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文檔簡介
1、總蛋白含量測定操作規(guī)程1 目的 確??谔阋邷缁钜呙缈偟鞍缀繙y定(lowry)操作規(guī)程2 范圍 適用于口蹄疫滅活疫苗總蛋白量測定。3 責任部門QC部相關檢驗人員4 內(nèi)容4.1 準備4.1.1 設備酶標儀(全波長),“M”型96孔板,卡介苗注射器,單通道和多通道移液器,渦旋震蕩儀,酶標板振蕩器等。4.1.2 試劑丙酮(分析純)、無菌去離子水、商品化Lowry法改良試劑盒4.2操作步驟4.2.1 標準系列稀釋液制備將商品化試劑盒內(nèi)標準牛血清白蛋白(2mg/ml母液),按下表依次稀釋。編號123456789母液(l)052550100150200300400去離子水(l)40039537535030
2、02502001000終濃度(g/ml)0251252505007501000150020004.2.2 檢驗疫苗處理取1瓶疫苗(不少于100ml)恢復至室溫搖勻后,在3個1.5 ml離心管中分別精確加入100l疫苗和900l丙酮,充分混勻,室溫放置10分鐘,在4條件下,以15000 g離心15分鐘。吸棄液相,沉淀物用400l丙酮洗滌2次,室溫干燥約15分鐘,加50l去離子水復溶備用。4.2.3 反應板加樣與讀數(shù)4.2.3.1 各取2.1稀釋的各濃度牛血清白蛋白標準溶液40l,以及三重復待檢疫苗樣品40l,分別加入到96孔板內(nèi)。用排槍迅速加入200l改良lowry法試劑盒內(nèi)試劑,立即用振蕩器混
3、勻30秒;4.2.3.2 封膜,室溫孵育10分鐘;4.2.3.3 各孔內(nèi)分別加入20l 1倍酚試劑(試劑盒內(nèi)為2倍,用前用去離子水現(xiàn)稀釋),立即用振蕩器混勻30秒;4.2.3.4 封膜,室溫孵育30分鐘;4.2.3.5 酶標儀測定750nm吸光值,保存讀數(shù)。4.2.4 數(shù)據(jù)處理根據(jù)系列標準蛋白稀釋液的濃度(0g/ml2000g/ml)和750nm吸光值,使用EXCEL以吸光值為X軸,以蛋白標準濃度為Y軸,繪制標準曲線,依據(jù)趨勢線求得多項式,其多項式R20.98。將被檢樣品的吸光值代入標準蛋白獲得的多項式,計算樣品中蛋白含量,根據(jù)取樣量求得1ml樣品中蛋白含量。例如口蹄疫滅活疫苗水相/油相比例為
4、1:1,免疫劑量為2ml時,100l疫苗經(jīng)丙酮沉淀后用50l去離子水復溶,測得濃度即為每頭份疫苗中蛋白濃度,或2ml疫苗中蛋白濃度。結果判定時,將測定值除以2即得每毫升疫苗中總蛋白含量。4.2.5 結果判定若測定結果為每毫升疫苗總蛋白含量小于或等于500g,則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規(guī)定;若測定結果為每毫升疫苗總蛋白含量大于500g,判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規(guī)定。4.2.6 檢測數(shù)據(jù)處理舉例4.2.6.1 收集數(shù)據(jù)如表所示Value123456789101112A0.1020.1490.3360.5040.8361.1221.3341.7021.923-B0.6771.7220.2521
5、.1162.1671.020-C0.6401.7040.2301.0502.1950.962-D0.6411.7160.2251.0612.1751.012-E-F-G-H-上述表格中,A1-A9為系列稀釋的標準牛血清白蛋白溶液,A1至A9蛋白濃度依次增高;B、C、D行中1-6列為檢測樣品750nm吸光值,B1-B6為6批不同批次疫苗樣品,每一列為同一疫苗樣品三個重復。4.2.6.2 繪制標準曲線:將上表中數(shù)據(jù)復制到EXCELL表格中,Value123456789OD7500.1020.1490.3360.5040.8361.1221.3341.7021.923蛋白濃度g/ml02512525
6、0500750100015002000采用EXCEL程序,選中1-9列對應的兩行數(shù)據(jù)插入散點圖,選擇帶平滑線和數(shù)據(jù)標記的散點圖,得到以750nm吸光值為X軸,以蛋白濃度為Y軸的曲線圖。選擇圖表工具中布局 趨勢線其他趨勢線選項,選中多項式、顯示公式和顯示R平方值。通常R平方值大于等于0.98表明標準曲線可信。每一塊96孔板應設一組標準并繪制相應標準曲線。4.2.6.3 數(shù)值計算以樣品測定OD750值為X,代入y = 411.69x2+ 220.65x - 3.9423,Y為蛋白濃度,以表中第一批疫苗測定結果為例。該疫苗三重復測定的OD750數(shù)據(jù)(X)分別為:0.677、0.640、0.641,代入公式計算蛋白含量(Y)分別為:334g/ml、306g/ml、307g/ml,該數(shù)據(jù)為每毫升水相抗原中總蛋白含量。計算三重復數(shù)值的平均值(AVERAGE)為316g/ml,標準差(STDEV.P)為13.1,變異系數(shù)為4.15%(標準差/平均值*100%),將每毫升水相抗原中總蛋白含量,除以2折算為每毫升疫苗總蛋白含量,該疫苗的總蛋白含量為138g/ml。按照上述方法,可計算其他樣品的總蛋白含量。4.2.6.4 結果判定同一樣品不同重復間變異系數(shù)應小于5.3%,否則試驗不成立,應重做。4.3 清場4.3.1 將所有試液、指示劑及相關化學試劑放回原處,并填寫理化室化學試劑使用記錄。4.3.2
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