基因工程制藥新版.ppt

1、第三節(jié) 基因工程制藥生產的基本過程,一、工具酶的分離純化 二、載體的分離純化 三、外源DNA和目的基因的分離和獲得 四、外源DNA與載體DNA的切割與連接 五、宿主細胞的選擇和基因導入操作 六、基因工程菌的穩(wěn)定性及生長代謝的特點 七、基因工程菌中試 八、基因工程菌的擴增和發(fā)酵生產 九、基因工程藥物的分離和純化技術 十、變性蛋白的復性 十一、基因工程藥物的質量控制 十二、基因工程藥物的制造實例,血紅蛋白基因,血紅蛋白基因排列順序,血紅蛋白的結構,血紅蛋白的運送氧氣功能,血紅蛋白的基因工程流程,一、工具酶的分離純化,（一）基因工程制藥所用到的工具酶 （二）關于限制酶 （三）關于連接酶,（一）基因工

2、程制藥所用到的工具酶,限制性內切酶 甲基化酶 Klenow聚合酶T4-DNA聚合酶 T4-多核苷酸激酶堿性磷酸酶 核酸酶-S1核酸酶-Bal31 綠豆核酸酶 核糖核酸酶 人外切核酸酶DNA酶-1 外切RNA酶-III外切RNA酶-VI DNA聚合酶1 T4-DNA連接酶 末端脫氧核苷酸轉移酶T4-RNA連接酶 逆轉錄酶 大腸桿菌-DNA連接酶,（二）關于限制酶,1、宿主限制現象 2、限制酶的定義 3、限制酶的特征 4、限制酶的作用 5、基因工程所用到的限制酶 6、影響限制酶作用的因素,1、宿主限制現象,病毒或噬菌體在宿主A細胞中生長良好,但在宿主B細胞中生長很差,原因是它的DNA受到宿主B的限

3、制,這種現象是宿主控制性限制 （restriction）與修飾(modification) ,簡稱（R/M體系）。 細菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來的DNA，并能使后者降解掉。,R/M體系： 是由兩種酶活性配合完成的： 一種是修飾的甲基轉移酶 另一種是核酸內切限制酶,E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶,當(k)噬菌體侵染E.coliB時，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉移給限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化

4、。 EcoB(大腸桿菌B株)的核酸酶不能識別已甲基化 的序列。,R/M體系的作用： 保護自身的DNA不受限制； 破壞外源DNA使之迅速降解,ECOB核酸酶,甲基化酶,CH3,CH3,CH3,CH3,噬菌體來源序列,宿主來源序列,限制性內切酶本是微生物細胞中用于專門水解外源的一類酶，其功能是避免外源的干擾或噬菌體的感染，是細胞中的一種防御機制。 由于R/M現象的發(fā)現使得核酸內切酶成為基因工程重要的工具酶。,2、限制酶的定義,凡是能夠識別和切割DNA分子內特定核苷酸順序的酶稱為限制酶。限制酶分為三個類型： （1）型限制酶-由于其切點不固定，很難形成特異性的切割末端。 （2）型限制酶-是位點特異性酶

5、，是基因工程理想的工具酶。 （3）型限制酶-對DNA的識別與切割點不同，不產生特異性DNA片段。,3、限制酶的特征,具有專一性的識別位點。 能夠形成固定的核苷酸單鏈末端。 比較適合于進行DNA結構的分析和進行基因重組。,4、限制酶的作用,（1）進行DNA重組。 （2）構建新載體。 （3）構建基因文庫。 （4）進行DNA序列分析。 （5）制備DNA放射性探針。,5、基因工程所用到的限制酶,通常是型限制酶，具體有以下幾種。 EcoR-IHind-IIIBamH-I Pst-I Sst-ISal-I Ava-I Bcl-IHind-II Hpa-I Bgl-II Cla-I Hae-IIIHha-I

6、Hinf-I Hpa-IIMbo-ISma-I Xba-I Xho-I,6、影響限制酶作用的因素,（1）DNA的純度 （2）DNA的甲基化程度 （3）DNA的結構 （4）反應的溫度-最適溫度為37度 （5）反應的緩沖體系-反應體系中通常含有MgCl2、NaCl、KCl、-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、牛血清白蛋白。它們具有激活酶、穩(wěn)定酶的作用。,（三）關于連接酶,1、定義-凡是能夠催化DNA片段5-末端的磷?；c3-末端的羥基結合成磷酸二酯鍵的酶，稱為連接酶。 2、作用-主要用于（1）正常DNA的合成。（2）損傷DNA的修復。 3、種類（1）DNA-連接酶-廣泛存在于生物細胞之中，主要取自于大腸桿菌E

7、.coli。（2）T4-DNA連接酶-來自于經過T4-噬菌體感染的大腸桿菌E.coli。 （3 T4-RNA連接酶-催化單鏈DNA或RNA的5磷酸與另一單鏈DNA或RNA的3羥基之間形成共價連接。,二、基因工程載體的分離純化,（一）定義 （二）基因工程載體的必備條件 （三）基因工程載體的種類,（一）定義,能夠將目的基因攜帶進宿主細胞、并可使得目的基因能夠在宿主體內進行自主性復制的遺傳因子，稱為基因工程載體。,（二）基因工程載體的必備條件,（1）具有有效運載能力。（2）載體自身能夠獨立復制，并且在宿主體內進 行自主性復制。（3）載體在攜帶目的基因之后，還能夠在宿主體內進行自主性復制。（4）在宿主

8、體內，能夠控制外源基因的表達活動。（5）能夠攜帶大小不同的外源性目的基因。（6）鑒定方便、裝卸技術簡單。（7）容易控制、安全可靠。,（8）應具有靈活的克隆位點、并且有方便的篩選標記。（9）應具有很強的啟動子。（10）應具有阻遏子，使啟動子受到控制，因為外源基因的高效表達會抑制宿主細胞的生長、增殖，而阻遏子可使宿主細胞免受這種影響。（11）應具有很強的終止子，以便重點克隆外源基因區(qū)段，而不轉錄其它無關基因。（12）所產生的mRNA必須具有翻譯的起始信號，即含有起始密碼AUG和SD序列，以便轉錄之后能夠順利于進行翻譯。,（三）基因工程載體的種類,1、細菌質粒 2、真核基因病毒DNA 3、噬菌體DN

9、A 4、單鏈DNA噬菌體M13載體 5、人工質粒載體-科斯質粒 6、酵母人工染色體 7、其他載體,1、細菌質粒,（1）質粒的定義 （2）質粒的特性 （3）質粒的分類 （4）質粒載體的具備條件 （5）常用的細菌質粒,（1）質粒的定義,存在于天然細菌體內的一種獨立于細菌染色體之外的雙鏈環(huán)狀DNA，具有獨立復制的能力，常帶有細菌的抗藥基因。也存在于某些真核細胞（酵母的2環(huán)狀質粒）,質粒載體(plasmid),（2）質粒的特性,獨立于細菌染色體之外的環(huán)狀DNA或RNA。 其遺傳特性屬于非染色體控制。 能夠進行自我復制。 容易在宿主體內進行轉移和遷移。 可編碼宿主染色體所不具有的基因。能夠賦予宿主額外的

10、遺傳特性：A、編碼產生抗生素酶的抗性基因，B、編碼產生糖酵解酶系的基因，C、編碼產生抗重金屬酶的抗性基因。,質粒的復制類型,嚴謹型（strigent plasmid)： 復制與宿主染色體同步受宿主染色體復制的限制，在宿主細胞中拷貝數低約份拷貝。,松弛型（relaxed plasmid): 復制不受宿主染色體復制的 限制可獨立復制，在宿主細胞中拷 貝數高，宿主細胞中質粒有10-200拷貝?；蚬こ坛Ｓ幂d體。,質粒DNA的構型,三種不同的構型： 當其兩條核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結構時，稱為共價閉合環(huán)形DNA(cccDNA)，這樣的DNA通常呈現超螺旋的SC構型； 如果兩條多核苷酸鏈中只有一條保持

11、著完整的環(huán)形結構，另一條鏈出現有一至數個缺口時，稱之為開環(huán)DNA(ocDNA)； 若質粒DNA的雙鏈均發(fā)生斷裂而形成線形分子，則通稱為L構型。,共價閉合環(huán)形DNA （SC型）,開環(huán)DNA （oc型）,線性DNA （L型）,環(huán)形雙鏈的質粒DNA分子具有三種不同構型,（3）質粒的分類,F質粒-可使宿主A的部分基因隨著F質粒一起轉移到不存在該質粒的另一宿主B的體內。 R質粒-可編碼宿主A的一種或者數種抗生素抗性基因，并能夠將它們帶到不存在該質粒的另一宿主B的體內，使得宿主B也獲得同樣的抗性。 Col質粒-能編碼大腸桿菌毒素基因，通過表達之后產生的大腸桿菌毒素可以使得不帶Col質粒的其它菌株死亡。,（

12、4）質粒載體具備條件,質粒載體，也稱質?？寺≥d體，是指用于實現基因工程操作的質粒。必須具備以下條件： （1）其分子結構中必須具有多個單一限制酶的切割位點。 （2）構建重組質粒之后必須具有轉化功能。 （3）分子量較小，易于操作。 （4）宿主范圍較為單一、無感染性。,（5）常用的細菌質粒,pBR322pBH10pBH20 pTR262pAT153pXf3 Pmk16pGEM-3ZpUC19 A、pBR322質粒 B、pUC19質粒 C、pGEM-3Z 質粒,A、 pBR322質粒, 4363 bp 含一個復制點 含一個抗氨卞青霉素基因(ampR) 一個抗四環(huán)素基因 (tetR) ampR和tetR

13、抗性基因內各有一些限制酶的酶切位點，供外源基因插入 當外源基因插入抗藥基因內，抗藥基因失活。AmpRAmp敏感(AmpS )、TetRTet敏感(TetS).,pBR322:人工構建重要質粒,優(yōu)點：具有較小的分子量 具有兩種抗生素抗性基因，作為篩選標記 具有高拷貝數 是松弛型質粒,B、 pUC系列質粒,由pBR322和M13噬菌體構建而成的雙鏈質粒載體； （1） 2674bp； （2） 有ampR和位于lacZ+ 基因中靠近5端多克隆位點(MCS)和來源于pBR322質粒的復制起始點 （3）大腸桿菌-半乳糖苷酶(lacZ)的啟動子及其編碼該基因氨基端-肽鏈的DNA序列,此結構特稱為lacZ+基

14、因，便于藍白篩選,pUC質粒優(yōu)點： 具有更小的分子，更高的拷數 適于組織化學檢測重組體,C、 pGEM-3Z質粒,含一個ampR基因和一個lacZ編碼基因; 有多克隆位點（MCS）; 正選擇顏色標記 lacZ; 有兩個來自噬菌體的強啟動子PT7和PSP6,用于外源基因的高效表達,注意：T7和SP6啟動子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識別，因此相應的受體菌必須表達噬菌體RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等,2743 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,pGEM-3Z,PSP6,2、真核基因病毒DNA,（1）病毒載體的優(yōu)點 （2）已經研究的真核基因病毒DNA

15、,（1）病毒載體的優(yōu)點,A、具有很高的拷貝數量。 B、有強大的啟動子。 C、可保證目的基因的高效表達。,（2）已經研究的真核基因病毒DNA,A、SV40病毒DNA B、牛乳頭瘤病毒 C、RNA病毒 D、昆蟲桿狀病毒 E、人痘病毒DNA F、猴空泡病毒DNA G、人腺病毒DNA H、人牛痘病毒DNA I 、逆轉錄病毒載體,A、SV40病毒DNA,（A1）、 SV40病毒DNA的特性 （A2）、SV40病毒DNA的基因組 （A3）、SV40病毒DNA載體的構建 （A4）、SV40病毒DNA載體的使用方法,（A1）、SV40病毒DNA的特性,為環(huán)狀雙螺旋結構。其宿主為動物細胞。 SV40病毒有二種表

16、達方式：（1）游離表達方式，SV40DNA+外源性DNA，形成重組DNA，進入宿主體內，以重組DNA的方式表達。（2）結合表達方式，重組DNA整合到宿主染色體的DNA之中，與染色體基因一起表達。,（A2）、SV40病毒DNA的基因組,（A3）、SV40病毒DNA載體的構建,（A4）、SV40病毒DNA載體的使用方法,G、腺病毒,（G1）、腺病毒DNA載體 （G2）、腺病毒DNA載體的特點,3、噬菌體DNA,（1） 噬菌體DNA的特性 （2） 噬菌體DNA的改造 （3） 噬菌體DNA的體外包裝 （4） 噬菌體載體的構建 （5） 噬菌體載體的使用 （6） 噬菌體載體的優(yōu)點,（1）噬菌體DNA的特性

17、,噬菌體DNA為雙鏈的DNA病毒，宿主是大腸桿菌。 已發(fā)現噬菌體DNA可編碼61個基因。 A、噬菌體DNA在宿主體內的生活方式 B、噬菌體DNA的結構,A、噬菌體DNA在宿主體內的生活方式,（1）溶源方式：噬菌體DNA整合到大腸桿菌的DNA中，伴隨大腸桿菌DNA的復制而復制，這種方式是噬菌體DNA作為基因工程載體的理論依據。 （2）溶菌方式：噬菌體感染大腸桿菌后，終止了大腸桿菌染色體DNA所控制的遺傳信息表達，并進一步分解大腸桿菌DNA，最后導致大腸桿菌完全溶解。,B、噬菌體DNA的結構,噬菌體基因組,基因組長度：約為50kb的雙鏈DNA分子，實際大小為48502bp。 DNA是線狀雙鏈分子帶

18、有單鏈的互補末端，末端長12個核苷酸，稱為粘性末端（cos序列）。當噬菌體感染宿主細胞后，雙鏈DNA分子通過cos而成環(huán)狀。 61個基因，每個基因平均為1000bp，其中32個較為重要，它們的分布和排列與其功能有一定關系。 基因組分為二部分：（1）其中一半基因，控制著生命活動周期。（2）另一半基因，可被外源性目的基因所取代， 而不影響噬菌體的生命活動。,基因組分為幾個不連續(xù)的區(qū)域，三個片段組成：,（1）左臂，19.6kb，含噬菌體頭、尾蛋白質編碼基因，AJ的12基因都是構成外殼蛋白的基因。 （2）中央片段，12kb24kb，含PL控制red和gam基因。 （3）右臂，9kb11kb，含DNA復

19、制和溶菌有關蛋白編碼基因。與裂解有關的S和R基因、與DNA復制有關的O基因和P基因等分別聚集在一起。 噬菌體左右兩臂包含了復制和成熟所必須的全部機能蛋白編碼，而中央片段為非必需區(qū)，即位于J基因和N基因之間的片段可被其他大腸桿菌DNA片段所替換。,噬菌體基因組,非必需區(qū),（2）噬菌體DNA的改造,野生型噬菌體DNA分子較大，其結構基因也很復雜，并且常常容納不下分子量更大的外源性目的基因DNA片段。需要對其進行改造。 改造方法： （1）遺傳學方法-將噬菌體DNA交替地在不含質粒的大腸桿菌、和含質粒的大腸桿菌的宿主內生長，來刪去其過多的限制酶位點。 （2）體外刪除法-將噬菌體DNA在體外進行限制酶消

20、化，再將未被切割部分經過蛋白質包裝后，去感染大腸桿菌。經過幾代連續(xù)培養(yǎng)之后，噬菌體DNA就會失去不需要的限制酶位點。,（3）噬菌體DNA的體外包裝,A、體外包裝的作用 B、噬菌體DNA包裝的原理 C、噬菌體DNA的包裝過程,A、體外包裝的作用,噬菌體DNA連接上外源性目的基因，就成為重組DNA分子，但是，重組之后的DNA分子必須經過包裝，加上蛋白質外殼形成完整的病毒顆粒，才具有感染宿主的能力。,B、噬菌體DNA包裝的原理,噬菌體DNA的頭部蛋白+重組DNA分子+噬菌體DNA尾部蛋白，在適當條件下混合，就能夠自動地包裝成完整的噬菌體病毒顆粒。,（4）噬菌體載體的構建,（A） 縮短長度 （B） 改

21、造酶切位點 （C） 增加選擇標記,（A） 縮短長度,插入型載體：,失去了非必需區(qū) 僅保留了EcoR的單一切點 切點又位于報告基因上，故在切開DNA并插入外源基因后，報告基因失活，即可依此進行重組體的篩選 可插入長度為10kb的外源DNA,只含一個限制性位點可供插入外源DNA的載體，這類噬菌體載體稱插入型載體。,注意：噬菌載體作為載體，其重組噬菌體DNA大小只能： 37kb 51kb。,噬菌體載體是主要用于cDNA文庫構建，也經常用于外源目的基因的克隆。,置換型載體,置換型載體：可被外源DNA置換的噬菌體非必需區(qū)兩側有一對限制性酶切位點的載體，稱為置換型載體。適用基因組克隆,特殊性質：中間區(qū)域約

22、長18kb，這一段DNA可以被外源置換而不會影響phage裂解生長的能力。 包裝限制： phage頭部外殼蛋白容納DNA能力上限105%，下限75%。包裝范圍51kb, 36kb.只有DNA的長度大于野生型phage DNA長度的75而不超過其105時，才能被包裝成phage顆粒，當DNA的長度短于野生型的75%或超過105%時，phage活性就急劇下降，故要求載體DNA和外源DNA長度之和在3651kb之間。 載體必要區(qū)是28kb,理論上克隆能力為23kb.,（B） 改造酶切位點,野生型的-DNA鏈上有5個EcoRI位點和7個HindIII位點，不利于重組操作，必須刪除至1 - 2個。 為了

23、便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點。,（C） 增加選擇標記,加裝選擇標記 lacZ,（5）噬菌體載體的使用,重組DNA的構建 (酶切，連接） 噬菌體的體外包裝 噬菌體侵染大腸桿菌 重組DNA的分離,（6）噬菌體載體的優(yōu)點,容量大，裝載能力可達23kb，便于構建基因文庫 重組子篩選較為方便 DNA提取操作較為簡便,4：單鏈DNA噬菌體M13載體,M13噬菌體（M13 phage）是一種大腸桿菌雄性特異絲狀噬菌體，遺傳物質是環(huán)狀單鏈DNA,全長約6.5kb。宿主是絲狀大腸桿菌。它是單鏈DNA噬菌體中的一個典型的代表。M13感染細菌后，經過復制轉變?yōu)殡p鏈的復制型（RF）。復

24、制型M13可用作克隆載體。 噬菌體M13感染宿主之后，在含有異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的X-gal培養(yǎng)基中生長時，會形成藍色噬斑。通過藍色噬斑的出現可以顯示噬菌體M13的存在。 感染宿主之后，噬菌體M13所釋放的單鏈DNA可用于制作放射性標記探針，用來檢測RNA的結構。,M13噬菌體的組成和結構,M13噬菌體顆粒是絲狀的，只感染雄性大腸桿菌。感染宿主后不裂解宿主細胞，而是從感染的細胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細胞仍能繼續(xù)生長和分裂。,M13噬菌體的外型呈絲狀,M13 噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成,M13 DNA全長6407個核苷酸,M13 DNA上至少有11個基因,2700個外殼蛋白

25、分子,M13 噬菌體不裂解宿主細胞，但抑制其生長,M13噬菌體的組成和結構,單鏈DNA，由6407堿基組成。 90%以上的序列可編碼蛋白質，共有11個編碼基因 基因間的間隔區(qū)多為幾個堿基。較大的間隔位于基因/以及基因/之間，其間有調節(jié)基因表達和DNA合成的元件。,M13噬菌體的基因組,M13噬菌體的基因組,編碼3類蛋白質： 復制蛋白（基因，和） 形態(tài)發(fā)生蛋白（基因，和） 結構蛋白（基因、和）,M13噬菌體載體的構建,M13噬菌體作為載體的重要特點： M13噬菌體的感染與釋放不會殺死宿主菌，僅導致宿主菌生長緩慢； M13噬菌體DNA在宿主菌內既可以是單鏈也可以是雙鏈，通過感染或轉化的方法能將M1

26、3噬菌體DNA導人宿主菌中； M13噬菌體的包裝不受DNA大小的限制，其噬菌體顆粒的大小可隨DNA的大小而改變，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能進行包裝。,M13噬菌體在用作載體時是利用其雙鏈狀態(tài)的RF DNA：單鏈DNA的酶切和連接是比較困難的。 外源片段插入位點在基因和基因之間的508bp間隔區(qū)-M13不像噬菌體基因組那樣含有較大的可替代區(qū)。它的基因組中絕大多數為必需基因，只有兩個間隔區(qū)可用來插入外源DNA（基因/和基因/之間）。,5：人工質粒載體-科斯質粒,1978年Collins和Hohn構建一種新型的大腸桿菌克隆載體，命名為cosmid(柯斯質粒)，又叫粘粒。 柯斯質粒（cosmid）= cos序列+質粒。 實際是質粒的衍生物，它是用正常的質粒同噬菌體的cos位點構成。 A、科斯質粒的基本組成 B、科斯質粒的特性 C、科斯質粒的用途,Cos質粒（考斯質粒 Cosmid）,A、科斯質粒的基本組成,（1）含有噬菌體DNA的粘性末端序列（COS序列）。 （2）含有質粒的一個復制起始區(qū)。 （3）含有質粒的一個抗藥性標記。 （4）具有多種限制性內切酶的單一性切點。,柯斯質粒pHC79系,由質粒pBR322和噬菌體的cos位點的一段DNA構成。 包裝時，cos位點打開而產生噬菌體的粘性末端。由于pHC79有pBR322DNA，所以也就有氨芐青霉素抗性和四環(huán)素抗