DNA鏈的方向?yàn)?5，而RNA鏈的合成方向?yàn)?3。,（3）、轉(zhuǎn)錄的單向性,RNA轉(zhuǎn)錄合成時(shí)，只能以DNA分子中的某一段作為模板，故存在特定的起始位點(diǎn)和特定的終

11、止位點(diǎn)。 特定起始點(diǎn)和特定終止點(diǎn)之間的DNA鏈構(gòu)成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，通常由轉(zhuǎn)錄區(qū)和有關(guān)的調(diào)節(jié)順序構(gòu)成。,（4）、有特定的起始和終止位點(diǎn),3，轉(zhuǎn)錄發(fā)生過程（1）參與轉(zhuǎn)錄合成的酶和蛋白因子,Enzymes and Protein Factors for RNA Biosynthesis,原料：NTP （ATP, UTP, GTP, CTP）。 模板：?jiǎn)捂淒NA。 酶：RNA聚合酶（RNA-pol）。 其他蛋白質(zhì)因子：如轉(zhuǎn)錄因子、終止因子等。,參與RNA轉(zhuǎn)錄合成的物質(zhì),這是一種不同于引物酶的依賴DNA的RNA聚合酶（DNA dependent RNA polymerase，DDRP）。 該酶在單鏈DNA

12、模板以及四種核糖核苷酸存在的條件下，不需要引物，即可從53聚合形成RNA。,RNA聚合酶（DDRP）,原核生物中的RNA聚合酶全酶由五個(gè)亞基構(gòu)成，即2。 亞基與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的識(shí)別有關(guān)，在轉(zhuǎn)錄合成開始后被釋放；余下的部分（2）被稱為核心酶，與RNA鏈的聚合有關(guān)。,原核生物的RNA聚合酶,核心酶 (core enzyme),全酶 (holoenzyme),原核生物RNA聚合酶的核心酶和全酶,原核生物RNA聚合酶亞基的功能,單因子RNA 聚合酶,T3,T7，sp6噬菌體RNA 聚合酶 200多個(gè)氨基酸組成的多肽 特異性多噬菌體上幾個(gè)啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。 體外獲得單鏈或者雙鏈RNA的最好的工具！ 簡(jiǎn)單，高效

13、。 RNA 聚合酶+T7/T3/T6啟動(dòng)子+ DNA 雙聯(lián)模板+終止子+ NTP+Mg2+ H2O,真核生物中的RNA聚合酶可按其對(duì)-鵝膏蕈堿的敏感性而分為三種，它們均由1012個(gè)大小不同的亞基所組成，結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，其功能也不同。,真核生物的RNA聚合酶,在真核生物中，轉(zhuǎn)錄的起始過程較為復(fù)雜，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種蛋白因子與RNA轉(zhuǎn)錄合成有關(guān)。 凡是與基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的蛋白因子統(tǒng)稱為反式作用因子（transacting factor）。,轉(zhuǎn)錄因子,在反式作用因子中，直接或間接參與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體的形成的蛋白因子被稱為轉(zhuǎn)錄因子（transcriptional factor, TF）。 不同的RNA聚合酶存

14、在相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，如與RNA聚合酶相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子包括 TFA，TFB，TFD，TFE，TFF，TFH等。,真核生物RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄因子及其功能,協(xié)助RNA聚合酶識(shí)別終止信號(hào)的輔助因子（蛋白質(zhì)）則稱為終止因子 (termination factor)。 有的終止信號(hào)的作用可被特異的因子所阻止，使RNA聚合酶得以越過終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，這稱為通讀(readthrough)，這類引起抗終止作用的蛋白質(zhì)稱為抗終止因子(antitermination)。 原核生物中的終止因子蛋白是一種六聚體的蛋白質(zhì)，亞基的分子量為50kd。 蛋白能識(shí)別轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，并與RNA緊密結(jié)合，導(dǎo)致RNA的釋放。,終止因子,三：RN

15、A合成過程,起始,雙鏈DNA局部解開,磷酸二酯鍵形成,終止階段,解鏈區(qū)到達(dá)基因終點(diǎn),延長(zhǎng)階段,RNA,啟動(dòng)子（promoter),終止子(terminator),轉(zhuǎn)錄起始需解決兩個(gè)問題： 必須準(zhǔn)確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域。 DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板。,1 起始：RNA聚合酶識(shí)別起始區(qū),在原核生物中，若干功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因常常串聯(lián)在一起，由其上游的同一調(diào)控序列進(jìn)行調(diào)控，這種基因的組織形式稱為操縱子（operon）。,1. 模板與酶的辨認(rèn)識(shí)別：,DNA分子中參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的序列統(tǒng)稱為順式作用元件（cis-acting element）。 原核生物轉(zhuǎn)錄起始時(shí)，首先由RNA聚合酶中

16、的因子識(shí)別轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，并促使核心酶結(jié)合形成全酶復(fù)合物。,位于基因上游，與RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄有關(guān)的一些DNA調(diào)控序列被稱為啟動(dòng)子（promoter）。 啟動(dòng)子序列通常由一些帶共性的保守序列構(gòu)成。,利用足跡法(footprint)和DNA測(cè)序法可以確定啟動(dòng)子的序列結(jié)構(gòu)。 原理:DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合以后便不會(huì)被DNAase分解，在測(cè)序時(shí)便出現(xiàn)空白區(qū)(即蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū))，從而了解與蛋白質(zhì)結(jié)合部位的核苷酸對(duì)數(shù)目。在用酶移出與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA后，又可測(cè)出被結(jié)合處DNA的序列。,足跡法確定啟動(dòng)子序列,原核生物啟動(dòng)子的保守序列,原核生物轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的一致性序列,大腸桿菌啟動(dòng)子共有序列的功能,起點(diǎn),被

17、RNA聚合酶辨認(rèn)的區(qū)段就是位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)-35區(qū)的TTGACA序列。 RNA聚合酶與該區(qū)結(jié)合后，即滑動(dòng)至-10區(qū)的TATAAT序列（Pribnow盒），并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。,RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合,氫鍵 結(jié)合于大小溝 解鏈區(qū)-9-+13, DNA局部雙鏈解開。, RNA聚合酶全酶(2)與模板（啟動(dòng)子區(qū)）結(jié)合。, 在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。產(chǎn)生第一個(gè)核苷酸(+1),RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3,轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物:,5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi,2. 轉(zhuǎn)錄的起始過程：,Transc

18、ription Initiation,Complex:RNA polymerase makes many small,abortive transcripts without ever leaving the Promoter.the abortive transcripts up to 9-10 nt in size 流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄 通過啟動(dòng)子（起始）快：強(qiáng)啟動(dòng)子 慢： 弱啟動(dòng)子,轉(zhuǎn)錄起始可被抑制,利福平rifamycin ：抑制亞基 利迪鏈霉素strepolydigin抑制亞基 注意鏈霉素strepomycin結(jié)合了細(xì)菌核糖體 30S 小亞基 放線菌素D actinomycin 抑制真核聚合酶I

19、，與DNA 結(jié)合，阻止延伸 （凋亡） -鵝膏蕈堿amanitin ：具有雙環(huán)結(jié)構(gòu)的八肽毒素，真核聚合酶II 結(jié)合，抑制催化合成mRNA ，（致死）,因子從全酶上脫離，余下的核心酶繼續(xù)沿DNA鏈移動(dòng)，按照堿基互補(bǔ)原則，不斷聚合RNA。 1. 亞基脫落，RNApol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移； 2. 在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長(zhǎng)。,（二）轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng),(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi,轉(zhuǎn)錄空泡(transcription bubble)的形成,原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象,RNA轉(zhuǎn)錄合成的終止機(jī)制有兩種： 1，內(nèi)在因子，非Rho

20、因終止子：轉(zhuǎn)錄的終止的特殊信號(hào)（一段RNA 序列） 2依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止： 由終止因子（因子）識(shí)別特異的終止信號(hào)，并促使RNA的釋放。,（三）轉(zhuǎn)錄終止：RNA 聚合酶停滯， RNA 解離,模板DNA鏈在接近轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)處存在相連的富含GC和AT的區(qū)域，使RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成寡聚U及發(fā)夾形的二級(jí)結(jié)構(gòu)，引起RNA聚合酶變構(gòu)及移動(dòng)停止，導(dǎo)致RNA轉(zhuǎn)錄的終止。,1非依賴Rho的轉(zhuǎn)錄終止：,莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理,使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓； 使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。,大腸桿菌兩類終止子的回文結(jié)構(gòu),A. 不依賴于Rho（）的終止子,A. 依賴于Rho（）的終止子,富含G-C,系列U,

21、ATP,2，依賴 Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止,DNA 序列缺乏共性，不能形成強(qiáng)的發(fā)卡結(jié)構(gòu),6聚體， 具有NTP酶 和解螺旋酶,原核轉(zhuǎn)錄和翻譯同時(shí)進(jìn)行,mRNA 翻譯起始： SD 序列:AUG上游的7-12 和核苷酸，AGGAGG 與16S RNA互補(bǔ) UCCUCC,真核生物的轉(zhuǎn)錄過程,1. 轉(zhuǎn)錄起始的上游區(qū)段：UAS 真核生物的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-35-25bp區(qū)也存在一段富含TA的順序，被稱為Hogness盒或TATA盒，通常認(rèn)為是啟動(dòng)子的核心序列。,（一）轉(zhuǎn)錄起始： 真核生物的啟動(dòng)子,除此之外，在真核生物中還可見到其他帶共性的序列，如 -80-70, CAAT盒(ccaat)及-110-80GC盒(

22、gggcggg)等。 TATA盒上游的序列：UAS, 在遠(yuǎn)離受控基因處存在的，能夠增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控序列稱為增強(qiáng)子（enhancer）。增強(qiáng)子特點(diǎn)：p79 遠(yuǎn)距離效應(yīng)；無方向性；順勢(shì)調(diào)控；廣泛性，相位性,真核生物啟動(dòng)子保守序列,參與轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)確定起始,控制轉(zhuǎn)錄起始頻率,真核生物中的RNA聚合酶可按其對(duì)-鵝膏蕈堿的敏感性而分為三種，它們均由1012個(gè)大小不同的亞基所組成，結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，其功能也不同。,真核生物的三種RNA聚合酶,真核生物RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄因子及其功能,真核轉(zhuǎn)錄起始需要各種轉(zhuǎn)錄因子,真核生物轉(zhuǎn)錄起始時(shí)，首先由TFD的TBP亞基識(shí)別并結(jié)合TATA盒，然后在其他轉(zhuǎn)錄因子的配合下，與RN

23、A聚合酶組裝形成轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物(pre-initiation complex, PIC)。,2. 轉(zhuǎn)錄起始過程：,RNA聚合酶催化第一個(gè)磷酸二酯鍵形成。 RNA聚合酶的羧基末端結(jié)構(gòu)域（CTD）被磷酸化修飾，大部分轉(zhuǎn)錄因子脫離，聚合酶向下游移動(dòng)延伸RNA鏈。,（二）轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng),真核生物轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過程與原核生物類似，但由于存在核小體的高級(jí)結(jié)構(gòu)，故在轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過程中可觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象。,（三）轉(zhuǎn)錄終止,真核生物轉(zhuǎn)錄終止與轉(zhuǎn)錄后修飾，即poly A尾巴結(jié)構(gòu)的添加密切相關(guān)。 在poly A修飾位點(diǎn)的下游存在一組共同序列AATAAA和GTGTGT，為轉(zhuǎn)錄終止的識(shí)別修飾位點(diǎn)。 在轉(zhuǎn)錄越過修飾點(diǎn)后，RN

24、A鏈在修飾點(diǎn)處被切斷，隨即進(jìn)行加帽和加尾修飾。,真核生物RNA的轉(zhuǎn)錄終止,5-AAUAAA-,5 -AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn),5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,4 真核生物的轉(zhuǎn)錄后修飾,Post-transcriptional Modification in Eukaryote,1加帽（adding cap）： 即在mRNA的5-端加上m7GTP的結(jié)構(gòu)。此過程發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，即HnRNA即可進(jìn)行加帽。 加工過程首先是在磷酸酶的作用下，將5-端的磷酸基水解，然后再加上鳥苷三磷酸，形成GpppN的結(jié)

25、構(gòu)，再對(duì)G進(jìn)行甲基化。,1、真核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工,（一）首、尾的修飾,2加尾（adding tail）： 這一過程也是細(xì)胞核內(nèi)完成，首先由核酸外切酶切去3-端一些過剩的核苷酸，然后再加入polyA。 polyA結(jié)構(gòu)與mRNA的半壽期有關(guān)。,The 3 ends of mRNAs are generated by cleavage and polyadenylation；The sequence AAUAAA is necessary for cleavage to generate a 3 end for polyadenylation.,（二）mRNA的剪接（splicing）,雞卵

26、清蛋白成熟mRNA與DNA雜交電鏡圖,mRNA,DNA,1. 斷裂基因（splite gene）,編碼區(qū) A、B、C、D,真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因。,外顯子(exon)和內(nèi)含子(intron),外顯子在斷裂基因及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達(dá)為成熟RNA的核酸序列（結(jié)構(gòu)基因中能夠指導(dǎo)多肽鏈合成的編碼順序）。 內(nèi)含子隔斷基因的線性表達(dá)而在剪接過程中被除去的核酸序列（不能指導(dǎo)多肽鏈合成的非編碼順序）。,核內(nèi)帶有外顯子和內(nèi)含子編碼序列的初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稱為雜化核RNA （he

27、tero-nuclear RNA, hnRNA）。 hnRNA經(jīng)剪接加工除去內(nèi)含子編碼序列并將外顯子編碼序列連接起來才能形成成熟的mRNA。,2. hnRNA和snRNA：,snRNA為核內(nèi)小RNA，富含尿嘧啶，故以U作分類和命名，如 U1、U2等。snRNA與核內(nèi)蛋白質(zhì)組裝形成小核蛋白體（snRNP），參與hnRNA的剪接加工。,3. hnRNA的剪接過程：, snRNP與hnRNA結(jié)合成為剪接體。, 剪接體結(jié)構(gòu)調(diào)整，U2和U6形成催化中心，發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。,pG-OH (ppG-OH, pppG-OH),剪接過程的二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng),I 型內(nèi)含子,II 型內(nèi)含子,線粒體與葉綠體的rRNA 中 無需

28、自由Gpp 使用自身2-OH 進(jìn)行攻擊 :(有酶催化活性的RNA分子命名為Ribozyme )!,雞卵清蛋 白基因,hnRNA,首、尾修飾,hnRNA剪接,成熟的mRNA,雞卵清蛋白基因及其轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾,4. mRNA的編輯和修飾,RNA的編輯(RNA editing): 某些RNA，特別是mRNA的一種加工方式，它導(dǎo)致了DNA所編碼的遺傳信息的改變（如 單堿基突變） RNA的修飾（RNA modification）： 有些RNA，特別是前體rRNA和tRNA可能有特異性的化學(xué)修飾。,RNA的編輯 :mRNA編輯是在mRNA水平上信息發(fā)生改變(堿基取代、插入或缺失)的過程。,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞

29、中，mRNA中有時(shí)會(huì)發(fā)生單個(gè)堿基的替換，導(dǎo)致它所編碼的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變。在錐蟲線粒體中，當(dāng)堿基有條理地增加或缺失時(shí)，在一些基因的轉(zhuǎn)錄物中會(huì)發(fā)生更大范圍的變化。 mRNA編輯機(jī)理：非剪切作用改變mRNA。,堿基取代,如哺乳動(dòng)物載脂蛋白B mRNA的編輯：載脂蛋白B的mRNA含29個(gè)外顯子，有4563個(gè)code，第2153號(hào)code是CAA，在肝中mRNA 編碼4563AA的蛋白，小腸中存在的脫氫酶使C脫氫，將CAAUAA，小腸的mRNA中編輯產(chǎn)生UAA使翻譯停止在2153code處。,Apo100,Apo48:形成CM:乳糜顆粒,堿基的插入或缺失和移碼,移碼：錐蟲coxII(cytochrom

30、eoxidase,細(xì)胞色素氧化酶II)基因的mRNA相對(duì)于其DNA序列出現(xiàn)了讀碼框的偏移，通過插入4個(gè)U，才能產(chǎn)生正確的讀碼框。,插入或缺失：錐蟲線粒體的細(xì)胞色素氧化酶III mRNA序列分析表明，許多U并非在DNA中編碼（紅色）或在RNA中被除掉（用T表示）。這些U的專一性插入信息是由向?qū)NA(guide RNA)提供的，向?qū)NA含有和正確編輯的RNA互補(bǔ)的一段序列。,尿嘧啶殘基的添加或刪除過程：首先RNA切斷，添加或去除尿嘧啶，最后進(jìn)行末端連接。該反應(yīng)在向?qū)NA的指導(dǎo)下由一個(gè)酶復(fù)合體催化完成的。,二、tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工,主要有以下幾種加工方式： 切斷。 剪接。 3-末端-CCA序列添加。 化學(xué)修飾。,tRNA前體,RNA pol ,tRNA前體的轉(zhuǎn)錄合成,tRNA前體的切斷和剪接加工,tRNA3-末端-CCA序列的添加,tRNA的堿基修飾,三、rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工,真核生物中前體包括了18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA序列。在高等真核生物中，前體以沉降速率來命名，命名為45SRNA，在低等真核生物中，它比較小（如酵母中為35S）,rRNA前體的轉(zhuǎn)錄和剪接加工,原核生物中前體包括了16S rRNA、23S rRNA和5S rRNA和tRNA序列。前體為30S RNA。,RNA生物功能的多樣性,1、RNA在遺傳信息的翻譯中起著決定作用。 2、RNA