醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實驗課件：實驗5

1、實驗五 主要內(nèi)容 （一） 凝集反應(yīng) （二） 補體結(jié)合反應(yīng) （三） 血清總補體測定,顆粒性抗原（病原微生物或紅細胞）與相應(yīng)的抗體特異性結(jié)合，在電解質(zhì)存在的條件下，如果兩者比例適當(dāng)，在一定的溫度下經(jīng)過一定的時間，可以形成肉眼可見的凝集塊，這種現(xiàn)象叫做凝集反應(yīng)。,凝集反應(yīng),直接凝集反應(yīng)：玻片法、試管法。 間接凝集反應(yīng) 抗人球蛋白試驗,凝集反應(yīng),試管凝集反應(yīng)（4人一組）,試管凝集反應(yīng)為一種定性、半定量試驗，用已知的顆粒性抗原檢測血清中未知抗體及相對含量。 利用生理鹽水將待檢血清在試管中進行連續(xù)倍比稀釋，然后于各管中加入等量的已知抗原懸液，經(jīng)過一定時間后，觀察有無凝集并根據(jù)凝集程度判定血清中抗體的效價。

2、,1:10溶血素0.5ml,步驟與方法 1取小試管7支，排列于試管架上并做好標(biāo)記。 2每管各加入生理鹽水0.5ml。 3吸取1 : 10綿羊紅細胞免疫血清（溶血素）0.5ml放入第1管中充分混勻。 4自第1管中吸出0.5ml加入第2管中，經(jīng)充分混勻后吸出0.5ml加入第3管中，如此依次稀釋至第6管，混勻后吸出0.5ml棄去，第7管不加血清做對對照。,棄去0.5ml,517管每管各加入1%綿羊紅細胞（SRBC）懸液各0.5ml（注意：加入前必須先將SRBC懸液充分混勻）。 6此時第16管的血清稀釋度為1 : 40，1 : 80，1 : 160，1 : 320，1 : 640，1 : 1280。搖

3、勻后，置37溫箱，次日觀察結(jié)果并記錄。 倍比稀釋：Ag or Ab？,結(jié)果 1觀察前切忽搖動試管，以免凝集分散。 2先觀察對照管，該管應(yīng)無凝集現(xiàn)象，血球沉于管底呈圓點狀，如出現(xiàn)凝集則說明操作有錯誤或非特異凝集，試驗結(jié)果不能成立。 3再觀察16試管，并以 、 、 、分別表示凝集強度。,結(jié)果判斷,：血球完全凝集，成厚膜狀鋪于管底，邊緣呈鋸齒狀。 ：血球呈薄層貼于管底，邊緣不整齊。 ：血球在管底的中央呈小圓盤狀，邊緣凝集呈顆粒狀。 ：血球呈較大的圓盤狀沉淀，邊緣凝集顆粒很少。 ：無凝集，血球沉于管底呈圓點狀，邊緣整齊。,效價：生物制品活性（數(shù)量）高低的標(biāo)志。以血清最高稀釋度仍能出現(xiàn)“ ”凝集現(xiàn)象者，

4、作為該血清的效價（滴度）。 1 2 3 4 5 6 7 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 對照 1 + + + + - - - 2 + + + + + + - 3 + + + - - - - 4 + + + + + - -,抗體過剩,抗體抗體比例合適,抗原過剩,網(wǎng)格學(xué)說（lattice theory）,補體結(jié)合試驗（4人一組）,是指在補體的參與下，以綿羊紅細胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗體）作為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。本實驗操作繁瑣，但補體結(jié)合抗體出現(xiàn)早、消退快，有助于早期診斷。,補體結(jié)合試驗,抗原-抗體, 補體, 綿羊紅細胞-溶血素,溶血,不溶血,

5、抗原與抗體對應(yīng),抗原與抗體不對應(yīng),（待檢系統(tǒng)） 已知Ag或Ab 待檢Ab或Ag,（指示系統(tǒng)）,僅供1組Ag-Ab系統(tǒng)反應(yīng)的定量補體，不能過多或過少。,步驟與方法,溶血,不溶血,結(jié)果 觀察各管溶血情況，記錄并分析意義。 管內(nèi)液體混濁呈淺紅色為不溶血，管內(nèi)液體透明呈紅色為溶血。,血清總補體測定（50溶血法 ） （4人一組） SRBC （抗原），與相應(yīng)抗體（溶血素）結(jié)合后，可激活待檢血清中的補體而導(dǎo)致SRBC溶血。當(dāng)SRBC與溶血素濃度恒定時，溶血程度與補體含量和活性呈正比例關(guān)系。因此，將新鮮待檢血清做不同稀釋后，與SRBC與溶血素反應(yīng)，測定溶血程度，可測知補體總?cè)苎钚浴?血清總補體測定（50溶血

6、法 ） 由于補體含量與溶血程度之間呈正相關(guān)，但不是直線關(guān)系，而呈S曲線關(guān)系。曲線二端平坦，補體量的增減對溶血程度影響不大，而在曲線中段（50%溶血附近）曲線斜度最陡，幾乎成一直線，補體量的細微變化可引起溶血程度明顯改變，故取50%溶血為終點觀察指標(biāo)，以精確檢測血清補體的含量。,補體量,步驟與方法 1配制50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管已配制完畢 2ml 2%SRBC懸液加8ml蒸餾水，混勻，使完全溶血。取此液體2 ml加生理鹽水2ml，混勻后即為50%溶血管。,標(biāo)準(zhǔn)管,步驟與方法 2正式試驗：取1:30的稀釋血清（1:30 補體）按下表所示加樣。,50%溶血試驗加樣表 單位：ml,步驟與方法 將管內(nèi)各成分混勻，置37水溶30分鐘后，離心2000rpm5分鐘。 將其與標(biāo)準(zhǔn)管目測比色，選擇目測色澤最接近的管為終點。,標(biāo)準(zhǔn)管,3,4,步驟與方法 5. 根據(jù)各管