免疫學(xué)微生物學(xué)檢驗(yàn)高護(hù)2014

1、1,臨床免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷,實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),衛(wèi)蓓文 交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)系 Email: 63846590-776469,2,概述：免疫與疾病,3,免疫檢驗(yàn)可分為兩部分： 一部分為利用免疫檢測(cè)原理與技術(shù)檢測(cè)免疫活性細(xì)胞、抗原、抗體、補(bǔ)體、細(xì)胞因子、細(xì)胞粘附分子等免疫相關(guān)物質(zhì)； 另一部分是利用免疫檢測(cè)原理與技術(shù)檢測(cè)體液中微量物質(zhì)如激素、酶、血漿微量蛋白、血液藥物濃度、微量元素等。,臨床免疫學(xué)與免疫檢驗(yàn),免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展史,5,一、血清IgG、IgA、IgM 測(cè)定,IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，是血液和細(xì)胞外液中的主要抗體，也是機(jī)體再次免疫的主要抗體。成人5.6517.65g/L。 IgA分為血清型

2、和分泌型，是參與黏膜局部免疫的主要抗體，主要存在于胃腸道和支氣管分泌液、初乳、唾液和淚液中。成人0.4 3.5g/L。 IgM是分子量最大的免疫球蛋白，是個(gè)體發(fā)育過程中最早合成和分泌的抗體，也是抗原刺激誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體。成人0.53.0g/L。,6,測(cè)吸光度計(jì)算抗原或抗體的含量,抗體,抗原,免疫復(fù)合物的濃度與透射光的衰減呈正相關(guān),免疫比濁法原理,7,血清IgG、IgA、IgM測(cè)定的臨床意義,低Ig血癥:先天性低Ig血癥（免疫缺陷?。?獲得性低Ig血癥(蛋白丟失) 高Ig血癥:多克隆Ig增高（感染） 單克隆Ig增高（免疫增殖?。?8,血清IgD、IgE測(cè)定,正常人血清中IgD含

3、量很低，膜結(jié)合型IgD(mIgD)構(gòu)成BCR，是B細(xì)胞分化發(fā)育成熟的標(biāo)志。 IgE是正常人血清中含量最少的免疫球蛋白，主要由黏膜下淋巴組織中的漿細(xì)胞分泌，為親細(xì)胞抗體，引起I型超敏反應(yīng)；與機(jī)體抗寄生蟲免疫也可能有關(guān)。成人0.1 0.9mg/L。,9,ELISA,原理（Principle）：將抗原或抗體結(jié)合到某固相載體表面，保持其免疫活性，測(cè)定時(shí),把被測(cè)樣品和結(jié)合物按不同的步驟與固相載體上的包被物反應(yīng)。用洗滌的方法使與固相載體上形成的免疫復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，再加入酶反應(yīng)底物，經(jīng)酶的催化作用后底物變?yōu)橛猩a(chǎn)物。產(chǎn)物的量與標(biāo)本中被檢物的量直接相關(guān)。,間接法,間接法檢測(cè)抗體,11,雙抗夾心法示意圖,

4、雙抗體夾心檢測(cè)抗原,13,血清IgD臨床意義,IgD：生物功能不詳 增高：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、變態(tài)反應(yīng)性疾病、 敗血癥、新生兒溶血病 降低：意義不大,14,血清IgE臨床意義,增高：變態(tài)反應(yīng)性疾病、寄生蟲感染、病毒感染、自身免疫性疾病。 降低：意義不大,15,二、血清補(bǔ)體檢查,補(bǔ)體： 具酶樣活性、不耐熱的糖蛋白 其存在與抗原性異物的刺激無關(guān) 在正常人血清中含量相對(duì)穩(wěn)定 某些疾病時(shí)，含量及其活性可發(fā)生改變,16,補(bǔ)體總活性測(cè)定方法是以紅細(xì)胞的溶解為指示，以50%溶血為判斷終點(diǎn)，稱為CH50。,17,(圖)血管神經(jīng)性水腫,補(bǔ)體含量和活性相關(guān)的疾病,1免疫相關(guān)性疾病： 如自身免疫性疾病時(shí)，C1、C2、C

5、3、C4和Hf等缺陷； 超敏反應(yīng)時(shí)（III型超敏反應(yīng)），C3a、C5a等過敏毒素的產(chǎn)生。 2與補(bǔ)體有關(guān)的遺傳性疾?。?C2、C3缺陷導(dǎo)致的嚴(yán)重感染； 與C1抑制物缺陷相關(guān)的遺傳性血管神經(jīng)性水腫 SLE患者出現(xiàn)的細(xì)胞表面CR1缺陷與C1C清除障礙 涉及I因子、H因子缺陷的腎小球腎炎； DAF缺陷引起的陣發(fā)性血紅蛋白尿； C1q缺陷表現(xiàn)的嚴(yán)重頑固性皮膚損害，以及C1q、C1r、C4、C2缺陷造成的 免疫復(fù)合物性血管炎（包括腎炎）等。,18,3補(bǔ)體含量顯著降低的疾病： 消耗增多:免疫復(fù)合物形成導(dǎo)致的補(bǔ)體活化和消耗增多.如SLE. 補(bǔ)體的大量丟失:主要見于大面積燒傷、失血及腎臟病患者 補(bǔ)體合成不足:常

6、見于肝臟疾病患者或營養(yǎng)不良的病人。 4高補(bǔ)體血癥：偶見于感染恢復(fù)期和某些惡性腫瘤患者，正常妊娠時(shí)，也可觀察到補(bǔ)體值的增高。,19,三、感染性疾病免疫學(xué)診斷,（一）病毒性肝炎 （二）細(xì)菌感染 （三）病毒感染 （四）真菌感染 （五）其他,20,（一）病毒性肝炎,甲型肝炎 乙型肝炎 丙型肝炎 丁型肝炎 戊型肝炎,21,1. 甲型肝炎病毒,22,0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,Week,Response,Clinical illness,ALT,IgM,IgG,HAV in stool,Infection,Viremia,EVENTS IN HEPATITIS A VI

7、RUS INFECTION,23,無論顯性感染還是隱性感染 均能產(chǎn)生抗-HAV的 IgM和IgG抗體,抗-HAV的IgM在急性期和恢復(fù)早期出現(xiàn) 陽性可作為甲肝的確診依據(jù),抗-HAV的IgG在恢復(fù)后期出現(xiàn) 有保護(hù)作用，維持終身,甲型肝炎免疫學(xué)檢測(cè),2.乙型肝炎病毒,25,26,乙型肝炎免疫學(xué)檢測(cè),HBV具有三個(gè)抗原抗體系統(tǒng)： HBsAg與抗-HBs HBeAg與抗-HBeHBc HBcAg與抗HBcAg,27,1) HBsAg和抗-HBs HBsAg是HBV感染后第一個(gè)出現(xiàn)的血清學(xué)標(biāo)志物。 HBsAg陽性見于急性肝炎、慢性肝炎或無癥狀攜帶者。 持續(xù)6個(gè)月以上則認(rèn)為轉(zhuǎn)為慢性肝炎。 在急性感染恢復(fù)期

8、可檢出抗-HBs，一般是在HBsAg從血清消失后發(fā)生抗-HBs血清陽轉(zhuǎn)。,28,核心窗口期(core window):從HBsAg消失到抗-HBs出現(xiàn)的這段間隔期。此期可以短至數(shù)天或長達(dá)數(shù)月。 抗-HBs是一種中和抗體，是乙肝痊愈的一個(gè)重要標(biāo)志。 抗-HBs對(duì)同型病毒的再感染具有保護(hù)作用，可持續(xù)數(shù)年。 抗-HBs出現(xiàn)是HBsAg疫苗免疫成功的標(biāo)志。,29,2) HBeAg和抗-HBe 是HBV復(fù)制及血清具有傳染性的指標(biāo)。 在潛伏期與HBsAg同時(shí)或在HBsAg出現(xiàn)稍后數(shù)天可在血清中檢出。 HBeAg持續(xù)存在時(shí)間一般不超過10周，如超過則提示感染轉(zhuǎn)為慢性化。,30,抗-HBe出現(xiàn)于HBeAg陰轉(zhuǎn)

9、后，其出現(xiàn)比抗-HBs晚但消失早。 HBeAg陰轉(zhuǎn)一般表示病毒復(fù)制水平降低，傳染性下降，病變趨于靜止。,31,3) HBcAg和抗-HBc HBcAg是HBV存在和復(fù)制活躍的直接指標(biāo)。 血液中的量微，不易檢測(cè)到HBcAg。 抗-HBc出現(xiàn)較抗-HBs早得多，早期以IgM為主，隨后產(chǎn)生IgG型抗體。,32,抗-HBc IgM為急性HBV感染的指標(biāo)，但慢性乙肝患者也可持續(xù)低效價(jià)陽性，尤其是病變活動(dòng)時(shí)。 急性感染恢復(fù)期和慢性持續(xù)性感染以IgG型抗-HBc為主，可持續(xù)存在數(shù)年。 抗-HBc不是保護(hù)性抗體，不能中和乙肝病毒。,33,34,35,乙型肝炎病毒抗原抗體系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果分析,36,前S1蛋白(pr

10、e-S1)/抗pre-S1: 指位于HBV表面抗原蛋白1-120位氨基酸,具有肝細(xì)胞特異的糖蛋白受體的功能。 1.出現(xiàn)早,與HBeAg、HBV DNA顯著相關(guān); 2. pre-S1和肝細(xì)胞結(jié)合,有助于病毒的入侵; 3.干擾素療效的標(biāo)志; 4.抗pre-S1預(yù)示預(yù)后,37,3. 核酸檢測(cè) 血清中存在HBV DNA是診斷HBV感染最直接的證據(jù)，可用定性的核酸雜交法、定量分支DNA(branched DNA，bDNA)雜交法、定性PCR法、熒光定量PCR法檢測(cè)。 HBV DNA檢測(cè)可作為HBsAg陰性HBV感染者的的診斷手段，也有助于HBV感染者傳染性大小的判斷、HBV基因變異研究以及抗病毒藥物臨床

11、療效的評(píng)價(jià)等。 但是HBV DNA陽性、及其定量檢測(cè)的拷貝數(shù)目多少并不與肝臟病理損害程度呈相關(guān)關(guān)系，故不能用HBV DNA的多少判定病情程度。,38,思考題,患者一年前乙肝病毒感染血清標(biāo)志的檢測(cè)結(jié)果為,HBsAg(+), 抗-HBs(-), HBeAg(+), 抗-HBe(-), 抗-HBc IgM/IgG均(+), HBV DNA 4105拷貝/ml。治療后此次復(fù)查結(jié)果為，抗-HBs（-），HBsAg（-），抗-HBe（-），HBeAg（-），抗-HBcIgM（-）/IgG（+），HBV DNA 6106拷貝/ml。其原因最可能是A. 乙肝恢復(fù)期 B. 病毒發(fā)生變異 C. 試劑盒失效 D.

12、操作失誤 E. 抗病毒治療有效,39,3. 丙型肝炎免疫學(xué)檢測(cè),免疫學(xué)：篩選試驗(yàn) ELISA、放射免疫法抗HCV IgG或IgM。 抗HCV IgM早期診斷。 確證 免疫印跡法,40,根據(jù)與HBV感染的關(guān)系，可將HDV感染分為兩種類型： 1. 同步感染(coinfection) 指與HBV同時(shí)或先后感染。同步感染可引起典型的急性病毒性肝炎，個(gè)別病例易發(fā)展為危及生命的重癥肝炎。 2. 重疊感染(superinfection) 指在慢性HBV感染的基礎(chǔ)上發(fā)生HDV感染。在重疊感染中，HDV復(fù)制水平較高，極易導(dǎo)致慢性乙型肝炎患者癥狀加重和慢性化，與肝硬化的發(fā)生也密切相關(guān)。,4.丁型肝炎免疫學(xué)檢測(cè),4

13、1,丁型肝炎免疫學(xué)檢測(cè),1）HDV抗原 2）抗HDV IgM 3）抗HDV,42,HBV - HDV Coinfection,Typical Serologic Course,Time after Exposure,Titer,anti-HBs,Symptoms,ALT Elevated,Total anti-HDV,IgM anti-HDV,HDV RNA,HBsAg,HBV - HDV Superinfection,Typical Serologic Course,Time after Exposure,Titer,Jaundice,Symptoms,ALT,Total anti-HDV,

14、IgM anti-HDV,HDV RNA,HBsAg,44,5.戊型肝炎免疫學(xué)檢測(cè),抗體檢測(cè) IgM型：診斷指標(biāo)，ELISA法 IgG型：雙份血清，流行病學(xué)調(diào)查、既往感染或疫苗接種效果評(píng)價(jià) 病毒抗原,45,（二）細(xì)菌感染免疫學(xué)診斷,人感染病原體產(chǎn)生特異性抗體可持續(xù)一段時(shí)間，現(xiàn)癥診斷，疾病追溯。 1.血清抗鏈球菌溶血素“O”試驗(yàn)：A群溶血性鏈球菌 近期感染，活動(dòng)性風(fēng)濕熱、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心肌炎、急性腎小球腎炎、急性上呼吸道感染、皮膚和軟組織的感染等 正常參考范圍： 膠乳凝集法500U 免疫比濁法 200IU/ml,47,2、肥達(dá)反應(yīng) 利用凝集試驗(yàn)，作為傷寒、副傷寒的輔助診斷。 正常參考范圍： 傷寒

15、O凝集效價(jià) 4倍，診斷價(jià)值較大。,48,3.結(jié)核分枝桿菌抗體和DNA測(cè)定： 結(jié)核菌致病可能與免疫損傷密切相關(guān)（型變態(tài)反應(yīng)）呈顯感染免疫（有菌免疫）。 免疫學(xué)檢測(cè)：抗PPD-IgG （ELISA：陰性），結(jié)核菌素皮試（5mm15mm）。 DNA檢測(cè)：PCR,49,（三）病毒感染,ToRCH 一組可通過宮內(nèi)感染直接影響胎兒發(fā)育，并引起相似臨床癥狀和體征如流產(chǎn)、或死胎、先天性畸形和智力低下等的感染因素。,50,“To”代表弓形體(toxplasma,TOX) “R”代表風(fēng)疹病毒 (rubella virua,RV) “C”代表巨細(xì)胞病毒 (cytomegalovirus,CMV) “H”代表單純皰疹

16、病毒 (herps simplex virus,HSV),51,TORCH的應(yīng)用,孕前(準(zhǔn)備懷孕前雙方) 孕早期 新生兒臍血 幼兒時(shí) 預(yù)防接種時(shí),52,風(fēng)疹病毒感染,53,嬰幼兒風(fēng)疹，俗稱德國麻疹（German measles）由，風(fēng)疹病毒所致。屬于RNA病毒, 僅一種血清型。臨床上大多數(shù)無癥狀(隱性感染), 少數(shù)顯性 感染表現(xiàn): 發(fā)燒 、軀體皮疹、枕后淋巴結(jié)腫脹。先天性風(fēng)疹綜合征(母嬰垂直傳播)。,54,先天性白內(nèi)障(cataracts) 先天性心臟病(heart defects) 神經(jīng)性耳聾 （sensorineural deafness） 智力低下（mental retardation）

17、,55,HSV-1型所致唇皰疹,56,57,巨細(xì)胞病毒感染的特點(diǎn),1、感染廣泛（2y，90%） 2、隱性感染(obscure infection) 3、潛伏感染(latent infection) 4、多途徑傳播 5、宿主的正常免疫功能起制約作用 6、臨床多見潛伏-再激活(reactive) 7、呈多臟器侵犯,58,病毒抗原血癥的檢測(cè),59,TORCH檢測(cè)：IgM抗體出現(xiàn)均應(yīng)做咨詢。IgG抗體應(yīng)注意滴度變化，滴度低且無變化為既往感染，雙份血清滴度升高4倍以上。,60,（四）真菌感染免疫學(xué)診斷,意義有限,61,（五）其他感染免疫學(xué)診斷,性傳播疾?。阂略w、支原體、梅毒螺旋體、淋球菌、HIV引起。 1 衣原體抗體測(cè)定 沙眼衣原體(CT)是引起性傳播疾病常見的病原體之一。 IgM陽性提示近期有CT感染，有利于早期診斷 IgG在發(fā)病后68周出現(xiàn)，持續(xù)時(shí)間較長；提示曾有過CT感染,62,2 支原體血清學(xué)檢測(cè)：肺