血培養(yǎng)采樣、送檢、檢驗(yàn)方法

1、血培養(yǎng)的規(guī)范化操作血培養(yǎng)檢測(cè) 采血指征：對(duì)入院的危重患者未進(jìn)行系統(tǒng)性抗生素治療前，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行血液培養(yǎng)，患者出現(xiàn)以下體征時(shí)可作為采集血培養(yǎng)的重要指征：1 發(fā)熱（38）或低溫（36）。2 寒戰(zhàn)。3 白細(xì)胞增多（1010 9/L，特別有“核左移”未成熟的或帶狀的白細(xì)胞增多。4 粒細(xì)胞減少（成熟的多核白細(xì)胞110 9/L）。5 血小板減少。6 皮膚粘膜出血。7 昏迷。8 多器官衰竭。或同時(shí)具備上述幾種體征時(shí)應(yīng)采血培養(yǎng)。在評(píng)估可疑新生兒敗血癥時(shí)，除發(fā)熱或低燒外，很少培養(yǎng)出細(xì)菌，應(yīng)該補(bǔ)充尿液和腦脊液培養(yǎng)。肺炎鏈球菌與流感嗜血桿菌菌血癥的患兒（特別是2歲以下的幼兒）一般多見于門診，常伴有明顯發(fā)熱（38.5）

2、和白細(xì)胞增多（20109/L）。老年菌血癥患者，可能不發(fā)熱或不低熱，如伴有身體不適，肌痛或中風(fēng)可能是感染性心內(nèi)膜炎的重要指征。血培養(yǎng)檢測(cè) 皮膚消毒程序：血培養(yǎng)為防止皮膚寄生菌污染，可使用消毒劑（碘酊或碘伏）對(duì)皮膚進(jìn)行嚴(yán)格仔細(xì)的消毒處理，最大限度地減低皮膚污染。感染性心內(nèi)膜炎，特別是心臟瓣膜修復(fù)術(shù)的感染，可能由皮膚寄生的微生物引起（例如：表皮葡萄球菌或棒桿菌屬）。因此，在采集過程中血培養(yǎng)的污染一定要減小至最低程度。用做培養(yǎng)的血液均不應(yīng)該在靜脈或動(dòng)脈的導(dǎo)管中抽取，除非靜脈穿刺無法得到血液或用來評(píng)價(jià)與導(dǎo)管感染相關(guān)性指標(biāo)。如果抽取了導(dǎo)管血，也應(yīng)同時(shí)在其他部位穿刺獲取非導(dǎo)管內(nèi)靜脈血液進(jìn)行血培養(yǎng)。皮膚消毒

3、嚴(yán)格按以下步驟進(jìn)行：1 首先用70%酒精擦拭靜脈穿刺部位待30秒鐘以上。2 然后用一根碘酊或碘伏棉簽消毒皮膚（1%-2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒），從穿刺點(diǎn)向外以1.5cm2cm直徑畫圈進(jìn)行消毒。3 最后用70%酒精脫碘。嚴(yán)格執(zhí)行三步消毒后，可行靜脈穿刺采血。注意對(duì)碘過敏的患者，只能用70%酒精消毒，消毒60秒鐘，待穿刺部位酒精揮發(fā)干燥后穿刺采血。血培養(yǎng)檢測(cè) 培養(yǎng)瓶消毒程序：1 用70%酒精或碘溶液（不要使用碘）消毒血培養(yǎng)瓶橡皮塞子。2 酒精作用待60秒。3 在血液注入血培養(yǎng)瓶之前，用無菌紗布清除橡皮塞子表面剩余的酒精，然后注入血液。要點(diǎn)：血培養(yǎng)的關(guān)鍵是防止皮膚寄生菌或環(huán)境引起的污染，

4、由污染菌引起的假陽性增加了患者抗生素的使用量，延長(zhǎng)了住院日，延誤病情診斷并增加了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)等。然而，在理想的消毒條件下，仍有3%5%血培養(yǎng)中混有污染菌，它們來源于皮膚（表皮葡萄球菌，痤瘡丙酸桿菌，梭桿菌屬，類白喉群）或來源于環(huán)境（革蘭陽性芽孢桿菌屬，不動(dòng)桿菌屬），這些微生物有時(shí)有致病作用。對(duì)兩次不同部位血培養(yǎng)生長(zhǎng)同一種微生物，不同類無菌部位標(biāo)本培養(yǎng)中生長(zhǎng)同一種微生物，微生物快速生長(zhǎng)（48h內(nèi)）。上述情況下，應(yīng)考慮是真正的感染。臨床實(shí)驗(yàn)室工作人員和醫(yī)生之間應(yīng)經(jīng)常討論血培養(yǎng)結(jié)果，建立良好的交流關(guān)系對(duì)各方面都有益處。例如查病例回顧性調(diào)查分析：19951999年血中分離的70例凝固酶陰性葡萄球菌，入院4

5、8h內(nèi)檢出者，39.3%（24例）為污染菌，48h后檢出者（9例）100%為污染菌，污染菌檢出時(shí)間顯著長(zhǎng)于病原菌。提示血培養(yǎng)中凝固酶陰性葡萄球菌污染率較高。因此，采血前嚴(yán)格執(zhí)行皮膚消毒程序非常重要。血培養(yǎng)檢測(cè) 采血量：對(duì)從菌血癥或真菌菌血癥患者血培養(yǎng)中獲得微生物，每個(gè)培養(yǎng)瓶抽取的血量是唯一重要的變量。當(dāng)培養(yǎng)的血量從2ml增加到20ml時(shí)，血培養(yǎng)的陽性率增加30%50%，因?yàn)榕囵B(yǎng)的血液量增加1ml，陽性率增加3%5%。用靜脈穿刺獲得的血量，成人和兒童不同。兒童，特別是新生兒很難獲得大量的血液，對(duì)嬰幼兒和兒童，一般靜脈采血1ml5ml用于血培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)菌濃度足夠高時(shí)，血液少于1ml也足以檢測(cè)菌血癥。

6、標(biāo)本量大于1ml，細(xì)菌量也增加，對(duì)于感染的兒童沒毫升血液比成人有更多的微生物。對(duì)于成人血培養(yǎng)的標(biāo)本量少于10 ml不易培養(yǎng)出細(xì)菌，每瓶最低限量應(yīng)是10ml血液，20ml30ml最合適，血液和肉湯的比一般推薦為1:5至1:10。幾乎所有現(xiàn)代的血培養(yǎng)系統(tǒng)假如血液量均在10ml以上。雖然靜脈采血30ml可增加細(xì)菌量，但這不太切合實(shí)際，這很容易造成醫(yī)院獲得性貧血。血培養(yǎng)的數(shù)量和采血時(shí)間：血培養(yǎng)的數(shù)量和采血時(shí)間關(guān)系到菌血癥的病理生理學(xué)，一次靜脈采血注入到多個(gè)培養(yǎng)瓶中應(yīng)視為單次血培養(yǎng)。研究已經(jīng)證實(shí)，采集適量的血液注入23瓶血培養(yǎng)瓶中足以檢測(cè)所有的菌血癥和真菌菌血癥。對(duì)間歇性菌血癥，用于培養(yǎng)的血液應(yīng)在估計(jì)寒

7、戰(zhàn)或體溫高峰到來之前采集，因?yàn)榧?xì)菌流入血液與寒戰(zhàn)發(fā)作通常間隔1h，在發(fā)燒時(shí)血液可能沒有細(xì)菌，實(shí)際上，血培養(yǎng)通常是在寒戰(zhàn)或發(fā)燒后進(jìn)行。由于細(xì)菌很快會(huì)從血液中清除，因此，在寒戰(zhàn)或發(fā)燒后應(yīng)盡快抽取血培養(yǎng)。正是由于這個(gè)原因，我們一般不推薦在任意時(shí)間抽取靜脈血進(jìn)行培養(yǎng)，研究資料表明任意時(shí)間采血并不能提高微生物的檢出率。實(shí)際上已經(jīng)證明在24h內(nèi)同一時(shí)間或任意時(shí)間抽血培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)微生物的結(jié)果相似。無論何時(shí)，采集血培養(yǎng)應(yīng)該在使用抗生素之前進(jìn)行，推薦同時(shí)采集23瓶，每瓶20ml30ml血樣進(jìn)行培養(yǎng)來做最初的平谷，這也更切合實(shí)際。先前餓抗生素治療可能導(dǎo)致血培養(yǎng)結(jié)果陰性，微生物延遲生長(zhǎng)更為常見。有研究證實(shí)，對(duì)鏈球菌心內(nèi)

8、膜炎患者，在做血培養(yǎng)的前兩周內(nèi)患者接受了抗生素治療，血培養(yǎng)的陽性率從97%下降到91%。由于有很好的血培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)感染性心內(nèi)膜炎患者血培養(yǎng)的陽性率應(yīng)該達(dá)到95%以上。對(duì)特殊的全身性和局部感染患者采集血培養(yǎng)的建議：1 懷疑記性原發(fā)性菌血癥、真菌菌血癥、腦膜炎、骨髓炎、關(guān)節(jié)炎或肺炎的患者：應(yīng)立即采集2或3份血培養(yǎng)瓶，快速進(jìn)行血培養(yǎng)。2 不明病源的發(fā)熱，如隱性膿腫，傷寒熱和波浪熱：發(fā)熱開始采集2或3份血培養(yǎng)。24h至36h后，估計(jì)溫度升高之前（通常在下午）立即采集2份以上血培養(yǎng)。3 懷疑菌血癥或真菌菌血癥，血培養(yǎng)結(jié)果持續(xù)陰性，應(yīng)改變學(xué)培養(yǎng)方法，以便獲得罕見的或苛養(yǎng)的微生物。4 感染性心內(nèi)膜炎，對(duì)急性

9、心內(nèi)膜炎患者1h（2h內(nèi)）采集3份血培養(yǎng)，如果所有結(jié)果24h后陰性，再采集3份血培養(yǎng)瓶。入院前兩周內(nèi)接受抗生素治療的患者，連續(xù)三天采集血培養(yǎng)，每天2份。要點(diǎn)：大部分臨床醫(yī)生對(duì)成年患者采集血量不足，采集血培養(yǎng)份數(shù)不夠，采血時(shí)機(jī)不合適，通常在患者體溫高熱時(shí)，24h內(nèi)采集一瓶血培養(yǎng)，降低了血培養(yǎng)的陽性率，不符合才學(xué)的基本規(guī)程，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該做大量宣傳溝通工作。血培養(yǎng)檢測(cè) 運(yùn)輸標(biāo)準(zhǔn)：采血后血培養(yǎng)瓶或采集管應(yīng)立即送到臨床微生物實(shí)驗(yàn)室。血培養(yǎng)瓶和采集管短期內(nèi)置于室溫不影響細(xì)菌檢出，不要冷藏，如果血培養(yǎng)瓶在送往實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)或自動(dòng)化儀器檢測(cè)之前不得已需放置一段時(shí)間，應(yīng)置于3537孵箱中。但含血液的采集管不應(yīng)置于孵箱

10、中，若有細(xì)菌生長(zhǎng)會(huì)釋放出一些氣體，采集管有破裂或滲漏的危險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)室收到血培養(yǎng)瓶后立即進(jìn)行肉眼觀察微生物生長(zhǎng)情況。采用自動(dòng)化連續(xù)檢測(cè)血培養(yǎng)系統(tǒng)，有一點(diǎn)很讓人憂慮，那就是標(biāo)本運(yùn)送有時(shí)被延誤，這樣會(huì)導(dǎo)致微生物檢測(cè)延遲（盡管微生物生長(zhǎng)不受影響），目前很少有人注重這一點(diǎn)。盡管自動(dòng)化連續(xù)檢測(cè)系統(tǒng)有允許延遲上瓶檢測(cè)微生物生長(zhǎng)的原理，培養(yǎng)瓶在運(yùn)送過程中還應(yīng)盡量減少延遲。血培養(yǎng)檢測(cè) 接受標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)室收到血培養(yǎng)后，應(yīng)按以下步驟操作：1 檢查培養(yǎng)瓶確保它們被安全地放置。2 用肉眼觀查微生物生長(zhǎng)的情況，注意血液層上面是否有絮狀沉淀、均勻的或表面下的渾濁、溶血、液體培養(yǎng)基凝固、有一層表面薄膜、產(chǎn)生氣體、血層表面或深層有

11、白色顆粒等，如有上述情況產(chǎn)生提示有微生物生長(zhǎng)。3 檢查瓶子上的標(biāo)簽，確認(rèn)資料是否齊全，與申請(qǐng)單上的患者資料是否一致。4 保證獲得適量的血液。5 檢查血液是否超過要求的基線。6 放置在孵箱中或上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。由于菌血癥和真菌菌血癥的檢測(cè)對(duì)臨床感染性基本的診斷十分重要，實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)認(rèn)真接收血標(biāo)本，對(duì)兒童和承認(rèn)，不管抽血量多少，均應(yīng)該進(jìn)行培養(yǎng)并在報(bào)告單上注明血量，有可能延誤菌血癥或真菌菌血癥的檢測(cè)。血培養(yǎng)檢測(cè) 不規(guī)范處理方法：送到實(shí)驗(yàn)室的血標(biāo)本應(yīng)認(rèn)真處理，減少標(biāo)本錯(cuò)誤和標(biāo)本污染。標(biāo)本處理不當(dāng)及不正確采集，醫(yī)院及實(shí)驗(yàn)室工作人員本身攜帶的病菌均可能造成標(biāo)本污染。因此，建議發(fā)生下列不規(guī)范的血培養(yǎng)時(shí)應(yīng)該及

12、時(shí)處理。1. 血培養(yǎng)或培養(yǎng)管無標(biāo)簽或貼錯(cuò)標(biāo)簽、培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)管有滲漏、破裂或明顯的污染、血標(biāo)本采集后放置12h以上、用不適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)瓶或培養(yǎng)管收集標(biāo)本。處理方法：立即與臨床醫(yī)師聯(lián)系，報(bào)告：“標(biāo)本不規(guī)范的具體理由”。2. 用失效的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)管收集標(biāo)本。處理方法：與醫(yī)生聯(lián)系，報(bào)告：“用過期培養(yǎng)瓶收集血標(biāo)本，請(qǐng)用效期內(nèi)的培養(yǎng)瓶收集標(biāo)本并送檢。3. 送交血標(biāo)本的量不足或只送一瓶血培養(yǎng)。處理方法：與醫(yī)生聯(lián)系，報(bào)告：“送交的血培養(yǎng)標(biāo)本量不足，請(qǐng)補(bǔ)送足量血液培養(yǎng)瓶”。4. 未送推薦的培養(yǎng)瓶數(shù)或類型處理方法：與醫(yī)生聯(lián)系，報(bào)告：如“只送需氧瓶不符合規(guī)程，血培養(yǎng)的基本規(guī)程推薦送兩種培養(yǎng)瓶：需氧瓶和厭氧瓶”。要點(diǎn)：每

13、位臨床醫(yī)師都應(yīng)該對(duì)患者負(fù)責(zé)任，實(shí)驗(yàn)室工作人員發(fā)現(xiàn)不規(guī)范的血標(biāo)本后，應(yīng)該即使同志臨床醫(yī)生以便重復(fù)采集血培養(yǎng)進(jìn)行補(bǔ)救。血培養(yǎng)檢測(cè) 微生物室處理血培養(yǎng)預(yù)防感染的安全程序：1 細(xì)菌室工作人員，在所有的血培養(yǎng)處理過程中都應(yīng)戴乳膠手套。2 拒收不符合安全標(biāo)準(zhǔn)的血培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)管。3 在生物安全柜內(nèi)打開或穿刺培養(yǎng)瓶或家一個(gè)膠膜防護(hù)裝置（如：把培養(yǎng)瓶置于丙烯酸酯膜后或戴上口面罩）。4 在生物安全柜內(nèi)操作肉眼觀察有微生物生長(zhǎng)跡象的培養(yǎng)瓶。5 操作產(chǎn)生的氣溶膠，可能含有高濃度的致病菌或真菌，利用實(shí)驗(yàn)室的方法和技術(shù)采取正確的自我保護(hù)措施。6 用于培養(yǎng)基的塞子和膠帶可能含有高濃度的致病菌，應(yīng)防止接觸。7 正確處理與血培

14、養(yǎng)有關(guān)的污染物。8 立即報(bào)告血培養(yǎng)結(jié)果及抗生素敏感試驗(yàn)結(jié)果。血培養(yǎng)檢測(cè)陽性結(jié)果的處理：傳統(tǒng)手工法血培養(yǎng)應(yīng)該每天至少檢查一次，對(duì)48h72h未生長(zhǎng)的培養(yǎng)瓶至少應(yīng)進(jìn)行需氧傳種培養(yǎng)一次。對(duì)培養(yǎng)瓶進(jìn)行肉眼檢查，注意下列幾點(diǎn)提示有微生物生長(zhǎng)：1 血與肉湯混合物出現(xiàn)渾濁。2 在血液層上有絮狀沉淀，某些鏈球菌在沉積的紅細(xì)胞表面上，會(huì)有小的“棉球樣”生長(zhǎng)。3 肉湯內(nèi)出現(xiàn)渾濁生長(zhǎng)。4 肉湯表面有薄膜生長(zhǎng)。5 出現(xiàn)溶血。6 產(chǎn)生氣體，許多發(fā)酵菌可產(chǎn)氣，梭菌屬會(huì)產(chǎn)生大量的氣體，出現(xiàn)明顯的溶血現(xiàn)象。7 血液層表面或深層有白色顆粒。8 液體培養(yǎng)基凝固。如果懷疑血培養(yǎng)陽性，應(yīng)立即進(jìn)行革蘭染色，以無菌手續(xù)從培養(yǎng)瓶中取肉湯2

15、3滴涂片，自然干燥，加熱固定并染色。染色結(jié)果應(yīng)盡快報(bào)告，如革蘭陽性球菌為成對(duì)或成堆或成鏈，革蘭陰性桿菌為小桿菌或球桿菌等。革蘭染色結(jié)果可指導(dǎo)醫(yī)生為患者經(jīng)驗(yàn)選擇抗生素治療，并作為實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌鑒定補(bǔ)充試驗(yàn)的參考依據(jù)，它對(duì)于鑒別葡萄球菌和鏈球菌非常有用。如果血培養(yǎng)陽性革蘭染色未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，應(yīng)做吖啶橙染色進(jìn)行二次鏡檢，這對(duì)檢測(cè)彎曲菌菌血癥和布魯菌菌血癥很有幫助，而革蘭染色很少發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌。依據(jù)細(xì)菌革蘭染色形態(tài)特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基傳種，見表1。表1。 血培養(yǎng)陽性后根據(jù)革蘭染色特點(diǎn)應(yīng)傳種培養(yǎng)基種類的建議染色特點(diǎn) 5%10%CO2孵育 厭氧氣體孵育血瓊脂 巧克力瓊脂 中國蘭或麥康凱或EMB 血瓊脂 PEA

16、或CAN革蘭陽性 球菌 桿菌 革蘭陰性球菌 桿菌 真菌b 持續(xù)檢測(cè)陽性 革蘭染色陰性c 所有培養(yǎng)至少至48h；EMB；伊紅美藍(lán)瓊脂；PEA；苯乙基醇瓊脂；CAN；多粘菌素-萘啶酮酸瓊脂。增加真菌培養(yǎng)基（如：沙保弱葡萄糖瓊脂）和30培養(yǎng)。接種硫羥乙酸鹽肉湯中。當(dāng)革蘭染色顯示細(xì)菌形態(tài)均一時(shí)，厭氧培養(yǎng)的價(jià)值不大。對(duì)所有培養(yǎng)陽性，革蘭染色陰性的血培養(yǎng)瓶，再次上機(jī)檢測(cè)之前都應(yīng)傳種厭氧和需氧培養(yǎng)皿。革蘭染色為純的細(xì)菌，可進(jìn)行初步鑒定并做直接抗生素藥敏試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)程序，而且沒有經(jīng)FDA批準(zhǔn)的市售產(chǎn)品。可用于初步鑒定的商品試劑，包括：膽汁溶解，DNA酶，乳膠凝集分型實(shí)驗(yàn)等。美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS

17、）推薦的抗生素敏感試驗(yàn)沒有血培養(yǎng)直接敏感試驗(yàn)法。然而，許多學(xué)者提出：根據(jù)革蘭染色初步分析鑒定，可以靈活地選擇抗生素進(jìn)行直接抗生素藥敏試驗(yàn)。對(duì)各種血培養(yǎng)法中的陽性肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行傳種并且立即孵育培養(yǎng)，為進(jìn)一步試驗(yàn)用，傳種5h-7h后有明顯的菌落生長(zhǎng)，取瓊脂表面的菌落用于細(xì)菌鑒定和抗生素敏感試驗(yàn)。使用含固體培養(yǎng)基的血培養(yǎng)系統(tǒng)，如：雙相法，有菌落生長(zhǎng)可直接進(jìn)行細(xì)菌鑒定和標(biāo)準(zhǔn)的抗生素敏感試驗(yàn)。盡管現(xiàn)在使用探針雜交和DNA擴(kuò)增技術(shù)可以鑒定血培養(yǎng)中的細(xì)菌和檢測(cè)抗生素敏感性，但這種技術(shù)不實(shí)用，價(jià)格昂貴，F(xiàn)DA不推薦常規(guī)使用。血培養(yǎng)分離的細(xì)菌，萬一需要進(jìn)一步的研究，至少保存幾個(gè)星期。為了讓細(xì)菌活著，兼性需氧菌和

18、兼性厭氧菌應(yīng)傳種到半固體培養(yǎng)基中，例如動(dòng)力培養(yǎng)基。嚴(yán)格厭氧菌應(yīng)保存到無葡萄糖的肉湯培養(yǎng)基或冷凍在兔血或脫脂牛奶培養(yǎng)基中。柯養(yǎng)菌可以接種到巧克力瓊脂斜面上并用礦物油封存。為長(zhǎng)期儲(chǔ)存，細(xì)菌可懸浮于15%甘油肉湯中并-70冷凍。血培養(yǎng)陽性結(jié)果的報(bào)告程序：血培養(yǎng)陽性結(jié)果十分重要，應(yīng)立即口頭報(bào)告給患者的主治醫(yī)生，報(bào)告的日期和時(shí)間以及接受報(bào)告人的姓名應(yīng)記錄在患者的報(bào)告單上。應(yīng)向臨床醫(yī)師提供重要的信息，包括革蘭染色的形態(tài)，血培養(yǎng)陽性的數(shù)量和其他的鑒定資料，如革蘭陽性球菌可疑為葡萄球菌。處理報(bào)告之前，應(yīng)回顧一下患者近期標(biāo)本的培養(yǎng)情況，這些結(jié)果有助于解釋感染微生物來源。口頭報(bào)告后應(yīng)立即進(jìn)行書面初步報(bào)告。除非初步報(bào)告有錯(cuò)誤或新發(fā)現(xiàn)可改變患者的治療方案，否則不應(yīng)更改初步報(bào)告的結(jié)果。當(dāng)培養(yǎng)24h和48h后，對(duì)陰性血培養(yǎng)結(jié)果在最短的時(shí)間內(nèi)發(fā)出初步報(bào)告。有些實(shí)驗(yàn)室以培養(yǎng)的時(shí)間長(zhǎng)短發(fā)初步報(bào)告，例如：“血培養(yǎng)3天后無細(xì)菌生長(zhǎng)”。血培養(yǎng)檢測(cè) 真菌培養(yǎng)：多種方法可提高血