單克隆抗體藥物概述

1、單克隆抗體藥物概述 高熹（2015級 交流學(xué)院 生物技術(shù) 1）摘要：單克隆抗體藥物作為一種具有獨(dú)特優(yōu)勢的生物靶向藥物，具有特異性高、靶向性強(qiáng)和毒副作用低的特點(diǎn)，在治療方面效果顯著。伴隨著抗體技術(shù)的不斷發(fā)展以及新型抗體的不斷出現(xiàn)，單克隆抗體藥物已成為制藥業(yè)發(fā)展最快的領(lǐng)域之一，目前正在研究的生物技術(shù)藥物中有四分之一都是單克隆抗體藥物，期間又涌現(xiàn)出了各種單抗衍生物，包括抗體藥物偶聯(lián)物、小分子抗體、雙特異性抗體等。本文就單克隆抗體藥物的分類、制備、應(yīng)用和發(fā)展等進(jìn)行綜述。關(guān)鍵詞：單克隆抗體藥物；抗體技術(shù)；單抗衍生物 1975年分子生物學(xué)家G.J.F.克勒和C.米爾斯坦在自然雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建立雜交瘤

2、技術(shù)，他們把可在體外培養(yǎng)和大量增殖的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)抗原免疫后的純系小鼠B細(xì)胞融合，成為雜交細(xì)胞系，既具有瘤細(xì)胞易于在體外無限增殖的特性，又具有抗體形成細(xì)胞的合成和分泌特異性抗體的特點(diǎn)。將這種雜交瘤作單個細(xì)胞培養(yǎng)，可形成單細(xì)胞系，即單克隆。雜交瘤技術(shù)為規(guī)?；a(chǎn)特異性高、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)均一穩(wěn)定的單克隆抗體提空了有力的保障。1 單克隆抗體藥物的發(fā)展和現(xiàn)狀1986年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了第一個鼠源單克隆抗體藥物Muromonab-CD3上市，用于預(yù)防腎移植時急性器官排斥。單克隆抗體藥物的發(fā)展因人抗鼠抗體反應(yīng)在1988年到1993年間陷入低谷。之后隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展，各種抗體人緣化技術(shù)迅速發(fā)展，單克隆抗

3、體藥物經(jīng)歷了人鼠嵌合單抗、人源化單抗階段。隨后出現(xiàn)的噬菌體展示文庫技術(shù)和轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)，使全人源單抗的產(chǎn)生成為可能。過去的30年抗體工程的研究主要集中于減弱鼠源抗體的免疫原性和提高產(chǎn)生抗體的能力，如今全人源抗體已成為治療性單抗的主流，2002年第一個全人源抗體阿達(dá)木單抗上市。且隨著微生物和哺乳動物細(xì)胞等外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)的技術(shù)進(jìn)步和表達(dá)水平的提高，使治療性單克隆抗體在臨床和商業(yè)上都取得了巨大的成功。盡管如此，單克隆抗體藥物的發(fā)展仍然存在許多挑戰(zhàn)。迄今為止，大多數(shù)FDA 批準(zhǔn)上市的單抗藥物都是未經(jīng)修飾的全長抗體，這是相對分子質(zhì)量在150103左右的大蛋白分子，這些抗體藥物在臨床應(yīng)用取得巨大成功的同

4、時，本身的局限性也得到越來越多的關(guān)注1?，F(xiàn)如今，單抗藥物經(jīng)歷了市場和時間的考驗(yàn)，已經(jīng)成為生物醫(yī)藥的最重要組成部分，在疾病治療上具有廣闊的應(yīng)用前景，成功用于治療腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反應(yīng)等多種疾病。治療性單抗的安全性和有效性很大程度上由其作用的靶點(diǎn)決定，上市和在研的單抗藥物有些靶向相同的靶點(diǎn)，有些有自己獨(dú)特的作用靶點(diǎn)，新的作用靶點(diǎn)也在不斷地出現(xiàn)。隨著研究深入、技術(shù)進(jìn)步，單抗藥物呈現(xiàn)出旺盛的發(fā)展勢頭2。隨著已上市品種的銷售額不斷增長以及新適應(yīng)癥的批準(zhǔn)和新品種的上市，單克隆抗體藥物市場容量迅速攀升。1997-2007年是全球單抗產(chǎn)業(yè)增長的爆發(fā)期，十年間CAGR高達(dá)58.6%。20

5、08年-2015年，全球單抗產(chǎn)業(yè)增速放緩明顯，CAGR降至14.8%，但仍要顯著高于全球醫(yī)藥行業(yè)約5%的增速水平。1997年全球單抗藥物銷售額僅3.7億美元，2015年全球單抗藥物的銷售額已超過980億美元。1992-2015 年間，國外共批準(zhǔn)上市了61個原研抗體藥，其中后有6個退市。在現(xiàn)有上市的55個產(chǎn)品（49個單抗產(chǎn)品，6個具有抗體功能的受體-Fc融合蛋白）中，51個是由美國或歐盟首先批準(zhǔn)上市的，數(shù)量占比高達(dá) 92.7%，生產(chǎn)企業(yè)方面：羅氏、諾華等10家歐美企業(yè)共開發(fā)和生產(chǎn)了全球70%以上的抗體藥物，歐美國家在全球抗體產(chǎn)業(yè)中居于絕對主導(dǎo)地位。2015年全球最暢銷藥物TOP 10中有5個單抗

6、，分別是阿達(dá)木單抗、英夫利昔單抗、利妥昔單抗、貝伐珠單抗和曲妥珠單抗，它們占據(jù)了單抗藥物的半壁江山，銷售額約為426.6億美元，約占2015年全球單克隆抗體藥物總銷售額的44%。根據(jù)預(yù)測，2016-2020 年，全球單抗產(chǎn)業(yè)仍將以9.84%的RAGR快速發(fā)展（同期全球藥品市場CAGR約為 5%），2020年市場規(guī)模有望突破1300億美元。相比處于上升期的國外單抗產(chǎn)業(yè)，我國單抗產(chǎn)業(yè)仍處于初創(chuàng)期，單抗藥物仍以仿制為主，單抗藥物無論產(chǎn)品種類和銷售規(guī)模都遠(yuǎn)低于歐美發(fā)達(dá)國家，并且進(jìn)口單抗藥物占據(jù)了主要市場。2015年中國單抗藥物市場容量約為70多億元人民幣，約80%的市場被外資制藥企業(yè)占據(jù)。在單抗藥物領(lǐng)

7、域，國內(nèi)制藥企業(yè)面臨市場快速增長和進(jìn)口替代的雙重機(jī)遇。單克隆抗體研究已被列入863計劃和國家重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目。十三五期間，生物產(chǎn)業(yè)將是國家重點(diǎn)支持的戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)。單抗藥物的研究、開發(fā)和市場應(yīng)用必將吸引一大批制藥企業(yè)的參與和布局。目前全國有100多家企業(yè)在做單抗，除了中信國健、百泰生物、海正藥業(yè)等一些老牌企業(yè)之外，近幾年還涌現(xiàn)出了很多新興企業(yè)，包括麗珠單抗、信達(dá)生物等。在2016三生制藥集團(tuán)媒體開放日活動上，三生制藥集團(tuán)董事長婁競博士表示三生制藥集團(tuán)的3萬升生產(chǎn)線建成后將成為中國規(guī)模最大的單克隆抗體生產(chǎn)線，也是從細(xì)胞系、培養(yǎng)基、原液到制劑（多種劑型和規(guī)格）的全球最完整生產(chǎn)線之一。2 單克隆抗體藥物

8、分類根據(jù)來源的不同.單克隆抗體大體可分為4類,即鼠源化單克隆抗體、人鼠嵌合體單克隆抗體、人源化單克隆抗體、全人源化單克隆抗體3，這也是單克隆抗體發(fā)展的四個重要的階段。2.1 鼠源化單克隆抗體人用鼠源單抗的生產(chǎn)方法一般分為體內(nèi)法和體外法2種。2.1.1 體內(nèi)法體內(nèi)法即腹水法。盡管腹水中抗體濃度比較高(2-10mg/ml),但由于所用的BALB/c小鼠必須達(dá)到SPF級,繁殖、飼養(yǎng)BALB/c小鼠及生產(chǎn)腹水、純化抗體的廠房必須符合GMP要求,WHO及我國對體內(nèi)法生產(chǎn)的人用鼠源單克隆抗體的質(zhì)檢項(xiàng)目繁多,要求嚴(yán)格,因此限制了體內(nèi)法在人用鼠源單抗生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用。2.1.2 體外法體外法(雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)

9、法)的產(chǎn)品純度高,可以避免鼠類病毒的污染,簡化質(zhì)檢項(xiàng)目,操作具有可控制性,適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn),因此是人用鼠源單抗生產(chǎn)方式的主要發(fā)展方向4。體外法的制備流程也基本相同，即從超免疫的供體中即抗原免疫的小鼠獲取脾細(xì)胞，選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞，待細(xì)胞融合后，對單個細(xì)胞進(jìn)行克隆，體外培養(yǎng)出能分泌單抗的克隆細(xì)胞。但鼠源單抗在臨床應(yīng)用方面存在著很大的弊端，主要是鼠源單抗與NK等免疫細(xì)胞表面Fc段受體親和力弱，產(chǎn)生的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）較弱，而且它與補(bǔ)體成分結(jié)合能力低，對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力較弱，并且鼠源性抗體分子質(zhì)量較大,在人血循環(huán)中的半衰期短，在體內(nèi)穿透血管的能力較

10、差;它發(fā)揮ADCC作用的時間較短；其次鼠單克隆抗體還具有免疫原性，易引起宿主過敏反應(yīng)5，產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMAs)，將其清除出體外，因此限制了它的應(yīng)用。2.2 人鼠嵌合單克隆抗體抗體分子由兩個相同的輕鏈和兩個相同的重鏈組成，具有典型的功能區(qū)結(jié)構(gòu)，其與抗原的結(jié)合完全取決于氨基端的可變區(qū)。恒定區(qū)與抗體抗原結(jié)合無關(guān)，并且恒定區(qū)是抗體分子免疫原性的主要部位，因此可通過用人的恒定區(qū)取代鼠單抗的恒定區(qū)進(jìn)行人源化，消除其大部分異源性，并能保留親本鼠單抗結(jié)合抗原的特異性和親和力，這種方法得益于DNA重組技術(shù)的發(fā)展。1984年首次應(yīng)用上述方法重組制備了抗半抗原磷酸膽堿的全分子人鼠嵌合抗體6。嵌合抗體可將同一個

11、可變區(qū)與不同類別的恒定區(qū)鏈接在一起，比較在相同特異性情況下不同類別的功能。其制備過程主要包括了可變區(qū)的克隆，表達(dá)載體的構(gòu)建及嵌合抗體的表達(dá)?？勺儏^(qū)基因的克隆在早期主要從雜交瘤細(xì)胞的基因組文庫中克隆出來帶有完整上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的輕重鏈可變基因DNA片段，組裝到含有人恒定區(qū)的表達(dá)載體中。PCR方法的建立和發(fā)展為抗體可變區(qū)基因的克隆提供了簡便有效的方法。接著將控制小鼠抗體重鏈和輕鏈中可變區(qū)的基因片段與人抗體重鏈及輕鏈的不變區(qū)的基因片段在體外鏈接形成重組基因，然后導(dǎo)入真核細(xì)胞的某種表達(dá)質(zhì)粒中，再將這種含有重組基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化哺乳動物骨髓瘤細(xì)胞，篩選能分泌完整抗體的轉(zhuǎn)化子。但嵌合抗體仍保留著30%左右

12、的鼠源序列，并且其常達(dá)不到預(yù)期的效果。嵌合抗體目前主要有3種應(yīng)用形式：嵌合免疫球蛋白G、嵌合Fab和嵌合,F（ab）2。嵌合免疫球蛋白G因含有人抗體的Fc段，能介導(dǎo)補(bǔ)體及細(xì)胞對靶抗原的殺傷和吞噬作用，但因鼠源性成分較多，免疫原性大且組織穿透力差7；嵌合 Fab 和嵌合F（ab）2抗體分子小、穿透力強(qiáng)，可充當(dāng)小分子載體用于放射免疫顯像及放射免疫治療。 2.3 人源化單克隆抗體 由于鼠源抗體的可變區(qū)仍殘留一定的免疫原性人緣化單克隆抗體又較嵌合抗體有所改進(jìn)。由于鼠源性抗體可變區(qū)中的骨架區(qū)仍殘留一定的免疫原性，為了最大限度地減少鼠源成分，用人骨架區(qū)替代鼠骨架區(qū)可形成更為完全的人源化抗體，即在此抗體中除

13、了CDR是鼠源以外，其余全部是人源結(jié)構(gòu)。這一類型的抗體被稱為CDR移植抗體或改型抗體，包括完全CDR移植抗體、部分CDR移植抗體和特異決定區(qū)（SDR）移植抗體8。2.3.1 完全CDR移植抗體完全CDR移植抗體由于鼠源性抗體VR中的骨架區(qū)仍殘留一定的免疫原性，為最大限度的減少鼠源成分，用人FR替代鼠FR可形成更為完全的人源化抗體，即在此抗體中除了個CDR是鼠源以外，其余全部是人源結(jié)構(gòu)，這一類型的抗體稱為CDR移植抗體或改型抗體。應(yīng)用這一策略，將鼠源McAb的CDR區(qū)完全移植，得到了抗磷脂酰肌醇（蛋白）聚糖嵌合抗體。但隨后多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，簡單的CDR移植往往明顯降低抗原抗體反應(yīng)的親和力，甚至喪失與

14、抗原結(jié)合的能力。其原因在于FR不僅作為骨架對CDR起到支持作用，F(xiàn)R中的某些非CDR區(qū)補(bǔ)充調(diào)控殘基還為CDR的回折構(gòu)象提供必要的支持，其形狀和側(cè)鏈大小協(xié)同決定CDR的基本結(jié)構(gòu)，影響CDR與抗原結(jié)合的特異性和親和力9-10。2.3.2 部分CDR移植抗體在簡單CDR移植的基礎(chǔ)上又相繼發(fā)展了部分CDR移植技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)輕鏈的 CDR1、CDR2和重鏈的CDR3對保證抗體與抗原特異性結(jié)合至關(guān)重要，其余三個CDR的作用則較低11。因此只將抗體結(jié)合抗原必須的CDR移植到人抗體的FR骨架上即能獲得對人免疫原性更小的嵌合抗體，這類抗體稱為部分CDR移植抗體。2.3.3 特異決定區(qū)移植抗體正如并非所有的CDR

15、在抗原抗體反應(yīng)中具有同樣的重要作用，X射線晶體衍射實(shí)驗(yàn)提示具體到一個CDR中,不是所有的蛋白分子都參與抗原的特異性識別。執(zhí)行抗原識別的CDR中的一些特定區(qū)域稱為SDR。由此又產(chǎn)生了SDR移植抗體。該抗體是將McAb中與抗原結(jié)合密切相關(guān)的SDR等少數(shù)殘基移植到人抗體的相關(guān)部位，從而進(jìn)一步提高抗體的人源化水平。根據(jù)目前的研究，抗體輕鏈的SDR多位于27d、34、50、55、89、96位殘基，而重鏈的SDR多位于31、35b、50、58、95、101位殘基12?；谏鲜鰞煞N策略，部分CDR移植、SDR移植的構(gòu)建方法主要有：（1）模板替換，使用與鼠對應(yīng)部分有較大同源性的人FR替換鼠FR；（2）表面重塑

16、，對鼠 CDR和FR表面殘基進(jìn)行鑲飾或重塑，使其具有類似于人抗體CDR的輪廓或人FR的形式；（3）補(bǔ)償變換，對起關(guān)鍵作用的殘基進(jìn)行改變以補(bǔ)償完全的CDR移植；（4）定位保留，人源化McAb以人FR保守序列為模板，但保留了鼠源McAb VR中參與抗原結(jié)合的氨基酸殘基，包括CDR和FR中的一些關(guān)鍵殘基。2.4 全人源單克隆抗體由于免疫原性的存在，人們一直在努力制備全人源化的單克隆抗體，目前主要有抗體庫技術(shù)和人源性抗體轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)兩種。2.4.1 抗體庫技術(shù)抗體庫技術(shù)的主導(dǎo)思想是將某種動物的所有抗體可變區(qū)基因克隆在質(zhì)?；蚴删w中表達(dá)，利用不同的抗原篩選出攜帶特異抗體基因的克隆，從而獲得相應(yīng)的特異性

17、抗體?？贵w庫技術(shù)不僅可以模擬動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的過程，還具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，令雜交瘤技術(shù)難以相比?？贵w庫技術(shù)無需免疫，從理論上講，106-108的庫容就可能包容所有的抗體。利用抗原即可直接從非免疫動物抗體庫中篩選出特異性抗體，并能篩選到針對該物種自身抗原的抗體。從人的抗體庫中可以得到完全是人源的McAb，克服了難以用雜交瘤技術(shù)獲得人源McAb的障礙。此外，由于細(xì)菌細(xì)胞增殖快，培養(yǎng)成本低廉，利于大量制備高純度抗體。抗體庫技術(shù)主要包括了噬菌體抗體庫和核糖體展示技術(shù)。噬菌體抗體庫技術(shù)：從免疫或未被免疫的B細(xì)胞中分離抗體可變區(qū)基因;PCR 擴(kuò)增抗體全套基因片段(如VH、VL)，將體外擴(kuò)增的VH、VL

18、基因片段隨機(jī)克隆入相應(yīng)載體,形成組合文庫;將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因(g3) 或基因(g8) 的先導(dǎo)系列的緊靠下游，使外源基因表達(dá)的多肽以融合蛋白的形式展示在外殼蛋白gp或gp的N端。用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合洗脫擴(kuò)增”數(shù)個循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達(dá)特異性好、親和力強(qiáng)的抗體噬菌體庫。核糖體展示技術(shù)：將基因型和表型聯(lián)系在一起，編碼蛋白的DNA在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄與翻譯，由于對DNA進(jìn)行了特殊的加工與修飾，如去掉3末端終止密碼子，核糖體翻譯到mRNA末端時，由于缺乏終止密碼子，停留在mRNA 的3末端不脫離，從而形成蛋白質(zhì)-核糖-2mRNA三聚體，將目標(biāo)蛋白特異性的配基固相化，如

19、：固定在ELISA 微孔或磁珠表面，含有目標(biāo)蛋白的核糖體三聚體就可在ELISA 板孔中或磁珠上被篩選出，對篩選分離得到的復(fù)合物進(jìn)行分解，釋放出的mRNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶鏈聚合反應(yīng)(RT-PCR)，PCR產(chǎn)物進(jìn)入下一輪循環(huán)，經(jīng)過多次循環(huán)，最終可使目標(biāo)蛋白和其編碼的基因序列得到富集和分離。2.4.2 人源性抗體轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)適宜基因工程改造的小鼠成為親和力成熟全人源抗體產(chǎn)生的強(qiáng)勁引擎，其體內(nèi)免疫系統(tǒng)自然選擇與成熟機(jī)制促使產(chǎn)生的抗體具備成為藥物的天然優(yōu)勢，包括高效與特異性、低免疫原性與可工藝性等。產(chǎn)生的系列抗體包括針對全新靶點(diǎn)的全新作用機(jī)制的抗體藥物，也包括針對經(jīng)典靶點(diǎn)的升級抗體藥物13。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小

20、鼠，目的是用人的抗體基因轉(zhuǎn)入小鼠相應(yīng)基因，產(chǎn)生分泌人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。在轉(zhuǎn)基因小鼠的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生分泌抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。在目前FDA批準(zhǔn)上市的全人源單抗中，技術(shù)來源除了噬菌體抗體庫技術(shù)外，有三種轉(zhuǎn)基因小鼠平臺技術(shù)，即HuMAb-Mouse、Xcno Mouse和VelocImmuneTM。HuMAb-Mouse：HUMab轉(zhuǎn)基因小鼠整合入人抗體基因450kb(200kb Ig H；230kb Igk，約占人類Ig G的50)，免疫該小鼠可以產(chǎn)生0.1-5nmolL的抗體。雖然該小鼠轉(zhuǎn)入的人抗體基因組還是比較小，但仍獲得巨大成功。Xcno Mouse: Xeno Mouse轉(zhuǎn)基因小鼠也是目前最為成

21、功、應(yīng)用最廣的轉(zhuǎn)基因小鼠之一。該轉(zhuǎn)基因小鼠整合入大部分人抗體VH和V基因，大小分別為1020kb和800kb。重鏈包含34個V區(qū)基因、所有的重鏈D區(qū)和J區(qū)，以及C2、C和C基因，共66個功能基因；輕鏈包含18個V區(qū)基因、所有的5個J區(qū)和 C基因，共32個功能基因。該轉(zhuǎn)基因小鼠XMG2-KL可以產(chǎn)生全人IgM和IgG2，親和力可以達(dá)0.11nmolL。VelocImmuneTM：不同于以往的轉(zhuǎn)基因小鼠抗體篩選平臺，VelocImmuneTM產(chǎn)生人可變區(qū)與鼠恒定區(qū)組成的反向嵌合抗體。小鼠Ig H恒定區(qū)通過B細(xì)胞胞質(zhì)區(qū)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域(如Ig與Ig)傳遞天然的免疫信號，并通過與其他類型免疫細(xì)胞上的Fc

22、受體的結(jié)合促使小鼠產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫反應(yīng)，并提供半衰期長且親和力高的抗體。該類轉(zhuǎn)基因小鼠免疫后產(chǎn)生的抗體可變區(qū)編碼序列通過基因克隆技術(shù)與人源恒定區(qū)編碼序列進(jìn)行構(gòu)建，反向嵌合抗體即可轉(zhuǎn)變?yōu)檫m宜藥用的全人源抗體。另外轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)還有TC MouseTM、KM MouseTM和Five-feature mouse，但它們都還未經(jīng)過市場的檢驗(yàn)。3 單克隆抗體衍生物為了更好地發(fā)揮抗體藥物的治療效果，人們構(gòu)建各種形式的工程抗體來改善它們的特性和效能。例如，制備抗體和藥物的偶聯(lián)物，增加對靶細(xì)胞的殺傷；改變抗體分子大小，構(gòu)建小分子抗體，使之有較好的腫瘤/血液比；制備雙特異性抗體，同時結(jié)合兩個不同的抗原表位；增加

23、抗體的親和力；改進(jìn)抗體ADCC或CDC效應(yīng)；改變抗體的藥代動力學(xué)，使半衰期延長。3.1 抗體藥物偶聯(lián)物 抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)是通過一個化學(xué)鏈接將具有生物活性的小分子藥物連接到單抗上，單抗作為載體將小分子藥物靶向運(yùn)輸?shù)侥繕?biāo)細(xì)胞中14。單抗和小分子本身都是藥物，都可以單獨(dú)用來治療疾病，ADC的設(shè)計思路是利用兩者的長處來彌補(bǔ)可能的不足或者缺陷。單抗具有很高的專一性，但是通常藥效不強(qiáng)，往往需要與小分子藥物治療并用；小分子藥物活性強(qiáng)，缺點(diǎn)是專一性較差，從而可能存在毒性，受副作用和劑量的影響較大；有些小分子藥物，特別是肽類藥物在血液中的半衰期過短，通過和單抗結(jié)合，可以改善這方面的缺陷。ADC 將兩者結(jié)

24、合，在到達(dá)目標(biāo)細(xì)胞時將小分子藥物釋放出來，這不僅能靈敏地區(qū)分出健康和疾病組織，限制與非目標(biāo)細(xì)胞的作用，降低毒性，還能夠明顯改善藥代動力學(xué)和向目標(biāo)組織的傳遞15。構(gòu)建抗體偶聯(lián)物主要有三個步驟：選擇合適的抗體、選擇合適的藥物和選擇合適的鏈接方式。這樣構(gòu)建的抗體偶聯(lián)物需要具有以下的特性：（1）穩(wěn)定性，鏈接需要在血液循環(huán)中保持穩(wěn)定，避免過早發(fā)生裂解，造成對健康組織器官損傷；（2）分特異性免疫反應(yīng)，即藥物結(jié)合到單抗不能破壞單抗本身的特異結(jié)合能力；（3）內(nèi)化和藥物的釋放，一般ADC都是通過單抗與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合后再內(nèi)化，將小分子藥物在細(xì)胞內(nèi)釋放，因此需要控制藥物的數(shù)量，以發(fā)揮最大的效果；（4）藥物作用，釋放出

25、的藥物需要在很低的濃度（皮摩爾級）發(fā)揮效果，因此需考慮藥物的活性。3.2 小分子抗體小分子抗體具有分子量小、穿透性強(qiáng)、抗原性低、可在原核系統(tǒng)表達(dá)及易于基因工程操作等優(yōu)點(diǎn)。常見的單價小分子抗體有Fab段、ScFv段、FV段、二硫鍵穩(wěn)定的Fv段、單域抗體和超變區(qū)等；多價小分子有雙鏈抗體、三鏈抗體和微型抗體等；特殊類型的小分子抗體有雙特異抗體和催化抗體等16。當(dāng)前，常用于生產(chǎn)小分子抗體片段的表達(dá)系統(tǒng)通常有大腸桿菌（Ecoli）表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)四種17。小分子抗體的優(yōu)勢在于不需要糖基化修飾，可以在原核細(xì)胞中表達(dá)，操作方便。因此這四種表達(dá)系統(tǒng)的成本是依次增加

26、的，但翻譯后的加工精確性和準(zhǔn)確度卻是依次遞減的。3.2.1 Fab抗體Fab抗體由一條完整的輕鏈和重鏈Fd段通過一個鏈間二硫鍵連接組成一個異二聚體，大小為完整抗體的三分之一，但其仍保持了親本抗體的fv段結(jié)構(gòu)和與抗原結(jié)合的特異性與活性的能力。并且分子結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定具有穿透力強(qiáng)、免疫原性低，可與多種藥物及放射性同位素偶聯(lián)，可與多種毒素和酶結(jié)合，用作藥物的導(dǎo)向治療載體和顯影等特點(diǎn)。3.2.2 單鏈抗體在DNA水平上用一段 適當(dāng)?shù)墓丫酆塑账嶙鳛檫B接肽（linker）將VH和VL連在一起，使之表達(dá)成為一條單一肽鏈，即為單鏈抗體（ScFv）。單鏈抗體大小僅為全抗體的六分之一，抗原性低，是具有完整抗原結(jié)合部位

27、的最小片段, 但有時構(gòu)建的ScFv其親和力明顯低于親本抗體，并常有聚集的傾向。3.2.3 單域抗體由抗體輕、重鏈可變區(qū)基因（VH、VL）間通過一段連接肽基因拼接后表達(dá)形成的重組蛋白，大小為全抗體的六分之一，抗原性低，是具有完整抗原結(jié)合部位的最小片段。其分子量更小，具有一定的可溶性和穩(wěn)定性特點(diǎn)，相較于其它的抗體分子，單域抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞。3.2.4 雙特異性抗體雙特異性抗體是含有2種特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)的人工抗體，一個位點(diǎn)可與靶細(xì)胞表面抗原結(jié)合，另一個位點(diǎn)則可與載荷物如毒素、酶、細(xì)胞因子、放射毒素等耦合，能在靶細(xì)胞和功能分子（細(xì)胞）之間架起橋梁，激發(fā)具有導(dǎo)向性的免疫反應(yīng)，其靶向性的特點(diǎn)可以減少載

28、荷物的毒副作用。4 單克隆抗體的應(yīng)用隨著單克隆抗體的完善與推廣，單克隆抗體在農(nóng)業(yè)、食品、治療疾病等方面的應(yīng)用越來越廣泛，并取得了良好的效果。4.1 農(nóng)業(yè)和食品由于單克隆抗體的高特異性和高靈敏性，單克隆抗體農(nóng)業(yè)和食品的應(yīng)用主要集中在了檢測方面。在食品中對動物性食品中興奮劑、抗生素和激素等的檢測，植物性食品中農(nóng)藥殘留物的檢測，還可以檢測儲存食品中的微生物含量。在農(nóng)業(yè)中，單克隆抗體可以對牲畜的細(xì)菌、病毒和寄生蟲的患病情況進(jìn)行篩選。在植物中，除了對病蟲害的診斷應(yīng)用以外，單克隆抗體還在藥用植物活性成分定性定量分析、成分分離、培植育種中得到了廣泛的應(yīng)用。4.2 醫(yī)學(xué) 單克隆抗體主要應(yīng)用在醫(yī)學(xué)方面，不僅為基

29、礎(chǔ)醫(yī)學(xué)提供了有價值的載體，更在臨床醫(yī)學(xué)得到了廣泛的應(yīng)用，如治療腫瘤、移植排斥、自身免疫病、心血管疾病、病毒感染等。4.2.1 治療腫瘤 近20年來，抗腫瘤抗體藥物已成為治療癌癥的重要方法，是治療癌癥最成功的的策略之一。據(jù)Pharmaprojects V5數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，目前上市與臨床在研的約500種抗體藥物中，約有50%用于腫瘤治療，臨床在研的抗腫瘤抗體藥物共約20多種，針對70多個靶點(diǎn)18。目前，銷量排名前五的抗體類藥物，其中有三個都是用于治療腫瘤，其中貝伐珠單抗用于治療轉(zhuǎn)移性癌癥，曲妥珠單抗通過附著在Her2上來阻止人體表皮生長因子在Her2上的附著，從而阻斷癌細(xì)胞的生長，利妥昔適用于復(fù)發(fā)或耐

30、藥的濾泡性中央型淋巴瘤的治療。截止2015年底，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了21個抗腫瘤類藥物，2016年新批準(zhǔn)了用于膀胱癌靶向治療的Tecentriq和治療軟組織肉瘤的Lartruvo。近年來，利用單克隆抗體靶向治療腫瘤已經(jīng)成為全球靶向治療藥物的主流，免疫檢驗(yàn)點(diǎn)靶向抗體藥物的研發(fā)更是極大地推動腫瘤免疫治療，是目前腫瘤治療的最熱點(diǎn)所在19。同時抗體治療聯(lián)合其他治療策略也成為了必然的發(fā)展趨勢，聯(lián)用型治療適用性更廣，臨床效果更持久，不良反應(yīng)更少，病灶去除更徹底，有效防止腫瘤的復(fù)發(fā)，顯著提高了存活率。4.2.2 器官移植移植排斥是器官移植失敗的重要因素之一，而單克隆抗體可以有效地改善移植排斥反應(yīng)，其應(yīng)用也在不斷增

31、長，目前的研究和應(yīng)用主要集中于清除不同種類的白細(xì)胞分化抗原（CD），例如采用抗CD154單克隆抗體阻斷免疫細(xì)胞活化信號傳導(dǎo)途徑,主要應(yīng)用于胰腺、心臟、皮膚等多個器官的移植，證明抗CD154單抗能有效地抑制移植排斥反應(yīng)，延長移植物的存活時間20。4.2.3 自身免疫病自身免疫性疾病的治療通常采用的糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等,雖然有一定療效,但長期使用都會產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng),而且都只能減緩病情的發(fā)展,并不能根治疾病21。而單克隆抗體可以有效地改善和治療自身免疫病，主要有以下的三種作用機(jī)制。（1）封閉細(xì)胞因子和生長因子的單克隆抗體藥物，其中最成功的便是TNF抑制劑，包括伊納西普、英孚利昔、阿達(dá)木、賽妥

32、珠和戈利木，適用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、青少年關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、結(jié)腸炎、脊柱炎和銀屑病等；（2）受體阻滯和受體調(diào)節(jié)的單克隆抗體藥物，即單抗結(jié)合受體，阻斷配體和受體相互作用，下調(diào)細(xì)胞表面目標(biāo)受體的表達(dá)，這些抗體包括治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的IL-6受體抗體tocilizumab,重組非糖基化的人IL-1受體拮抗劑阿那白滯素(anakin-ra)等；（3）耗竭異常免疫細(xì)胞及介導(dǎo)細(xì)胞信號的單克隆抗體藥物，通過結(jié)合細(xì)胞表面抗原,如CD20,CD22、CD80和CD52,通過FcR介導(dǎo)的ADCC作用和CDC作用殺傷異常的淋巴細(xì)胞，有治療1型糖尿病的otelixizumab、治療多發(fā)性硬化癥的阿倫和治療慢性淋巴細(xì)胞白血病o

33、fatumumab等一系列單抗藥物。 4.2.4 抗感染細(xì)菌和病毒等病原體感染機(jī)體的機(jī)制復(fù)雜,由于單克隆抗體只能識別單一抗原表位,限制了抗體藥物的抗感染效果?？垢腥绢I(lǐng)域的抗體藥物發(fā)展緩慢，目前僅有抗呼吸道合胞病毒的帕利珠單抗以及抗炭疽桿菌的瑞西巴庫單抗兩個品種上市22。目前抗感染的單克隆抗體的研究熱點(diǎn)集中于埃博拉病毒抗體、抗呼吸道合胞病毒抗體、抗炭疽桿菌抗體等， 2014年西非大規(guī)模埃博拉病毒疫情爆發(fā)后，實(shí)驗(yàn)性抗體藥物ZMapp第一個被用于臨床治療，中國研制的抗體藥物 MIL77也成功用于治療，抗體藥物再次顯示了在抗感染領(lǐng)域的應(yīng)用前景。5 單克隆抗體藥物可能存在的問題單克隆抗體導(dǎo)致的不良發(fā)應(yīng)主

34、要有皮膚及附件損害、全身反應(yīng)、心血管損害等，具體表現(xiàn)為皮疹、瘙癢、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、心慌、心跳加快等，嚴(yán)重可導(dǎo)致急性呼吸衰竭、多器官功能衰竭、嚴(yán)重出血、腦梗死、過敏性休克等。單克隆抗體可能的不良反應(yīng)也許與以下3個機(jī)理之一有關(guān):所用mAb的異源性,特別是當(dāng)給予mAb而無相關(guān)的免疫抑制劑時；生理功能的抑制以及mAb的特異性；mAb與靶點(diǎn)結(jié)合后炎癥細(xì)胞或介導(dǎo)物的活性23。從發(fā)生人群來看，患者的年齡集中在兒童和老人，這可能是由于兒童的器官/系統(tǒng)發(fā)育不完善，使得個體對藥物的吸收、分布、代謝相對緩慢，藥物在體內(nèi)滯留的時間較長；而老人往往患有心血管疾病、高血壓、糖尿病等，這些可能都會引起不良反應(yīng)的發(fā)生。因此，臨床

35、中使用單克隆抗體藥物是應(yīng)注意：（1）重視患者人群，注意防范兒童或老年患者不良反應(yīng)的發(fā)生。（2）注意首次用藥，初次靜脈滴注單克隆抗體時，應(yīng)控制滴速。（3）詢問患者藥物過敏史和既往病史。（4）使用前建議預(yù)防使用抗過敏藥物。（5）對具有肝炎病史的患者，注意對肝功能和病毒的檢測，避免肝病復(fù)發(fā)。（6）按照說明書使用單克隆抗體藥物，避免超說明書用藥。（7）單克隆抗體制劑應(yīng)保存在2-8的環(huán)境中，避免凍結(jié)。（8）輸注藥液的過程中，加強(qiáng)巡視，嚴(yán)密觀察藥物引起的不良反應(yīng)，及時給予相應(yīng)的處理，保證患者的用藥安全24。6 展望單克隆抗體藥物這些特征使它成為了生物醫(yī)藥領(lǐng)域一顆耀眼的明珠。過去的30年中，隨著研究的不斷突

36、破，單克隆抗體從鼠源發(fā)展到人緣，提高了單克隆抗體的藥效和安全性。雖然單抗藥物還存在一些尚未解決的問題，最突出的問題是如何降低單抗的免疫原性，單抗的異源性所引起的抗體反應(yīng)，不但降低了單抗的效價，而且會給患者帶來嚴(yán)重的后果。但是我們可以相信隨著研究的不斷深入；生產(chǎn)工藝的不斷成熟；檢測技術(shù)不斷的完善，現(xiàn)有的問題會逐一地解決，并且必將出現(xiàn)更高靶向性和藥效更強(qiáng)的單克隆抗體藥物，單克隆抗體藥物將在治愈疾病中顯示出它獨(dú)特的效果，為患者帶來更大的希望。未來伴隨著生物技術(shù)制藥的發(fā)展，單克隆抗體將在其中占有更重要的地位，并逐漸成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展的主要方向。目前單克隆抗體藥物快速擴(kuò)大的市場已經(jīng)成為制藥業(yè)爭奪的焦點(diǎn)

37、，為制藥公司提供了發(fā)展的契機(jī)。我國企業(yè)雖然進(jìn)入該領(lǐng)域較晚，但在仿制單克隆抗體藥物的規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)上，積極探索、開發(fā)和創(chuàng)新，相信很快會在國際市場上占有一席之地。 參考文獻(xiàn)1 王志明, 楊立霞, 賈寅星,等. 基于新興技術(shù)的單克隆抗體藥物的研究進(jìn)展J. 中國新藥雜志, 2012(18):2149-2155.2 王志明, 高健, 李耿. 治療性單克隆抗體藥物的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢J. 中國生物工程雜志, 2013, 33(6):117-124.3 姜倩倩, 劉京貞, 蘇瑞強(qiáng). 單克隆抗體藥物進(jìn)展J. 藥物生物技術(shù), 2005, 12(4):270-274.4 王祥斌, 孔健. 體外培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)

38、人用鼠源單克隆抗體J. 中國生物制品學(xué)雜志, 2002, 15(5):315-316.5 Galun E; Terrauit N A; Eren R Clinical evaluation of a human monoclonal antibody against hepatitis C virus: safety andantiviral activity 2007. 6 Boulianne GL, Hozumi N, Shulman MJ. Production of functional chimaeric mouse/human antibodyJ. Nature, 1984, 31

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