感染性疾病的分子診斷.ppt

1、感染性疾病的分子診斷,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),二、耐藥監(jiān)測(cè)與分子流行病學(xué)調(diào)查,三、醫(yī)院獲得性感染的監(jiān)測(cè)與控制,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)在感染性疾病中的應(yīng)用主要包括對(duì)病原生物進(jìn)行鑒定、分型、耐藥診斷和治療過程中的療效監(jiān)測(cè)等 檢測(cè)核酸分子或蛋白質(zhì)分子 目前已經(jīng)應(yīng)用于一些重要的感染性疾病，如結(jié)核病、病毒性肝炎、艾滋病、SARS、人禽流感等,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),（一）結(jié)核分枝桿菌,（二）乙型肝炎病毒,（三）人類免疫缺陷病毒,（四）SARS冠狀病毒,（五）人禽流感病毒,結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)，俗稱結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原菌?？汕址溉?/p>

2、身各器官，但以肺結(jié)核為最多見。結(jié)核病至今仍為重要的傳染病。估計(jì)世界人口中1/3感染結(jié)核分枝桿菌。據(jù)WHO報(bào)道，每年約有800萬新病例發(fā)生，至少有300萬人死于該病。我國(guó)建國(guó)前死亡率達(dá)200-300人/10萬，居各種疾病死亡原因之首，建國(guó)后人民生活水平提高，衛(wèi)生狀態(tài)改善，特別是開展了群防群治，兒童普遍接種卡介苗，結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率大為降低。但應(yīng)注意，世界上有些地區(qū)因艾滋病、吸毒、免疫抑制劑的應(yīng)用、酗酒和貧困等原因，發(fā)病率又有上升趨勢(shì)。,（一）結(jié)核分枝桿菌,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),（一）結(jié)核分枝桿菌,1.生物學(xué)特性與致病性,2.基因組特點(diǎn),3.結(jié)核分枝桿菌核酸的檢測(cè),（一）結(jié)核分枝桿菌

3、,1.生物學(xué)特性與致病性 結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群包括人結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌，其中前三者對(duì)人類致病 人型結(jié)核分枝桿菌感染的發(fā)病率最高,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，增殖一代需1520小時(shí)，生長(zhǎng)成可見菌落一般需46周 在組織細(xì)胞內(nèi)大量繁殖引起炎癥，菌體成分和代謝物質(zhì)的毒性以及菌體成分誘發(fā)的機(jī)體免疫損傷,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),2.基因組特點(diǎn) 共價(jià)封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu) 標(biāo)準(zhǔn)株結(jié)核分枝桿菌基因組全長(zhǎng)4.4kb,包含4000個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因和50個(gè)RNA編碼基因,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),(1)重復(fù)序列：如IS61

4、10，僅存于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群細(xì)菌染色體上長(zhǎng)1355bp的重復(fù)插入序列，具有復(fù)合群特異性 (2)蛋白質(zhì)編碼基因 (3)rRNA基因：每個(gè)細(xì)胞約含有103104 個(gè)rRNA，含有結(jié)核分枝桿菌高度保守的序列，也有分枝桿菌種特異性序列,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),3.結(jié)核分枝桿菌核酸的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)室檢查手段主要包括標(biāo)本直接涂片染色鏡檢、分離培養(yǎng)鑒定以及血清學(xué)抗原檢測(cè)方法 分子生物學(xué)理論和技術(shù)已經(jīng)用于分枝桿菌的分子結(jié)構(gòu)和功能的研究中，并開始用于臨床菌種和耐藥株的鑒定及監(jiān)測(cè),一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),PCR菌種鑒定法 PCR直接測(cè)序鑒定法 PCR-DNA探針鑒定法 PCR-基因芯片法,(1)結(jié)核

5、分枝桿菌菌種鑒定：,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),(2)藥物敏感性試驗(yàn)與耐藥基因檢測(cè)： 縮短培養(yǎng)和鑒定的時(shí)間，及時(shí)指導(dǎo)臨床選藥 藥物敏感性試驗(yàn) 直接檢測(cè)耐藥基因,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),（二）乙型肝炎病毒,1.生物學(xué)特性及致病性,2.乙型肝炎病毒核酸的檢測(cè),3.變異株與耐藥突變檢測(cè),乙型肝炎病毒簡(jiǎn)稱乙肝病毒。是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科（hepadnavividae）。 根據(jù)目前所知，HBV就只對(duì)人和猩猩有易感性，引發(fā)乙型病毒性肝炎疾病。完整的乙肝病毒成顆粒狀，也會(huì)被稱為丹娜顆粒（Dane）。1965年由丹娜發(fā)現(xiàn)。直徑為42納米。顆粒分為外殼和核心兩部分。,（二）乙型肝炎病

6、毒,1.生物學(xué)特性及致病性 HBV對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，且傳染性較強(qiáng) 輸血或注射是重要的傳播途徑 HBV感染后潛伏期約26個(gè)月，HBV DNA在肝細(xì)胞內(nèi)以游離DNA和整合到宿主細(xì)胞染色體的方式存在 HBV分為8個(gè)基因型，AH型,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),2.乙型肝炎病毒核酸的檢測(cè),（1）熒光定量PCR技術(shù)：測(cè)定HBV病毒載量 HBV DNA 107拷貝/毫升，提示病毒復(fù)制活躍 HBV DNA 103拷貝/毫升、HBeAg轉(zhuǎn)為陰性， 正常的病人預(yù)后相對(duì)較好,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),（2）支鏈DNA（bDNA）技術(shù)： 一種核酸探針雜交標(biāo)志信號(hào)放大技術(shù) 。 優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，

7、結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單， 將待測(cè)病毒裂解釋放核酸后變性為單鏈，即 可進(jìn)行檢測(cè) 。 缺點(diǎn)：敏感性較低、檢測(cè)范圍窄而不適用于低水平病 毒的檢測(cè) 。,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),還可以用于乙肝病毒基因檢查的方法主要有：熒光PCR法、競(jìng)爭(zhēng)PCR法、PCR酶聯(lián)免疫吸附法、熒光標(biāo)記物法和PCR酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光等方法。,3.變異株與耐藥突變檢測(cè),HBV可能發(fā)生自然變異 HBV在人體活疫苗接種和抗病毒治療等壓力下發(fā)生變異 HBV基因組的變異常引起病毒生物學(xué)特性的改變，從而導(dǎo)致HBV感染發(fā)病機(jī)制的變化、血清學(xué)檢測(cè)指標(biāo)的改變以及免疫逃逸，給乙型肝炎的診斷和治療帶來困難,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),HBV耐藥突變類

8、型及其核苷酸、氨基酸變化,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),（三）人類免疫缺陷病毒,1.形態(tài)結(jié)構(gòu)與致病性,2.HIV核酸檢測(cè),人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV），顧名思義它會(huì)造成人類免疫系統(tǒng)的缺陷。1981年，人類免疫缺陷病毒在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)。它是一種感染人類免疫系統(tǒng)細(xì)胞的慢病毒（Lentivirus），屬反轉(zhuǎn)錄病毒的一種。至今無有效療法的致命性傳染病。該病毒破壞人體的免疫能力，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的失去抵抗力，而導(dǎo)致各種疾病及癌癥得以在人體內(nèi)生存，發(fā)展到最后，導(dǎo)致艾滋病（獲得性免疫缺陷綜合征）。,（三）人類免疫缺陷病毒,1.形態(tài)結(jié)構(gòu)與致病性 HIV根據(jù)血

9、清學(xué)反應(yīng)和病毒核酸序列分為 HIV-1型、HIV-2型 HIV結(jié)構(gòu)分為 包膜、核心,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),HIV直接或間接損傷CD4+T細(xì)胞 HIV抑制抗原遞呈細(xì)胞功能 HIV誘發(fā)自身免疫性疾病及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 HIV導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞喪失抗病毒活性等,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),HIV感染以侵犯CD4+T細(xì)胞為主,原位雜交 PCR NASBA技術(shù) bDNA技術(shù) 熒光定量RT-PCR技術(shù),一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),2.HIV核酸的檢測(cè)的分子生物學(xué)方法,（四）SARS冠狀病毒,從SARS病人體內(nèi)分離到的冠狀病毒與任何以往確定特征的冠狀病毒關(guān)系不密切，且該病毒的有限區(qū)域的復(fù)制酶（

10、rep）基因序列與其它冠狀病毒明顯不同，因而被稱為SARS相關(guān)冠狀病毒。,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),SARS相關(guān)冠狀病毒的檢測(cè) WHO推薦SARS-CoV特異性檢測(cè)方法： 分子生物學(xué)檢測(cè) 免疫學(xué)檢測(cè) 細(xì)胞分離培養(yǎng),一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),免疫學(xué)方法難以在感染的窗口期對(duì)病毒感染進(jìn)行早期檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)所需時(shí)間較長(zhǎng)，分離陽性率不高 PCR方法可以確診早期疑似病人，但PCR試驗(yàn)陰性并不能說明沒有SARS-CoV感染,（五）人禽流感病毒,人禽流行性感冒（簡(jiǎn)稱人禽流感）是由禽甲型流感病毒某些亞型的毒株引起的急性呼吸道傳染病，感染者大多因多臟器功能衰竭而死亡 。

11、,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),近年來，由H5N1亞型禽流感病毒引起的疫情廣泛傳播對(duì)人類的健康造成全球性的重大威脅。由于病毒的不斷變異，開發(fā)新型抗流感藥物成為各國(guó)極為迫切的重大課題。其中，揭示與流感病毒密切相關(guān)的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)不僅對(duì)揭示流感病毒復(fù)制機(jī)制具有重要科學(xué)意義，而且對(duì)開發(fā)抗流感病毒藥物具有重要價(jià)值。最近，由中科院生物物理研究所劉迎芳研究員領(lǐng)導(dǎo)的研究組和饒子和院士領(lǐng)導(dǎo)的研究小組在這一領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展，他們?cè)趪?guó)際上率先揭示了流感病毒聚合酶關(guān)鍵部分PA亞基與PB1多肽復(fù)合體的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)。,（五）人禽流感病毒,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),1.病原學(xué)特征及致病性,2.人禽流感病毒的檢

12、測(cè),一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),1.病原學(xué)特征及致病性 禽流感病毒屬甲型流感病毒，基因組為單股負(fù)鏈RNA 依外膜血凝素（H）和神經(jīng)氨酸酶（N）蛋白抗原性的不同，可分為15個(gè)H亞型和9個(gè)N亞型 感染人的禽流感病毒亞型主要為H5N1、H9N2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情最重,一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè),2.人禽流感病毒的檢測(cè) (1) 病毒核酸檢測(cè)：RT-PCR技術(shù)從病人呼吸道 標(biāo)本中檢測(cè)禽流感病毒亞型特異性H抗原基因。 (2) 病毒抗原蛋白質(zhì)分子檢測(cè)：取病人呼吸道 標(biāo)本采用免疫熒光法檢測(cè)甲型流感病毒核蛋白抗原 及禽流感病毒H亞型抗原 。,二、 耐藥監(jiān)測(cè)與分子流行病學(xué)調(diào)查,（一）耐

13、藥突變檢測(cè),（二）分子流行病學(xué)調(diào)查,二、 耐藥監(jiān)測(cè)與分子流行病學(xué)調(diào)查,PCR-RFLP SSCP DGGE PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù) DNA序列分析 芯片技術(shù)等,（一）耐藥突變檢測(cè),二、 耐藥監(jiān)測(cè)與分子流行病學(xué)調(diào)查,追蹤和控制傳染源及可能的傳播途徑 確定同一病人反復(fù)感染是源于復(fù)發(fā)或再感染 明確某一菌株是否與某些臨床表現(xiàn)相關(guān)，從而發(fā)現(xiàn)其特殊的傳播和致病機(jī)制,（二）分子流行病學(xué)調(diào)查,二、 耐藥監(jiān)測(cè)與分子流行病學(xué)調(diào)查,1.IS6110 RFLP,2.間隔區(qū)寡核苷酸探針分型技術(shù),二、 耐藥監(jiān)測(cè)與分子流行病學(xué)調(diào)查,1.IS6110 RFLP（限制性片斷長(zhǎng)度的多態(tài)性 ） IS6110重復(fù)序列探針被稱為結(jié)核

14、分枝桿菌復(fù)合 群分型的金標(biāo)準(zhǔn)。 檢測(cè)步驟： 細(xì)菌培養(yǎng) 提取基因組DNA Pvu限制性酶水解 Southern印跡 IS6110探針雜交,IS6110-RFLP分型方法要比基于PCR的分型方法需較多的菌株材料，以產(chǎn)生足夠的DNA用于分析。這要求基因分型實(shí)驗(yàn)室將菌株接種到培養(yǎng)基中，然后等待足夠的培養(yǎng)物長(zhǎng)出。與PCR方法（MIRU和spoligotyping分析）不同的是，RFLP分析不能在非活性培養(yǎng)物上進(jìn)行。,二、 耐藥監(jiān)測(cè)與分子流行病學(xué)調(diào)查,2.間隔區(qū)寡核苷酸探針分型技術(shù) 直接重復(fù)序列只在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群細(xì)菌染色體的某一位置出現(xiàn)，由多個(gè)高度保守的36bp的序列組成，其間被高度保守的3441bp

15、非重復(fù)的短序列間隔開 36bp重復(fù)序列出現(xiàn)的次數(shù)和某些間隔序列的出現(xiàn)或消失，在不同菌株表現(xiàn)出可變性,三、醫(yī)院獲得性感染的監(jiān)測(cè)與控制,醫(yī)院感染，又稱院內(nèi)感染，是指病人入院時(shí)尚未感染，也不處于感染的潛伏期，而是在入院以后（通常指入院48小時(shí)后）引起的感染，以及在醫(yī)院內(nèi)獲得但在出院后才發(fā)生的感染,一、與院內(nèi)感染有關(guān)的因素,（一）機(jī)體因素 一般病人均處于抵抗力低下狀況，幾乎所有傳染因子均可引起院內(nèi)感染。一個(gè)病人的正常或條件致病菌感染可以轉(zhuǎn)給其他病人。尤其是新生兒免疫機(jī)制尚未成熟，老年人隨年齡增長(zhǎng)發(fā)生生理改變，故危險(xiǎn)性大。,（二）應(yīng)用某些診斷或治療手段 這些人往往對(duì)院內(nèi)感染易感性增加。例如外科手術(shù)后保留導(dǎo)管（尤其是靜脈內(nèi)和膀胱內(nèi)）、氣管插管或切開、輸血、麻醉、使用免疫抑制藥物、抗生素等。,（三）醫(yī)院中病人集聚 各類病人密集程度和相互接觸機(jī)會(huì)決定了院內(nèi)感染發(fā)生的可能性。醫(yī)院內(nèi)耐藥菌株常多。一般衛(wèi)生狀況不良為院內(nèi)感染創(chuàng)造條件。,二、院內(nèi)感染的種類 （一）交叉感染（cross infection） 交叉感染是在醫(yī)院內(nèi)獲得而引起的微生物感染。