《生物化學(xué)》教學(xué)課件：04 酶化學(xué)

1、第04章 酶化學(xué),龍中兒 生命科學(xué)學(xué)院,第04章 酶化學(xué),酶的基本概念,酶的命名與分類,酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),酶的作用機(jī)理,酶活性的調(diào)節(jié),酶的分離、純化和固定化,酶的專一性及活性中心,第一節(jié) 酶的基本概念,酶是生物催化劑,酶的化學(xué)本質(zhì),第一節(jié) 酶的基本概念,一、酶是生物催化劑,19世紀(jì)50年代，法國微生物學(xué)家巴氏德(L.Pasteur),1878年 Khne 酶（Enzyme）,1926年美國Sumner從刀豆中得到脲酶的結(jié)晶,酶是活細(xì)胞產(chǎn)生、具有催化活性的生物催化劑,1. 酶學(xué)研究歷史,2. 酶與一般催化劑的共同點(diǎn),能加快細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)速度,第一節(jié) 酶的基本概念,一、酶是生物催化劑,不能改變化學(xué)

2、反應(yīng)的平衡,反應(yīng)前后自身不會(huì)發(fā)生變化,第一節(jié) 酶的基本概念,一、酶是生物催化劑,3.酶作為生物催化劑的特殊性,高的催化效率,一般來說，酶的催化效率比化學(xué)催化劑高1071013倍，比非催化反應(yīng)高1081020倍。,例 2H2O22H2O+O2,1mole H2O2酶 能催化 5106mole H2O2的分解,1mole Fe3+ 只能催化610-4mole H2O2的分解,第一節(jié) 酶的基本概念,一、酶是生物催化劑,3.酶作為生物催化劑的特殊性,高的專一性,一種酶只能作用于某一類或某一種特定的物質(zhì),底物,糖苷鍵,酯 鍵,肽 鍵,水解酶各不相同！,酶作用的專一性（Specificity）,第一節(jié) 酶

3、的基本概念,一、酶是生物催化劑,3.酶作為生物催化劑的特殊性,溫和的反應(yīng)條件,常溫、常壓、接近中性的酸堿度等,第一節(jié) 酶的基本概念,一、酶是生物催化劑,3.酶作為生物催化劑的特殊性,酶的活性在體內(nèi)受到嚴(yán)格調(diào)控,激素調(diào)節(jié) 反饋調(diào)節(jié) 抑制劑和激活劑的調(diào)節(jié) 別構(gòu)調(diào)節(jié) 酶的共價(jià)修飾調(diào)節(jié) 酶原活化,酶的催化活力與輔酶、輔基和金屬離子有關(guān),酶濃度的調(diào)節(jié),第一節(jié) 酶的基本概念,一、酶是生物催化劑,4.酶的生物學(xué)意義,1大多數(shù)酶是蛋白質(zhì),1926年美國Sumner 脲酶的結(jié)晶 酶是蛋白質(zhì),1930年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的結(jié)晶，并進(jìn)一步證明了酶是蛋白質(zhì)。,J.B.Sumner

4、,J.H.Northrop,第一節(jié) 酶的基本概念,二、酶的化學(xué)本質(zhì),1大多數(shù)酶是蛋白質(zhì),第一節(jié) 酶的基本概念,二、酶的化學(xué)本質(zhì),研究表明：大多數(shù)酶都是蛋白質(zhì)，或者以蛋白質(zhì)為主要成分,單體酶（monomeric enzyme）,只有一條多肽鏈,寡聚酶（oligomeric enzyme）,由幾個(gè)或幾十個(gè)亞基組成。這些亞基可以相同，也可以不相同,多酶復(fù)合物（multienzyme complex）,由幾種酶嵌合在一起形成的復(fù)合體。它有利于一系列反應(yīng)的連續(xù)進(jìn)行。,1大多數(shù)酶是蛋白質(zhì),第一節(jié) 酶的基本概念,二、酶的化學(xué)本質(zhì),研究表明：大多數(shù)酶都是蛋白質(zhì)，或者以蛋白質(zhì)為主要成分,由幾個(gè)或幾十個(gè)亞基組成。

5、這些亞基可以相同，也可以不相同,多酶復(fù)合物（multienzyme complex）,由幾種酶嵌合在一起形成的復(fù)合體。它有利于一系列反應(yīng)的連續(xù)進(jìn)行。,第一節(jié) 酶的基本概念,二、酶的化學(xué)本質(zhì),1大多數(shù)酶是蛋白質(zhì),簡單蛋白（單純蛋白質(zhì)酶類 ）,結(jié)合蛋白（綴合蛋白質(zhì)酶類 ）,全酶 = 酶蛋白+ 輔助因子,金屬離子或 輔酶、輔基,輔酶(coenzyme) :與酶蛋白結(jié)合疏松，容易分開,輔基(prosthetic group):以共價(jià)鍵與酶蛋白結(jié)合,輔酶或輔基：直接參加催化反應(yīng)的有機(jī)化合物,1大多數(shù)酶是蛋白質(zhì),第一節(jié) 酶的基本概念,二、酶的化學(xué)本質(zhì),第一節(jié) 酶的基本概念,二、酶的化學(xué)本質(zhì),2. 某些RN

6、A有催化活性,1982年美國T. Cech等人發(fā)現(xiàn)四膜蟲的rRNA前體能在完全沒有蛋白質(zhì)的情況下進(jìn)行自我加工，并發(fā)現(xiàn)RNA有催化活性,Thomas Cech University of Colorado at Boulder, USA,第一節(jié) 酶的基本概念,二、酶的化學(xué)本質(zhì),2. 某些RNA有催化活性,1983年美國S.Altman等研究RNaseP（由20%蛋白質(zhì)和80%的RNA組成），發(fā)現(xiàn)RNaseP 中的RNA可催化E. coli tRNA的前體加工。,Cech和Altman各自獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)了RNA的催化活性，并將這些“具有催化活性的RNA”定義為ribozyme（核酶，酶活性RNA），二

7、人共同獲1989年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。,1Cell, 1982, 31: 147157,2Sci. Amer., 1986, 255: 6475,第一節(jié) 酶的基本概念,二、酶的化學(xué)本質(zhì),2. 某些RNA有催化活性,1995年，Cuenoud等發(fā)現(xiàn)有些DNA分子亦具有催化活性。,第一節(jié) 酶的基本概念,二、酶的化學(xué)本質(zhì),3. 某些DNA有催化活性,酶的命名,酶的分類,第二節(jié) 酶的命名和分類,酶催化反應(yīng)的性質(zhì),一、命名,第二節(jié) 酶的命名和分類,酶,習(xí)慣名稱,系統(tǒng)名稱,一、命名,第二節(jié) 酶的命名和分類,1. 習(xí)慣名稱（recommended name）,底物,反應(yīng)性質(zhì),底物，反應(yīng)性質(zhì),來源或其它特點(diǎn),蛋白酶

8、,水解酶,蛋白水解酶,胃蛋白酶,在實(shí)際使用過程中存在混亂：兩個(gè)不同的名稱用于同一種酶；或者同一名稱用于兩種不同的酶。,1961年國際酶學(xué)委員會(huì)（enzyme commission）提出的酶的命名和分類方法。,一、命名,2. 系統(tǒng)名稱（Systematic name）,第二節(jié) 酶的命名和分類,一、命名,2. 系統(tǒng)名稱（Systematic name）,標(biāo)明所有參與反應(yīng)的底物及催化反應(yīng)的性質(zhì)，并用“:”符號(hào)將底物分開,例1： 丙氨酸+-酮戊二酸 谷氨酸+丙酮酸,丙氨酸:-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶,第二節(jié) 酶的命名和分類,如其中一個(gè)底物為水時(shí)，水可略去,例2： 脂肪+H2O 脂酸 +甘油,脂肪水解酶,一、

9、命名,2. 系統(tǒng)名稱（Systematic name）,第二節(jié) 酶的命名和分類,二、分類,國際系統(tǒng)分類法,酶促反應(yīng)的性質(zhì),酶,氧化還原酶類,轉(zhuǎn)移酶類,水解酶類,裂合酶類,異構(gòu)酶類,合成酶類,1,2,3,4,5,6,第二節(jié) 酶的命名和分類,二、分類,根據(jù)底物中被作用的基團(tuán)或鍵的特點(diǎn)，將每一大類分為若干亞類，每一個(gè)亞類按順序編成1、2、3、4等,同樣，每一亞類又可分為若干亞-亞類，每一亞-亞類仍按順序編成1、2、3、4等，更精確地表明底物或反應(yīng)物的性質(zhì)。,用4個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字的編號(hào)表示，數(shù)字中用“”隔開，前面冠以EC （Enzyme Commission）。,EC 類.亞類.亞-亞類.排號(hào)，如EC l

10、.1.1.1,第二節(jié) 酶的命名和分類,第二節(jié) 酶的命名和分類,1. 氧化還原酶類（oxido-reductases）,三、酶催化反應(yīng)的性質(zhì),氧化酶類,脫氫酶類,過氧化氫酶,過氧化物酶,第二節(jié) 酶的命名和分類,1. 氧化還原酶類氧化酶類,三、酶催化反應(yīng)的性質(zhì),催化底物脫氫，并氧化生成H2O或H2O2 。,2A2H+O2 2A+2H2O,A2H + O2 A +H2O2,第二節(jié) 酶的命名和分類,1. 氧化還原酶類氧化酶類,三、酶催化反應(yīng)的性質(zhì),催化底物脫氫，并氧化生成H2O或H2O2 。,2A2H+O2 2A+2H2O,A2H + O2 A +H2O2,第二節(jié) 酶的命名和分類,1. 氧化還原酶類脫

11、氫酶類,三、酶催化反應(yīng)的性質(zhì),直接催化底物脫氫,A2H + B A + B2H,例：乳酸脫氫酶（EC 1.1.1.27，L-乳酸：NAD+ 氧化還原酶）,2. 轉(zhuǎn)移酶類（transferases）,第二節(jié) 酶的命名和分類,三、酶催化反應(yīng)的性質(zhì),催化基團(tuán)的轉(zhuǎn)移,例：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT） （EC 2.6.1.2，L-丙氨酸：-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶）,3. 水解酶類（ Hydrolases ）,第二節(jié) 酶的命名和分類,三、酶催化反應(yīng)的性質(zhì),AB + H2O AOH + BH,4. 裂合酶類（lyases）,第二節(jié) 酶的命名和分類,三、酶催化反應(yīng)的性質(zhì),從底物移去一個(gè)基團(tuán)而形成雙鍵或逆反應(yīng),AB A +

12、 B,例：,5. 異構(gòu)酶類（isomerase）,第二節(jié) 酶的命名和分類,三、酶催化反應(yīng)的性質(zhì),催化異構(gòu)化反應(yīng),例：,第二節(jié) 酶的命名和分類,三、酶催化反應(yīng)的性質(zhì),也稱連接酶類（ligases ），將兩個(gè)小分子合成一個(gè)大分子，通常需要ATP供能。,例：,6. 合成酶類（synthetases）,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué) (Kinetics of enzyme-catalyzed reactions),是研究酶促反應(yīng)的速度、酶促反應(yīng)速度的影響因素及其作用規(guī)律的科學(xué)。,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,酶濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,pH對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,溫度對(duì)酶反應(yīng)速

13、度的影響,激活劑對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,抑制劑對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),1. 米-曼氏方程,一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,中間復(fù)合物學(xué)說：,第二步: ESE+P,VES,1913年Michaelis和Menten推導(dǎo)得出：,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),2. 米氏方程的推導(dǎo),一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,VES,反應(yīng)方程式:,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),2. 米氏方程的推導(dǎo),一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,在米氏方程推導(dǎo)中引入3個(gè)假設(shè):,1) P0 忽略 這步反應(yīng),2） SES - ESS,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),2. 米氏方程的

14、推導(dǎo),一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),2. 米氏方程的推導(dǎo),一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),2. 米氏方程的推導(dǎo),一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,?,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),2. 米氏方程的推導(dǎo),一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,恒態(tài)法推導(dǎo),1925年提出了恒態(tài)的概念。,指反應(yīng)進(jìn)行一定時(shí)間后，ES的生成速度和ES的分解速度相等，亦即ES的凈生成速度為零，此時(shí)ES的濃度不再改變，達(dá)到恒態(tài)，也稱穩(wěn)態(tài)。,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),2. 米氏方程的推導(dǎo),一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,恒態(tài)法推導(dǎo),1925年提出了恒態(tài)的概念。,指反應(yīng)進(jìn)行一定時(shí)間后，ES的生成

15、速度和ES的分解速度相等，亦即ES的凈生成速度為零，此時(shí)ES的濃度不再改變，達(dá)到恒態(tài)，也稱穩(wěn)態(tài)。,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),2. 米氏方程的推導(dǎo),一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,衡態(tài)法推導(dǎo),ES的形成速度：,ES的消耗速度：,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),2. 米氏方程的推導(dǎo),一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,衡態(tài)法推導(dǎo),第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),2. 米氏方程的推導(dǎo),一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,衡態(tài)法推導(dǎo),酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的一個(gè)最基本的方程,（酶完全被飽和）,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),3. 米氏常數(shù)的物理意義,一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,Km的物理意義：當(dāng)酶反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度,濃

16、度單位：g/L，mol/L 等,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),3. 米氏常數(shù)的物理意義,一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,Km的物理意義：當(dāng)酶反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度,濃度單位：g/L，mol/L 等,有關(guān)米氏常數(shù)說明幾點(diǎn)：,Km是酶的一個(gè)特征性常數(shù)，只與酶的性質(zhì)有關(guān)，與酶的濃度無關(guān),第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),3. 米氏常數(shù)的物理意義,一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,如酶能催化幾種不同的底物，對(duì)每種底物都 有一個(gè)特定的Km值，其中Km值最小的稱該 酶的最適底物。,Km除了與底物類別有關(guān)，還與pH、溫度有關(guān)，所以Km是一個(gè)物理常數(shù)，是針對(duì)一定的底物、 一定的pH、一定的溫度而言的。,酶被底

17、物飽和的百分?jǐn)?shù),米氏公式的實(shí)際應(yīng)用,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),3. 米氏常數(shù)的物理意義,一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,一級(jí)反應(yīng),零級(jí)反應(yīng),第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),4. 米氏常數(shù)的求法,一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,v對(duì)S作圖,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),4. 米氏常數(shù)的求法,一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,雙倒數(shù)作圖,Lineweaver-Burk作圖法,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),4. 米氏常數(shù)的求法,一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,雙倒數(shù)作圖,Lineweaver-Burk作圖法,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),4. 米氏常數(shù)的求法,一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,Eadie-Hofstee作圖,S/v

18、 對(duì)S作圖,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),4. 米氏常數(shù)的求法,一、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,Hanse-Woolf作圖,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),二、酶濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,反應(yīng)速度與酶濃度成正比,1pH影響反應(yīng)速度的原因,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),三、pH對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,pH影響了酶分子、底物分子和ES復(fù)合物的解離狀態(tài)。,過高、過低的pH導(dǎo)致酶蛋白變性。,大多數(shù)酶是蛋白質(zhì),pH,酶蛋白的結(jié)構(gòu)（基團(tuán)的解離狀態(tài)）,底物的解離狀態(tài),pH影響酶促反應(yīng)的速度,2. 酶反應(yīng)的最適pH（optimum pH）,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),三、pH對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,* 酶的最適pH不是一個(gè)固定的常數(shù),例: 堿性磷酸酶催化磷酸苯酯水解時(shí),s為2.5x10-5 M，最適pH為 8.3,2. 酶反應(yīng)的最適pH（optimum pH）,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),三、pH對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,* 影響因素有：,底物的種類、濃度;,緩沖液的種類、濃度;,酶的純度;,反應(yīng)的溫度、時(shí)間等,s為2.5x10-2 M，最適pH為10.0,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),四、溫度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響,1. 最適溫度,最適溫度與最適pH一樣，也不是一個(gè)固定的常數(shù)，它隨底物的種類、濃度, 溶液的離子強(qiáng)度, pH, 反應(yīng)時(shí)間等的影響。,例: 反應(yīng)時(shí)間短，最