簡述真核生物斷裂基因在大腸桿菌表達(dá)的基本實(shí)驗(yàn)步驟

1、簡述真核生物斷裂基因在大腸桿菌表達(dá)的基本實(shí)驗(yàn)步驟真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式一般可分為3 類: ( 1) 細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá), 即以包涵體形式存在;( 2) 細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá); ( 3) 蛋白分泌型表達(dá)。下面分別予以討論:1. 細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的最大問題就是形成不溶性的包涵體, 包涵體是細(xì)菌表達(dá)的蛋白質(zhì)在胞內(nèi)互相凝集而形成的無活性固體顆粒, 具有很強(qiáng)的折光性。其形成的原因有: 目的基因的過度表達(dá), 使蛋白質(zhì)無足夠時(shí)間進(jìn)行肽鏈折疊, 產(chǎn)生凝集; 種種原因引起的蛋白質(zhì)不能正確折疊; 蛋白質(zhì)的性質(zhì)及溫度、pH 值等環(huán)境條件的影響等。近年來基于蛋白質(zhì)折疊理論的研究, 普遍認(rèn)為, 許多蛋白質(zhì)的

2、天然構(gòu)象并不是自發(fā)地一步折疊而成, 而是在一些輔助蛋白的協(xié)助下經(jīng)許多中間態(tài)逐步形成。包涵體的形成, 是由于肽鏈折疊過程中部分折疊的中間態(tài)之間的特異性錯(cuò)誤聚合, 而不是形成成熟的天然態(tài)或完全解鏈的蛋白。包涵體的形成對表達(dá)產(chǎn)物的活性不利, 但卻有利于蛋白質(zhì)的純化。1. 1包涵體的分離: 為了獲得包涵體, 常采用機(jī)械法破碎菌體, 如高壓均質(zhì)機(jī)和超聲波破碎, 也可加溶菌酶超聲波相結(jié)合。菌體破碎后, 經(jīng)洗滌、離心( 5 00020 000 r/ min, 15 min) 分離, 即得包涵體。1. 2包涵體的溶解: 通常采用變性劑。對絕大多數(shù)包涵體而言, 在pH8. 0 條件下, 68 mo l/ L 尿

3、素或58 mol / L 鹽酸胍即可將其溶解。另外, 去垢劑、有機(jī)溶劑、堿性環(huán)境( pH 9. 0)也可使包涵體溶解。如包涵體中蛋白含兩個(gè)以上二硫鍵, 則還需加入還原劑如2-巰基乙醇和2-巰基蘇糖醇等, 使二硫鍵處于可逆斷裂狀態(tài)。1. 3重組蛋白的復(fù)性: 包涵體溶解后, 其結(jié)合的蛋白互相分離, 呈變性狀態(tài), 即所有的氫鍵、疏水鍵全被破壞, 但一級結(jié)構(gòu)保持完好, 因此去除溶解劑時(shí), 一部分蛋白可自動(dòng)折疊成具有活性的正確構(gòu)型, 這一過程即復(fù)性。目前復(fù)性方法主要有稀釋法、透析法和層析法( 或超濾) 。對于具有二硫鍵的重組蛋白, 復(fù)性時(shí)還涉及到二硫鍵的正確重組。一般用空氣中的氧氣即可使還原型半胱氨酸殘

4、基形成二硫鍵, 也可加入微量硫化物如2-巰基乙醇、氧化型和還原型谷胱甘肽, 促進(jìn)正確二硫鍵的形成。2. 細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)2. 1共表達(dá)分子伴侶和折疊酶: 為了克服包涵體的形成, 常用的策略是在表達(dá)外源基因的同時(shí), 共表達(dá)分子伴侶和折疊酶。分子伴侶( Chapero nes) 是細(xì)胞內(nèi)催化及維持其它蛋白正確構(gòu)象的一類蛋白質(zhì)分子, 它們識別、結(jié)合和穩(wěn)定部分折疊的蛋白中間體, 避免不適當(dāng)?shù)姆肿娱g及分子內(nèi)作用, 但并不催化二級結(jié)構(gòu)形成。大腸桿菌的分子伴侶有GroES/ GroEL、Dnak/ DnaJ、SecB、PapD 等。與分子伴侶不同, 折疊酶具催化異構(gòu)作用, 限制蛋白變性速率。氧化還原酶Dsb

5、B 及肽脯氨酰異構(gòu)酶( PPlase) 催化大腸桿菌中x-pro 肽鍵的異構(gòu)反應(yīng)。非受體蛋白酪氨酸激酶在大腸桿菌中表達(dá)多形成包涵體。Caspers 等將酪氨酸激酶Csk、Fyn 或Lck 等非受體蛋白與DnaK、DnaJ、GrpE 或GroEL、GroES 等共表達(dá), 得到了可溶蛋白。2. 2表達(dá)融合蛋白: 目的蛋白與具強(qiáng)親和力配體的多肽或蛋白構(gòu)成重組融合蛋白, 然后利用固定化親和層析方法純化該蛋白。C-MyC 表位抗原和同感生物素序列分別與目的蛋白基因融合后, 利用親和層析分離純化目的蛋白。金屬親和層析( IMAC) 基于固定化的金屬離子與蛋白上供電子基團(tuán)的親和作用。半胱氨酸、組氨酸、色氨酸

6、和精氨酸側(cè)鏈多用于IMAC 結(jié)合。單個(gè)組氨酸融合于LgG1k 重鏈, IMAC 一步純化重組Fab 片段。McCoy 等還發(fā)現(xiàn)11 種不同的淋巴因子分別與thior tdox in 構(gòu)成融合蛋白, 在低溫下以溶解狀態(tài)高水平表達(dá), 其中幾種融合蛋白具有天然蛋白的生物活性。此外, 還可通過改變發(fā)酵條件, 如降低發(fā)酵溫度, 加入不能代謝的糖, 降低培養(yǎng)基的pH 值等等,來減少重組蛋白的聚集進(jìn)而改善溶解性。3.蛋白分泌型表達(dá): 蛋白分泌型表達(dá)又可根據(jù)表達(dá)場所的不同分為周質(zhì)分泌表達(dá)和胞外分泌表達(dá)。3. 1周質(zhì)分泌表達(dá): 是通過將外源基因融合到編碼原核蛋白的信號肽序列的下游而實(shí)現(xiàn), 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分泌到位于大腸

7、桿菌細(xì)胞內(nèi)膜與細(xì)胞外膜之間的周質(zhì)時(shí), 信號肽可被信號肽酶切除, 而獲得具有天然一級結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。同時(shí)氧化性的周質(zhì)間隙可以模擬真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境, 便于新生肽鏈折疊成天然結(jié)構(gòu), 從而獲得具有完全生物活性的重組蛋白。此外, 一些可被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶所降解的蛋白質(zhì)在周質(zhì)中穩(wěn)定性提高。周質(zhì)分泌亦存在一些問題, 如表達(dá)量低, 僅占細(xì)菌總蛋白的0. 3% 4% ; 信號肽不被切割或不在特異位置切割等。3. 2胞外分泌表達(dá): 重組蛋白分泌到胞外可以使二硫鍵正確折疊, 避免蛋白質(zhì)在胞內(nèi)聚集, 形成包涵體, 而且還可使重組蛋白的下游純化較為簡單, 便于大規(guī)模放大處理。目前, 使異源蛋白分泌到培養(yǎng)基的系統(tǒng)主要有A-溶血素( haemolysin A,HLy A ) 系統(tǒng)和細(xì)菌素釋放蛋白( bacteriocin releasepr otein, BRP) 系統(tǒng)。HLyA 系統(tǒng)是將真核基因融合在HLyA 的N 端, 利用HLyA 能直接從胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外的特點(diǎn), 將重組蛋白分泌到培養(yǎng)基中。陳燕等將胰島素原基因融合到金黃色葡萄球菌蛋白A 的基因上, 構(gòu)建成大腸桿菌中基因融合的外分泌表達(dá)載體, 它能高效表達(dá), 且有效地分泌表達(dá)產(chǎn)