有關(guān)紫杉醇生產(chǎn)的影響因素與對策

1、有關(guān)紫杉醇生產(chǎn)的影響因素與對策紫杉醇(Taxol) 是從紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬(Taxus) 植物樹皮、針葉中分離出的一種四環(huán)二萜酰胺類化合物, 它能有效地治療晚期卵巢癌, 乳腺癌和其它癌癥, 被稱為是過去幾十年中發(fā)現(xiàn)的最好的抗癌藥物。1992 年12月29日, 美國FDA 正式批準(zhǔn)紫杉醇作為治療晚期卵巢癌的新抗癌藥物(商品名為Paclitaxel)。由于紫杉醇在植物體中的含量相當(dāng)?shù)?大約從36棵60100年生大樹的樹皮中才能提取到1g紫杉醇, 可治療一個癌癥患者。目前全球每年200kg紫杉醇的消耗量意味著要砍伐100萬棵紅豆杉大樹, 隨著紫杉醇應(yīng)用范圍的擴大, 其需求量必然會逐

2、年增加, 而紅豆杉樹生長速度相當(dāng)慢, 直徑20cm的樹需生長100年! 因此, 伐樹生產(chǎn)紫杉醇的方法不僅會嚴重破壞該樹的長期生存和分布, 也根本無法滿足人們對紫杉醇的需求。尖銳的供需矛盾在醫(yī)學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中引起了一場非同尋常的廣泛研究, 以增加這種化合物的來源。目前生產(chǎn)紫杉醇的主要方法紫杉醇的生產(chǎn)方法主要是提取分離和化學(xué)合成，提取分離的方法按來源不同又可分為三大類: 從植物中分離提取、從真菌中分離提取及從培養(yǎng)細胞中分離提取。1.1 直接從紅豆杉科植物中分離提取紫杉醇含量與種、部位、生長年限、生長環(huán)境等因素有關(guān)。在所有紅豆杉中短葉紅豆杉中紫杉醇含量最高；從生長時間上看，生長時間越長的器官或

3、組織紫杉醇含量越高；從生長環(huán)境上看，生長在陰處的樹皮比暴露在日光下的高；就部位來看，一般樹皮中紫杉醇含量較高，短葉紅豆杉樹皮中紫杉醇含量可達0.069%。 據(jù)估算，從2000 3 000棵稀有的紫杉樹皮中只能提取1 kg紫杉醇，而對1例病人制備充足的藥物需3 4棵百年的老紅豆杉樹。這要求人工栽培的紅豆杉品種紫杉醇含量高、生長迅速。 目前，曼地亞紅豆杉能相對較好地滿足這些要求，它是一個雜交品種，生長迅速3 5day后可收獲兩次枝葉，其針葉中紫杉醇含量為0.017% 0.046%。因此，人工種植該品種生產(chǎn)紫杉醇的成本不會低，但是，選育優(yōu)良品種提取紫杉醇無疑是一個有價值的研究方向。1.2 直接從紫杉

4、醇產(chǎn)生菌中提取紫杉醇產(chǎn)生菌主要是一些紅豆杉的內(nèi)生真菌。真菌中最高紫杉醇含量為185.4 g/ L，可見，當(dāng)前利用微生物發(fā)酵方法產(chǎn)生紫杉醇的量很低，難以達到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。而且，真菌自身合成紫杉醇的途徑還未見報道，自身是否存在紫杉醇的合成途徑還需進一步研究探索。此生產(chǎn)方法的前景還不明朗。1.3 化學(xué)合成法化學(xué)合成是生產(chǎn)藥物的一條重要途徑，許多天然藥物(如一些抗生素) 除了可從生物體內(nèi)提取外，還可通過化學(xué)的方法合成。紫杉醇的藥效被發(fā)現(xiàn)以來，其化學(xué)合成的方法一直受到重視并得到很多的研究探索。 迄今為止，在生產(chǎn)上有價值的紫杉醇的全合成尚未取得成功。紫杉醇結(jié)構(gòu)復(fù)雜，母核有9個手性中心，因此應(yīng)有2 04

5、8個非對映異構(gòu)體，紫杉醇的半合成是以天然來源的baccatin 或10-去乙酰baccatin為原料，通過13 位酯化得到紫杉醇或其它半合成衍生物。此法首先合成側(cè)鏈, 然后把側(cè)鏈接到baccatin或10-去乙酰baccatin上去。 紫杉醇的半合成法的問題主要在于：1) 合成原料在植物中含量不高，分離成本較高。2) 每一步反應(yīng)得率低，而且有時會碰到選擇性較差的問題。所以，無論是全合成還是半合成目前都取得了成功，但都難以應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。1, 4 利用紅豆杉細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇大規(guī)模地培養(yǎng)微生物細胞實現(xiàn)了許多種抗生素的大量生產(chǎn)，極好地滿足了病人對抗生素的需求，挽救了無數(shù)人的生命?？股厥?/p>

6、微生物的次生代謝產(chǎn)物，紫杉醇是植物細胞的次生代謝產(chǎn)物，能否通過大規(guī)模的植物細胞培養(yǎng)大量獲取紫杉醇很有研究價值。就現(xiàn)有的報道來看，這一生產(chǎn)方法受到了許多學(xué)者的重視，許多研究者在高產(chǎn)細胞系的選擇和代謝調(diào)控方面進行了大量的卓有成效的研究。影響紫杉醇生產(chǎn)的幾個因素：1.碳源碳源作為植物生長的基質(zhì)和能量來源，對細胞生長和次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)有很大影響。在短葉紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)中，比較了20g/L的蔗糖、乳糖、半乳糖、葡萄糖、果糖對細胞生長的影響，發(fā)現(xiàn)半乳糖和蔗糖最有利于細胞生長。在高起始糖濃度的培養(yǎng)基中，果糖最能刺激紫杉醇的合成。與高起始糖濃度培養(yǎng)的細胞相比，采用補糖的方法，紫杉醇產(chǎn)量在靜止期可顯著增加。

7、南方紅豆杉細胞對蔗糖的消耗有一個臨界點，即培養(yǎng)液中總殘留有1g/L的蔗糖不能被吸收，而培養(yǎng)液中濃度為30g/L的蔗糖對細胞生長和產(chǎn)物合成最為有利。蔗糖大部分被降解成葡萄糖和果糖，其中葡萄糖有利于細胞的前期生長以獲得大量的懸浮細胞，在中期添加果糖有利于細胞培養(yǎng)后期合成紫杉烷類化合物。2.氮源在氮源組成中，較低的NH4/NO3比有利于細胞的快速生長,而其他無機鹽濃度與細胞生長之間不存在這種關(guān)系。培養(yǎng)基中高濃度的NO3有利于云南紅豆杉愈傷組織的生長，而高濃度的NH4則抑制愈傷組織的生長，但可顯著提高紫杉醇的含量。在無機氮全部為銨態(tài)氮的處理中，愈傷組織接種1周后就變成磚紅色，增殖較少，其生長指數(shù)顯著低

8、于對照，但紫杉醇含量較對照高1倍。3. 光照在離體無菌培養(yǎng)條件下，細胞處于異養(yǎng)狀態(tài)，且培養(yǎng)基中已經(jīng)添加了足夠的碳源，光照并非用來提供光合作用的能量，但是不同的光照時間和光照強度仍然會對細胞代謝產(chǎn)生一定的影響。白光對東北紅豆杉愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細胞中紫杉醇積累的影響發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)時懸浮細胞的生長量是白光培養(yǎng)下的2-3倍，紫杉醇的產(chǎn)量也是白光培養(yǎng)下的3倍。其原因可能有2個：一是紫杉醇（二萜）的遠程前體是甲戊二羥酸（MVA）,而MVA的合成量與甲戊二羥酸酰輔酶A還原酶(HMGR)的活性正相關(guān)，光照會導(dǎo)致HMGR的活性降低，最終導(dǎo)致紫杉醇積累的降低；二是光照會抑制紫杉醇的胞外分泌，從而可能導(dǎo)致胞內(nèi)合成過

9、程的反饋性抑制。4. 溫度雖然大多數(shù)植物細胞的適宜生長溫度范圍較寬(22-30)，但在紅豆杉細胞生長和紫杉醇合成過程中，適宜溫度還是起著一定作用。低溫處理對紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)的影響，比較了分別在2、4、6、8下處理12,24，36h以及恢復(fù)12,24，36h對紅豆杉細胞分裂指數(shù)的影響。結(jié)果表明，在2下處理12H，恢復(fù)12h紅豆杉細胞分裂指數(shù)提高了115%，說明低溫對其細胞生長具有誘導(dǎo)作用。中國紅豆杉在24下培養(yǎng)一段時間后，升高溫度至29，再培養(yǎng)14-21d時，紫杉醇含量可達到137.5mg/L，如果21d后仍持續(xù)保持29，紫杉醇含量可在這一峰值保持42d，由此可見，溫度與紫杉醇合成途徑之間有明

10、顯的相關(guān)性。5. pH值培養(yǎng)基pH值在4.87.8時，東北紅豆杉愈傷組織的生長沒有明顯差異。但是培養(yǎng)基pH值對東北紅豆杉和南方紅豆杉愈傷組織生長、紫杉醇含量與苯丙氨酸解氨酶活性的影響后，pH值的高低對紅豆杉愈傷組織生長及紫杉醇含量影響很大，且PAL活性的大小與紫杉醇含量呈正相關(guān)。即PAL活性高，紫杉醇含量往往也高。這可能是因為：在PAL的作用下，由苯丙氨酸脫氨基而形成的肉桂酸參與了Wintersein酸的形成，而Wintersein酸是紫杉醇合成的前體。值得注意的是，有利于愈傷組織生長的pH值卻不利于紫杉醇的積累,而且往往是愈傷組織生長越好,紫杉醇含量越低;生長狀態(tài)較差的,紫杉醇含量反而可能增

11、高。6. 氣體植物細胞在懸浮培養(yǎng)時需要氧氣O2，同時也能非光合地固定一定濃度的二氧化碳，只有O2和CO2的濃度達到某一平衡點時,細胞才會很好地生長，乙烯是植物細胞在不良刺激下產(chǎn)生的一種防御性氣體,對紫杉醇產(chǎn)量的提高不利。對于漿果紅豆杉的懸浮培養(yǎng)細胞，在培養(yǎng)基中維持低濃度的CO2并移走乙烯，同時提供充足的O2能夠促進細胞生長，增加紫杉醇的產(chǎn)量。擴大紫杉醇資源的途徑主要有以下幾個：一、進行紅豆杉樹木的扦插、育苗通過優(yōu)株選擇、品系匹配、控制授粉進行良種選育, 繁育出高生長量、高紫杉醇含量的雜交種苗。南方紅豆杉具有的高生物量性狀與北方紅豆杉具有的高抗逆性狀和紫杉醇高含量性狀通過種間雜交組合, 有望提高

12、原料植物的紫杉醇生產(chǎn)力。研究表明, 對紅豆杉采用營養(yǎng)袋作基質(zhì), 用ABT生根粉浸基部12小時, 在室外常規(guī)管理下, 生根率高達70%90%，且扦插苗根系發(fā)達, 占用土地少, 便于管理, 移栽成活率高。二、進行紫杉醇的化學(xué)合成與半合成全合成紫杉醇。一般采用兩種合成途徑, 一種是線性合成法, 另一種是收斂途徑。兩種途徑均需要2530 步復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)過程, 若實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇, 還有一定的距離。半合成紫杉醇。主要是從紅豆杉的針葉中獲得高含量的10- 去乙酰漿果赤霉素, 以此為原料半合成紫杉醇以及同系物taxotere,taxotere 的抗腫瘤作用與紫杉醇相似。在臨床試驗中, 采用taxote

13、re 治療晚期腫瘤患者, 有效率達40%。由于紅豆杉針葉產(chǎn)量大、再生能力強, 因此, 半合成紫杉醇的原料是很豐富的。三、進行紫杉醇的組織培養(yǎng)近年來, 國內(nèi)外進行愈傷組織培養(yǎng)的紅豆杉或變種已超過10 個, 其中大部分被證實可產(chǎn)生紫杉醇。研究較集中的是歐洲紅豆杉、太平洋紅豆杉、東北紅豆杉等, 選作誘導(dǎo)愈傷組織的外植體包括根、莖、葉、樹皮、形成層、大配子體、種子胚、假種皮、幼苗胚軸等。還有人用發(fā)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化紅豆杉細胞離體培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇及其類似物, 誘導(dǎo)其發(fā)根, 然后大量培養(yǎng)發(fā)根, 從發(fā)根中提取紫杉醇。由于發(fā)根速度較快, 且遺傳性狀穩(wěn)定, 有望成為工業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇的一條新途徑。四、進行紫杉醇的細胞培養(yǎng)自

14、1989年首次利用細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇后, 紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)的研究報告呈逐年增加趨勢, 研究范圍涉及細胞株系的選擇, 細胞生長、紫杉醇生產(chǎn)及營養(yǎng)成分消耗的動力學(xué)、誘導(dǎo)物、菌體、激素的種類和濃度、糖的種類和濃度、生物過程的偶合、生物反應(yīng)器的種類、培養(yǎng)環(huán)境等方面的內(nèi)容。目前利用細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇的研究已經(jīng)進入到生物反應(yīng)器放大階段。五、進行紫杉醇產(chǎn)生菌的工程菌株構(gòu)建與發(fā)酵生產(chǎn)利用生物技術(shù)合成紫杉醇是近年來國內(nèi)外的研究熱點。其中微生物生產(chǎn)紫杉醇的研究取得了突破性進展, 但就目前水平來說, 還達不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的關(guān)鍵問題是紫杉醇產(chǎn)生菌的分離和發(fā)酵液中紫杉醇產(chǎn)量的提高, 這也是構(gòu)建工程菌株的關(guān)鍵, 目前還有許多關(guān)鍵技術(shù)問題需要