一步一步教你使用NCBI新

1、一步一步教你使用NCBI查找 DNA、mRNA、cDNA、Protein 、promoter 、引物設(shè)計、 BLAST序列比對等作者： urbest2007-8-1蘇州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院Part fourPart threePart twoPart one一步一步教你使用NCBI蘇州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳最近看到很多戰(zhàn)友在論壇上詢問如何查詢基因序列、如何進(jìn)行引物設(shè)計、如何使用BLAST進(jìn)行序列比對，這些問題在 NCBI 上都可以方便的找到答案?，F(xiàn)在我就結(jié)合我自己使用 NCBI 的一些經(jīng)歷 （經(jīng)驗） 跟大家交流一下 BCBI 的使用。 希望大家都能發(fā)表自己的使用心得，讓我們共同進(jìn)步！我分以下幾個

2、部分說一下NCBI 的使用：如何查找基因序列、 mRNA、Promoter如何查找連續(xù)的 mRNA、cDNA、蛋白序列運用 STS 查找已經(jīng)公布的引物序列如何運用BLAST進(jìn)行序列比對、檢驗引物特異性特別感謝本版版主，將這個帖子置頂！從發(fā)帖到現(xiàn)在，很多戰(zhàn)友對該帖給與了積極的關(guān)注，在此向給我投票的（以及想給我投票卻暫時不能投票的）各位戰(zhàn)友表示真誠的感謝，謝謝各位戰(zhàn)友！請大家對以下我發(fā)表的內(nèi)容提出自己的意見。關(guān)于 NCBI 其他方面的使用也請水平較高的戰(zhàn)友給予補充First of all，還是讓我們從查找基因序列開始。第一部分 利用 Map viewer 查找基因序列、 mRNA序列、啟動子（ P

3、romoter ）下面以人的IL6 （白細(xì)胞介素6）為例講述一下具體的操作步驟1打開 Map viewer頁面，網(wǎng)址為：/mapview/index.html在 search 的下拉菜單里選擇物種，for后面填寫你的目的基因。操作完畢如圖所示：2點擊“ GO”出現(xiàn)如下頁面：2一步一步教你使用NCBI蘇州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳3在步驟二圖示的右下角有一個Quick Filter,下面是讓你選擇的幾個復(fù)選框，在 Gene前面的小方框里打勾，然后點擊Filter.出現(xiàn)下圖：說明一下 ：1、染色體的紅色區(qū)域即為你的目的基因所處位置。 2、下面參考序

4、列給出了三個，是不同的部門做出來的，經(jīng)我驗證，序列有微小的差異，但總體來說基本相同。盡管你分別點擊后，序列代碼、序列代碼等有所差異，但堿基基本一致，不影響大家研究分析序列?，F(xiàn)在普遍采用的是最上面的那個序列， 這一條是世界范圍的生物科學(xué)家用計算機合成的一個序列。我也推薦大家使用這個序列。3一步一步教你使用NCBI蘇州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳4點擊上述三條序列第一條序列 （即 reference ） 對應(yīng)的 Genes seq ，出現(xiàn)新的頁面，頁面下方為：5點擊上圖出現(xiàn)的 “ Download/View Sequence/Evidence ” ，即下載查看序列等功能，結(jié)果如圖所示：先對上面這張圖做

5、點簡要的說明，在Sequence Format（序列輸出格式）后面是一個下拉式選擇菜單，默認(rèn)的為FASTA格式，還有一個是GenBank格式。我推薦大家選擇GenBnak格式，因為這個格式提供了很多該基因的信息，而FASTA格式只有基因序列。6在 Sequence Format后選擇GenBank，然后點擊下面的Display ，目的基因的相關(guān)信息和序列就出現(xiàn)在眼前了。點擊后如圖所示（網(wǎng)頁較大，只抓取一小部分以作示范）：4一步一步教你使用NCBI蘇州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳在上述打開的網(wǎng)頁中，你可以看到基因長度，基因序列， 以及這個基因是如何被報道出來的等各種信息。你會看到 : mRNAjoi

6、n(3598.3678,3841.4031,5090.5203,5911.6057,7803.8394)這代表了從基因的 3598 位開始就是轉(zhuǎn)錄區(qū)了， 即我們常說的 mRNA片斷，由于內(nèi)含子的存在，所以 mRNA在 DNA序列上分成了幾段。CDS join(3660.3678,3841.4031,5090.5203,5911.6057, 7803.7970)CDS代表編碼序列，即蛋白編碼區(qū)是從3660 開始的（ ATG），由于剪接作用所以CDS區(qū)也是不連續(xù)的。說到這里，可能很多朋友都已經(jīng)明白了promoter即啟動子區(qū)域在哪里了。但我還是再嘮叨幾句： 轉(zhuǎn)錄起始位點前面是基因的調(diào)控區(qū)，啟動子區(qū)

7、沒有明顯的位置定義，大家也只是猜測它的大體位置，如果你要研究promoter區(qū)的話，建議你選擇轉(zhuǎn)錄起始位點前的2000個堿基進(jìn)行研究，一般默認(rèn)的是這樣。當(dāng)然你如果覺得長度太長不好研究的話，也可以只研究-1000 到 0 這一千個堿基，因為一般情況下，啟動子區(qū)的變異都在這個區(qū)域內(nèi)。這樣大家就可以找到自己的目的基因序列和啟動子了，這種方法可能使用的人不是很多，但我個人比較喜歡，因為它最大的優(yōu)點是可以找到啟動子區(qū)域和其他調(diào)控區(qū)域。希望大家可以發(fā)帖交流，讓我們把NCBI 用的更好！5一步一步教你使用NCBI蘇州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳第二部分如何查找連續(xù)的mRNA、cDNA、蛋白序列（依然以人類的 I

8、L6 為例）1進(jìn)入 NCBI 主頁： /在 search 后面選擇Gene，在 for 后面填寫需要查找的基因的名字。如圖所示：點擊“ Go”，出現(xiàn)以下界面：出現(xiàn)了很多基因序列，在每個序列的右邊還有“Order cDNA clone ” 的鏈接，這些序列中有些序列是跟你的目的基因同名的，有些是別名（Other Aliases）與你的目的基因一致，根據(jù)每個序列的介紹認(rèn)真選擇你的目的基因。上圖中我需要的IL6 是標(biāo)號為2 的序列。2.1查找 cDNA序列2.1.1點擊 Order cDNA clone,出現(xiàn)目的頁面如圖所示：6一步一步教你使用NC

9、BI蘇州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳2.1.2 點擊 Clone Sequence 后面的鏈接即可得到 cDNA序列。點擊后如圖所示（只抓取其中一部分） ：2.2查找 mRNA、蛋白序列回到步驟 1 點擊“ Go”之后出現(xiàn)的頁面，點擊目的基因的名字，出現(xiàn)以下頁面( 只抓取7一步一步教你使用NCBI蘇州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳相關(guān)部分 ) ：頁面的下半部分，即可以獲取mRNA和蛋白序列的部分：找到“ NCBI Reference Sequences (RefSeq)”，它分為幾個板塊，第一個“mRNA andProtein”區(qū)可以讓我們找到連續(xù)的編碼mRNA序列和蛋白序列。在mRNAand Prot

10、ein8一步一步教你使用NCBI蘇州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳下面有兩個序列代碼 （中間劃有一個箭頭） ，這代表了 mRNA序列和蛋白序列。 分別點擊就可以得到相應(yīng)的序列頁面。點擊后如圖所示， mRNA 序列：蛋白序列如下：NCBI Reference Sequences (RefSeq)的第二個板塊是Reference assembly ，它下面顯示的是 Genomic ，點擊Genomic 下面 Referenceassembly 對應(yīng)的 Genbank 或 FASTA即可出現(xiàn)編碼的DNA序列 （注意：只是編碼序列，其中包括內(nèi)含子，但一般沒有5非編碼區(qū)） 。這一步就不做貼圖演示了吧，呵呵。這

11、樣我們就可以找到基因的 cDNA 序列、連續(xù)的編碼 mRNA序列、蛋白序列以及含有內(nèi)含子的編碼 DNA序列了。相信這些操作對很多戰(zhàn)友還是有用的。如果大家有更好的方法，歡迎發(fā)帖交流！友情提示：在 NCBI 里打開的每一個頁面都會給我們提供大量的信息，大家不妨好好看看，可能會有令我們驚喜的收獲！最后嘮叨一句： 最近我實驗比較忙， 只能在深夜發(fā)帖， 可能要過幾天再發(fā)第三部分 Part three 運用 STS查找已經(jīng)公布的引物序列 ，希望“期待下集”的朋友可以理解。9一步一步教你使用NCBI蘇州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳第三部分 運用 STS查找已經(jīng)公布的引物序列STS，序列標(biāo)簽位點（ Sequenc

12、e Tagged Site ） ：一段短的DNA序列（ 200500 個堿基對），這種序列在染色體上只出現(xiàn)一次，其位置和堿基順序都是已知的。在PCR反應(yīng)中可以檢測處 STS來， STS適宜于作為人類基因組的一種地標(biāo)，據(jù)此可以判定DNA的方向和特定序列的相對位置。以上內(nèi)容基本是 STS的定義，我主張活學(xué)活用， 下面就介紹一下我個人用 STS數(shù)據(jù)庫查找引物的一點經(jīng)驗。還是使用人的IL6 基因為例，呵呵1 打開 NCBI 主頁，在Search 后面的下拉菜單選擇UniSTS，在FOR后面填寫目的基因。操作完畢如圖所示：點擊 GO以后出現(xiàn)以下頁面，這是你會發(fā)現(xiàn)NCBI 又提供了很多序列，下面我們還是要

13、初步篩選我們需要的序列。10一步一步教你使用NCBI蘇州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳2根據(jù)物種、目的陰物所在染色體的位置等選擇相應(yīng)序列（可能不只一個），點擊。下面以點擊第一個進(jìn)入的畫面為例。你會發(fā)現(xiàn)這個頁面直接就給出了引物序列， PCR 之后的片段長度也是給了的（ 247bp） 。下面還有很多相關(guān)的信息3點擊 GeneBank Accession 后面的代碼，進(jìn)入下一個頁面。11一步一步教你使用NCBI蘇州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳?。∏昂笠锒汲尸F(xiàn)在眼前了，還有反應(yīng)體系和反應(yīng)條件！其中Primer A是前引物序列， Primer B則是后引物序列，并且給出了他們在DNA序列中的位置。有興趣的朋友可

14、以在序列中找一下，是可以找到的， 不過要注意， PCR 是雙鏈擴(kuò)增，在序列中可以直接找到的是 Primer A 的原序列 和 Primer B 的互補序列。在步驟二里面我只點開了一個序列，繼續(xù)打開其他的可能還會有對自己有用的引物，不過這要你自己慢慢發(fā)掘了。這種尋找引物的方法有點投機取巧的味道， 實用程度不是很高， 但如果這里面恰好有你想 P 的片段的話，恭喜你，這些引物都是很成熟的引物，可以直接拿過來使用了。如果想尋找引物， 大家可以查閱相關(guān)論文， 已經(jīng)報道的引物我們?yōu)槭裁床挥媚?？?既省時間，可靠性又強。如果這兩種方法都不能找到你需要的引物的話，那就自己設(shè)計吧， 建議使用Primer 5 和

15、Oligo 。引物設(shè)計的詳細(xì)內(nèi)容我在這里就不多說了，推薦兩個帖子給大家看一下，第一個是本版版主 liuzeyi2002發(fā)起的，內(nèi)容很豐富，很值得學(xué)習(xí)，另一個則是我發(fā)的。/bbs/post/view?bid=64&id=9517792&sty=1&tpg=1&age=0/bbs/post/view?bid=67&id=9523263&sty=1&tpg=1&age=012一步一步教你使用NCBI蘇州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳第四部分 如何運用 BLAST進(jìn)行序列比對、檢驗引物特異性提到序列比對，絕大多數(shù)戰(zhàn)友都會想到 BLAST，但 B

16、LAST的使用確實又是一個很大的難題，因為他的功能比較強悍， 里面涉及到的知識比較多， 而且比對結(jié)束后輸出的結(jié)果參數(shù) （指標(biāo)）又很多。如果把 BLAST的使用詳細(xì)的都講出來，我想我發(fā)帖發(fā)到明天也發(fā)不完，更何況我自己也不是完全懂得BLAST的使用。所以我在這里也就“畫龍點睛”以比對核酸序列為例來給大家介紹一下BLAST的使用，也算是 BLAST的入門課程吧。 請看帖的戰(zhàn)友好好體會，如果你用心看，在看帖完畢之后 BLAST 的基本使用（包括其他序列的比對）應(yīng)該沒有問題了。1打開 BLAST頁面， /BLAST/打開后如圖所示：對上面這個頁面進(jìn)行一

17、下必要的介紹：BLAST的這個頁面主體部分（左面）包括了三部分： BLAST Assembled Genomes、Basic BLAST、Specialized BLAST。相信大家可以看懂這三個短語的意思，我就不多說了；我要說的是，可以認(rèn)為這是三種序列比對的方法，或者說是BLAST的三條途徑。第一部分 BLAST Assembled Genomes就是讓你選擇你要比對的物種，點擊相應(yīng)物種之后13一步一步教你使用NCBI蘇州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳即可進(jìn)入比對頁面。第二部分 Basic BLAST 包含了 5 個常用的 BLAST，每一個都附有簡短的介紹。第三部分 Specialized BL

18、AST 是一些特殊目的的 BLAST，如 IgBLAST、SNP 等等，這個時候你就需要在 Specialized BLAST 部分做出適當(dāng)?shù)倪x擇了?？傊?，這是一個導(dǎo)航頁面， 它的目的是讓你根據(jù)自己的比對目的選擇相應(yīng)的BLAST途徑。下面以最基本的核酸序列比對來談一下BLAST的使用，期間我也會含沙射影的說一下其他序列比對的方法。2 點擊 Basic BLAST 部分的 nucleotide blast鏈接到一個新的頁面。打開后如圖所示：介紹一下上述頁面：Enter Query Sequence部分是讓我們輸入序列的，你可以直接把序列粘貼進(jìn)去，也可以上傳序列， 還可以選擇你要比對的序列的范圍（

19、留空就代表要比對你要輸入的整個序列）。Job Title部分還可以為本次工作命一個名字。Choose Search Set 部分是讓我們選擇要與目的序列比對的物種或序列種類（ genome DNA、mRNA 等等）。如果是人或老鼠的話，就可以直接選擇了如果是其他物種就要選擇“others ”了， 這時候網(wǎng)頁會主動跳出一個下拉對話框和一個輸入式對話框，你可以分別選14一步一步教你使用NCBI蘇州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳擇和輸入要跟你的序列比對的序列種類和物種。下面的Entrez Query可以對比對結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)?shù)南拗?。Program Selection部分其實是讓我們選擇本次比對的精確度，種內(nèi)種間等等。在 BLAST按鈕下面有一個“ Algorithm parameters ” ，這是參數(shù)設(shè)置選項，一般用戶使用不到此項，所以它比較隱蔽，點擊，原網(wǎng)頁下方