細(xì)胞凋亡實驗

1、細(xì)胞凋亡與檢測方法,匯報人：,凋亡(apoptosis)：機體在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的、程序化的死亡過程。 壞死（Necrosis）：各種致病因子，干擾和中和了細(xì)胞的正常代謝活動，造成細(xì)胞的意外死亡。,一、細(xì)胞的死亡方式,二、細(xì)胞壞死與凋亡的比較,三、細(xì)胞凋亡的生理意義,1. 確保正常發(fā)育、生長 如：指（趾）間隙的形成 2. 維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定 如：清除受損、突變或衰老的細(xì)胞 3. 發(fā)揮防御功能 如：使受到病毒感染的細(xì)胞凋亡,細(xì)胞變圓 微絨毛消失 胞質(zhì)濃縮 空泡化,凋亡小體,初期：,核染色質(zhì)高度濃縮凝集在核周邊,邊集細(xì)胞體積縮小,中期：,胞膜內(nèi)陷出芽,濃縮核裂解膜自行分割,后期：,鄰

2、近的上皮細(xì)胞、M、瘤細(xì)胞等吞噬凋亡小體,四、凋亡時細(xì)胞的主要變化（一）形態(tài)學(xué)改變,Normal Cell,Apoptotic cell,（二）、生化改變,、DNA片段化主要特征 2、內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶（nase)激活 3、凋亡蛋白酶（Caspases）激活,內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的作用,H1,核心顆粒,連接區(qū),180-200 bp,內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶,Zn2+,Ca2+ Mg2+,五、細(xì)胞凋亡的檢測方法,1、形態(tài)學(xué)檢測 （一） HE染色（凋亡細(xì)胞呈圓形，胞漿紅染，細(xì)胞核染色質(zhì)聚集成團(tuán)塊狀） （二）透射電鏡觀察 （三）熒光顯微鏡觀察,透射電鏡觀察,凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡期（pro-apopto

3、sis nuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)(圖2)；a期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。,熒光顯微鏡,期的細(xì)胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased)，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài); a期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化; b期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體(圖1）,2、DNA片斷化檢測,細(xì)胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50300 kbp長的DNA大片段, 或180200 bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表

4、現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細(xì)胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)使DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細(xì)胞中DNA ladder的形成,3、流式細(xì)胞儀檢測 flow cytometer,（一）PI 單染 （二）Annexin/ PI雙染色,（一） PI 單染,熒光染料PI（碘化丙啶）是一種可對DNA染色的細(xì)胞核染色試劑，常用于細(xì)胞凋亡檢測，英文全稱是Propidium Iodide。它是一種溴化

5、乙啶的類似物，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。 細(xì)胞凋亡之初，由于核酸內(nèi)切酶的激活，將DNA從核小體間切斷，產(chǎn)生游離寡核苷酸片段。這些片段彌散到胞漿中，但是細(xì)胞膜完整，不能離開細(xì)胞。 乙醇固定，PBS洗滌，使細(xì)胞膜通透性增加，并從細(xì)胞漿彌散出胞外。但是大分子DNA在胞內(nèi)，不能被抽提。,判斷：在直方圖上，Go/G1期前有一個亞二倍體峰。 （檢測晚期凋亡，但不能判斷是晚期凋亡還是壞死）,（二）Annexin/PI雙染色,原理：磷脂酰絲氨酸（PS）主要存在于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，細(xì)胞凋亡時，它移向細(xì)胞外側(cè)?？赡苁荘S膜內(nèi)外轉(zhuǎn)位酶的早期激活有關(guān)。Annexin是一種Ca2依賴磷脂結(jié)合蛋白，對PS有高度親和性。

6、PS外翻不是凋亡細(xì)胞所特有，壞死細(xì)胞也可發(fā)生。 兩種細(xì)胞的區(qū)別在于早期凋亡細(xì)胞細(xì)胞膜是完整的，而壞死細(xì)胞膜完整性受到破壞, 可用PI區(qū)分。,檢測標(biāo)準(zhǔn)： 早期凋亡細(xì)胞：Annexin -FITC (+)；PI (-)； 壞死細(xì)胞和晚期凋亡繼發(fā)性壞死細(xì)胞： Annexin -FITC (+)；PI (+)； 機械性壞死及非特異性染色： Annexin -FITC (-)；PI (+)； 正常細(xì)胞：Annexin -FITC (-)；PI (-)；,C-myc ASO 200 nmol/L,凋亡結(jié)果,壞死結(jié)果,4、線粒體膜勢能的檢測,線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)

7、不同的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位DYmt的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征(染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂)出現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。 線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。,親脂性陽離子熒光探針JC-1以單體形式存在，可發(fā)出綠色熒光（527 nm），若以多聚體形式存在，可發(fā)出紅色熒光（590 nm）. JC-1可透過正常細(xì)胞膜以單體狀態(tài)進(jìn)入胞內(nèi)，正常健康線粒體的膜電位（）具有極性，JC-1依賴于的極性被迅速攝入線粒體內(nèi)，并形成多聚體，發(fā)出紅色熒

8、光（590 nm，線粒體）和綠色熒光（527 nm，胞液）. 而細(xì)胞發(fā)生凋亡時，線粒體跨膜電位被去極化，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，線粒體內(nèi)紅光強度減弱（590 nm），以單體的形式存在于胞液內(nèi)而發(fā)綠色熒光（527 nm）. 因此在雙色濾光片下觀察，正常細(xì)胞為高綠高紅，凋亡細(xì)胞為高綠低紅.,正常細(xì)胞為高綠高紅，,凋亡細(xì)胞為高綠低紅.,5、Caspase-3活性的檢測,Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基(17KD)和兩個小亞基(12KD)組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降。,Western blot 分析 caspase-3的活化Caspase 3，6，7,Caspase-3正常以酶原(32KD),活化的Caspase-3由兩個大亞基(17KD)和兩個小亞基(12KD)組成,原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據(jù)這一特點，設(shè)計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽