ELISA培訓PPT.ppt

1、A,1,ELISA（Enzymes linked immunosorbent assay）,2020/9/14,A,2,目錄,ELISA原理,ELISA簡介,ELISA實驗步驟,ELISA相關儀器、試劑,A,3,ELISA簡介,酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）,簡稱ELISA，它是實驗室最常用的檢測方法。酶是能夠催化化學反應的特殊蛋白質，其催化效力超過所有人造催化劑，ELISA 就是將抗原和抗體的免疫反應和酶的催化反應相結合而建立的一種新技術。使用酶去標記抗原或抗體以后，既不影響抗原抗體反應的特異性，也不改變酶本身的活性。因此ELISA具

2、有準確性高、檢測時間短、價格低廉、判斷結果有客觀標準、結果便于記錄和保存等優(yōu)點，適合于大批標本的檢測，廣泛應用于食品安全檢測、醫(yī)療檢測以及免疫實驗分析等領域。,A,4,1.抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，并保持器免疫學活性。例如：蛋白質分子結構上的疏水基團與聚苯乙烯表面的疏水基團能產生互作用而吸附。 2.抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結合物，而此種酶結合物仍能保持其免疫學和酶學活性； 3.酶結合物與相應抗原或抗體結合后，可根據加入底物的顏色反應來判定是否有免疫反應的存在，而且顏色反應的深淺是與標本中相應抗原或抗體的量成正比例的，由此進行定性或定量分析。,ELISA基本原理,A,

3、5,ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體，根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法，主要類型有雙抗體夾心法、間接法、競爭法、捕獲法等。,ELISA類別,A,6,雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，先將已知抗體連接在固相載體上，待測抗原與抗體結合后再與酶標二抗結合，形成抗體-待測抗原-酶標二抗的復合物，復合物的形成量與待測抗體原成正比。,雙抗體夾心法,A,7,當小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的抗體結合位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。,競爭法,A,8,雙抗原夾心法的反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制

4、備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。,雙抗原夾心法,A,9,間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法。,間接法,A,10,除了以上常見的4種檢測方法外，還有直接法、捕獲包被法、競爭法（測抗體）、雙抗原夾心法、ABS-ELISA法等其他方法。,A,11,ELISA實驗過程主要分以下三步：,第一：實驗設計 1.了解將要測定的樣品屬于什么類別，選用最佳的ELISA檢測方法； 2.選用正確的陰性對照品、陽性對照品、樣品標準品等； 3.規(guī)劃實驗中所使用各種試劑的濃度、加入量、反應

5、時間等； 4.再細化實驗中每個步驟的開展時間，合理的時間安排能使實驗有條不絮的進行。 第二：實驗準備 1.實驗所使用物料的清點； 2.實驗試劑的配備； 3.實驗儀器的預約；,A,12,第三：實驗操作（以雙抗體夾心法為例） 1.包被（在聚苯乙烯板上包被特異性已知抗體，使之與板結合） 4過夜（大于12小時）或37孵育2小時，包被后洗滌一次； 2.封閉（一般使用0.12%BSA，5%脫脂奶粉，1%明膠，10%小牛血清等）37反應2小時（封閉液體積要大于包被液體積），封閉后清洗3次； 3.加入含有待測抗原的樣品，37孵育1小時； 4.洗滌，清洗3次； 5.加入酶標液（酶標二抗），37孵育1小時； 6.

6、洗滌，清洗5次； 7.加入酶促反應底物，發(fā)生顯色反應（37避光顯色515min)，終止顯色后測量450/630nm吸光值。 注：上面實驗共12次清洗，清洗次數可適當增多，同一反應盡量保證使用同一種清洗液，常見清洗液有PBST、TBST、PBS等。,A,13,結果判定,定性測定 定性測定的結果判斷作出“有”或“無”的回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應的最高稀釋度即為滴度。根據滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。 待測孔（

7、P）與對照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者為陽性，N為陰性對照孔。 定量測定,A,14,實驗中使用的試劑、儀器,常用試劑： 1.包被緩沖液：0.05M PH 9.6 碳酸鹽緩沖液、0.1M PH 9.6 碳酸鹽緩沖液、pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH78的Tris-HCL 緩沖液等。 2.封閉液：0.12%BSA，5%脫脂奶粉，1%明膠，10%小牛血清等（一般溶于0.15M PBS中）。 3.洗滌液：PBS、PBST、TBST等。 4.抗體稀釋液：PBST、0.52%BSA（溶于PBST中）等。 5.底物緩沖液：TMB顯色液、OPD顯色液、ABTS顯色液、AP顯色液等，根據所使用的酶標抗

8、體選用對應的底物緩沖液顯色。 6.終止液：2M硫酸。,A,15,常見儀器,單孔道、多孔道移液器,振蕩器,洗板機,酶標儀,計時器,A,16,實驗中遇到常見問題與解決方法,1.陰性對照出現陽性結果： 造成該現象的原因有4個： 1）試劑或樣品可能被污染，或者由于孔之間的濺灑出現交叉污染。 應當更換使用試劑，小心操作； 2）酶標板洗板不徹底。 嘗試用洗液充滿板孔確保每孔被充分洗滌，洗板前確保所有的剩余抗體溶液被倒凈； 3）抗體量過多導致非特異結合。 應該根據推薦用量使用抗體，盡量使用較少的抗體； 4）夾心法、捕獲法中檢測抗體與包被抗體/抗原反應。 確定使用的是正確的包被抗體和檢測抗體，兩者之間不會互相

9、反應。,A,17,2.酶標板整體背景高 造成該現象的原因有4個： 1）抗體非特異性結合。 應確保進行了封閉并且使用的是恰當的封閉液，最好使用5%10%的與二抗同種動物來源的血清或牛血清，確保板孔經過預處理以防止非特異結合，使用親和力強、純度高的抗體，最好經過了預吸收處理； 2）底物結合濃度過高或反應時間過長。 應調整底物的濃度，當酶標板顯色足夠進行吸光度讀數時立即使用終止液終止反應，適當縮短顯色時間； 3）底物溶液不新鮮或被污染。 應檢測底物溶液，正常的底物溶液應該是清亮透明的，如果變黃或其他顏色則是被污染的標志； 4）底物孵育過程沒有避光。 底物孵育應該在避光環(huán)境下進行。,A,18,3.吸光

10、度數值偏高或偏低 造成的該現象的原因有幾個： 1）樣品中待檢抗原含量太低會導致測試結果偏低。 可嘗試增加樣品的使用量或者更換一個檢測更靈敏的方法； 2）加入抗體量不合適也會造成結果偏低或偏高 應確定使用的是建議抗體用量，或者為了使結果更好盡可能調整抗體的最適用量； 3）孵育時間不夠長會導致檢測結果偏低。 應適當延長抗體或抗原的孵育時間，確保待測樣品與檢測抗體能充分結合； 4）孵育溫度不適合。 應保證抗體在最適宜并且穩(wěn)定的溫度下孵育，一般是室溫（25孵育2h或37孵育1h）。,A,19,影響因素的分析,1.標本的影響 1.1 溶血標本及混有紅細胞的血清采用ELISA法檢測易產生假陽性 可能是溶血

11、血清中含有過氧化酶物質（紅細胞或血紅蛋白中的亞鐵血紅素），在洗滌過程中往往難以完全洗脫，它可使H2O2釋放出原生態(tài)氧(O)，從而催化底物四甲基聯(lián)苯胺生成可溶性的有色物質，即顯藍色，產生假陽性。所以嚴重溶血標本禁用。 1.2 標本受細菌污染 ：因菌體中可能含有內源性辣根過氧化物酶，因此，被細菌污染的標本同溶血標本一樣，亦可產生非特異性顯色而干擾測定結果。 1.3 標本保存不當 ：在冰箱中保存過久的標本，在間接法ELISA測定中會導致本底過深、造成假陽性；為克服上述干擾，ELISA測定的血清標本宜為新鮮采集；如不能立即測定，5 d內測定的血清標本可存放于4，1周后測定的血清標本應低溫凍存；凍存后融

12、解的標本，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混合后再測定，但混勻時應輕柔，不可強烈振蕩。,A,20,1.4 塑料試管能吸附抗原物質，樣本久置在塑料管內會使樣本內抗原含量下降造成假陰性 最好使用真空采血管；并使用非抗凝標本，肝素抗凝血漿會增加OD值，EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性。 1.5 標本凝固不全 在工作中，有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結果；因此血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清。 2.試劑影響 ELISA檢測

13、試劑廠家較多；不同廠家出產的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別，使用質劣的試劑必然導致結果的假陽性或假陰性。因此，選擇高質量的試劑是保證結果準確的關鍵之。 3.操作技術的影響 3.1 吸量的準確性 :吸量不準確，直接影響檢測結果。因此加樣器也要經常清洗，定期校準。,A,21,3.2 溫浴影響 :抗原抗體結合及酶促反應對溫度有嚴格要求，酶標板周圍與內部孔升降溫速率不同，造成周邊與內部孔結果差異；干浴與水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止污物浸入。 3.3 加樣次序影響 :有時我們在加樣過程中，常常會遇到個別標本未離心等情況，為了節(jié)約時間，往往這時我

14、們會先加酶結合物，然后等標本分離好后再加標本，這樣，竟常常會造成HBeAb和HBcAb的假陰性。因為HBeAb和HBcAb都是競爭抑制法，先加入酶標記的抗體，首先與固相載體上的抗原結合，待加入顯色劑后，因酶的存在而顯色，故呈陰性。 3.4 洗滌方法對結果的影響 :洗滌是ELISA操作的重要環(huán)節(jié)，手洗條件一致性較差，對結果影響較大，全自動洗板機使用不當也會影響結果，血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結晶易使洗板機針小孔處于阻塞狀態(tài)，造成未結合標記酶洗脫不徹底，導致“花板”造成假陽性或假陰性；所以操作洗板機過程中要不時觀察洗板機針孔內洗液的通暢狀況，洗板機不用時應用去離子水清洗幾遍。,A,22,4.干擾物質的影響 4.1有人認為大約40%的人血清標本中含有非特異性干擾物質，可以不同程度影響檢測結果；常見的干擾物質有：類風濕因子、補體、交叉反應物質和其他物質等。如RF因子可與標記二抗的FC段法結合造成假陽性，高濃度的AFP（如孕婦），在儲存過程中可能形成二聚體會導致本底過