第11章-動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與表達(dá)制備藥用

1、皮膚燒傷，如果創(chuàng)面很小（不大于硬幣）只要保持清潔，甚至深度燒傷，也可能自愈。如果下層真皮受損面積較大，常常需要植皮。植皮需要的健康皮片。植皮需要的健康皮片，可以取自燒傷病人自身未燒傷的部位（自體植皮），也可取自其他活人或尸體（異體植皮）等。自體植皮是永久性的，取自其他人或動(dòng)物的植皮是暫時(shí)性的，是在創(chuàng)面愈合過程中為保護(hù)創(chuàng)面而采取的措施，1014天后就要被身體排斥。,思考如果一個(gè)大面積燒傷的病人來說，自體皮膚有限，其他渠道的皮膚來源不足。如何才能獲得大量的自體健康皮膚？,第11章 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與表達(dá)制備藥用蛋白,下篇 動(dòng)物細(xì)胞工程,本章主要內(nèi)容,1. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的概念、歷史 2. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的

2、特點(diǎn) 3. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工具與條件 4. 體外培養(yǎng)細(xì)胞生長與增殖過程 5. 細(xì)胞株與保存 6. 動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng) 7. 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng) 8. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器 9. 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)影響因素 10. 動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)制備藥用蛋白,離體植物器官、組織或細(xì)胞,植物細(xì)胞工程常用的技術(shù):,植物組織培養(yǎng)、植物細(xì)胞培養(yǎng) 、植物體細(xì)胞雜交,溫故而知新,細(xì)胞次生 代謝產(chǎn)物,植物體細(xì)胞雜交,植物細(xì)胞A,植物細(xì)胞B,去細(xì)胞壁,原生質(zhì)體融合,雜種細(xì)胞,植物細(xì)胞融合,這個(gè)過程中涉及的原理是？,細(xì)胞膜的流動(dòng)性 植物細(xì)胞的全能性,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程：,動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官,細(xì)胞懸浮液,10代細(xì)胞,無限傳

3、代,單個(gè)細(xì)胞,加培養(yǎng)液,剪碎,胰蛋白酶,胰蛋白酶或膠原蛋白酶,11-1 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)概念與歷史,1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)（Animal cell culture）：是模擬動(dòng)物體內(nèi)生理環(huán)境使細(xì)胞在體外分裂增殖的一種技術(shù)。包括： 原代培養(yǎng)：動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行首次傳代前的培養(yǎng)過程。 傳代培養(yǎng)：將原代培養(yǎng)細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的過程。,11-1 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)概念與歷史,2、歷史： 1907年,哈里森（Harrison）采用蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法將蛙胚的神經(jīng)組織培養(yǎng)在淋巴液中，存活了幾周時(shí)間，并觀察到細(xì)胞突起的生長過程，開創(chuàng)了動(dòng)物組織培養(yǎng)的先河。 法國學(xué)者卡雷爾（Carrell）設(shè)計(jì)的卡氏培養(yǎng)瓶1923年用于培養(yǎng)雞胚

4、的心肌組織取得成功，極大推動(dòng)了動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立。,11-1 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)概念與歷史,1951年，厄爾利（Earle）等人開發(fā)了動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基。伴隨著培養(yǎng)工具與培養(yǎng)基的不斷完善，動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)日益成熟。,11-2 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn),（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn) 1、動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，比微生物細(xì)胞大 2、動(dòng)物細(xì)胞倍增時(shí)間長，生長緩慢 3、培養(yǎng)過程需氧量少，對機(jī)械攪拌或剪切力敏感。 4、動(dòng)物細(xì)胞間主要以聚集體形式存在。,11-2 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn),5、原代細(xì)胞培養(yǎng)繁殖50代左右即退化死亡。 6、對營養(yǎng)需求更加苛刻，除常規(guī)營養(yǎng)外還需血清等。 7、對培養(yǎng)條件或環(huán)境極其敏感。 8、容易

5、受污染。 9、大多需要貼附在固體或半固體表面才能生長。,11-2 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn),（二）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)類型與形態(tài) 體外生長的動(dòng)物細(xì)胞一般具有貼附性、細(xì)胞接觸抑制性、密度抑制性的特點(diǎn)。 1、類型： 貼附型細(xì)胞：大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞必須附著在固體或半固體表面才能生長，另外也包括細(xì)胞間相互接觸。,11-2 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn),懸浮型細(xì)胞：與微生物、植物細(xì)胞不同，動(dòng)物細(xì)胞中只有極少數(shù)細(xì)胞體外生長可在培養(yǎng)液中懸浮生長，培養(yǎng)密度高、效率高。血液白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞等屬于此類細(xì)胞。,11-2 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn),接觸抑制性 (Contact inhibition) 是指由于動(dòng)物細(xì)胞相互接觸而抑制細(xì)

6、胞運(yùn)動(dòng)性的現(xiàn)象（圖）。由于這個(gè)特性，正常細(xì)胞并不會(huì)相互重疊，而是呈單層細(xì)胞生長。,11-2 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn),密度抑制(Density inhibition) 細(xì)胞接觸匯合成片后，細(xì)胞仍能進(jìn)行增殖分裂。但是當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定程度后，營養(yǎng)相對缺乏，代謝產(chǎn)物增多，發(fā)生密度抑制生長現(xiàn)象。,11-2 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn),2、貼附型細(xì)胞四種形態(tài) （1）成纖維型細(xì)胞 外形與體內(nèi)成纖維細(xì)胞形狀相似，細(xì)胞大致呈梭形或不規(guī)則形，中央有圓形核，胞質(zhì)向外伸出23個(gè)長短不同的突起，成群細(xì)胞呈現(xiàn)放射狀、旋渦狀等形式。多數(shù)細(xì)胞之間排列疏散，有較大的細(xì)胞間隙。除成纖維細(xì)胞外，心肌、成骨肌細(xì)胞等起源于中胚層細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)均屬這

7、一類型。,11-2 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn),（2）上皮型細(xì)胞 類似上皮細(xì)胞的細(xì)胞，特點(diǎn)是：扁平狀，形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞貼壁后呈三角形及不規(guī)則扁平的多角形，中央有扁圓形核，生長時(shí)彼此緊密連接成單層細(xì)胞。因?yàn)橄嗷頂D而呈現(xiàn)“鋪路石狀”。,包括：皮膚的表皮細(xì)胞、消化管與呼吸道的上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、消化腺上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等起源于內(nèi)或外胚層細(xì)胞。,11-2 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn),（3）游走型細(xì)胞 細(xì)胞呈分散生長，一般不連接成片，胞質(zhì)常伸出偽足和突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則，在器皿上生長位置不固定。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，外形不斷變化，密度大時(shí)難以和成纖維、上皮細(xì)胞相區(qū)別。 包括單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)：白細(xì)

8、胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。,11-2 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn),（4）多形型細(xì)胞 多形型細(xì)胞是一些形態(tài)上不規(guī)則的細(xì)胞，包括細(xì)長型胞突和多角形胞體。 多形型細(xì)胞不常見，體外培養(yǎng)呈現(xiàn)多形型細(xì)胞的細(xì)胞最常見的是神經(jīng)原和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。,11-2 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn),實(shí)際上，體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞形態(tài)常受培養(yǎng)條件影響，呈現(xiàn)過渡形態(tài)。 影響細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的主要因素包括： 血清成分 培養(yǎng)基成分及添加成分 培養(yǎng)基的酸堿度 氣相環(huán)境 溫度等,11-3 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工具與條件,1、培養(yǎng)工具 多為玻璃或無毒塑料制成的： 培養(yǎng)瓶的形狀主要是適合細(xì)胞貼壁生長顯 微鏡觀察的扁平形狀。 培養(yǎng)皿 培養(yǎng)管 儀器包括：CO2培養(yǎng)

9、箱、相差顯微鏡等。 目前大多采用微載體(多孔塑料培養(yǎng)板)作為 介質(zhì)培養(yǎng)貼附型細(xì)胞生長，類似懸浮培養(yǎng)效 果。,11-3 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工具與條件,另外，同微生物、植物細(xì)胞培養(yǎng)不同，動(dòng) 物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基與其他溶液不能經(jīng)受高溫滅菌，多采用40nm過濾除菌（例如支原體污染。,11-3 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工具與條件,2、培養(yǎng)條件 溫度：人類和哺乳類動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)適宜溫度37。細(xì)胞對低溫耐受性更強(qiáng)， 40高溫?cái)?shù)小時(shí)可使細(xì)胞死亡。 pH：哺乳動(dòng)物細(xì)胞為7.2-7.4，耐酸不耐堿。 氣體：細(xì)胞的生長代謝離不開O2和CO2 。二氧化碳培養(yǎng)箱供應(yīng)CO2 ，還可調(diào)節(jié)pH值 。 滲透壓：細(xì)胞在高滲透壓或低滲透壓溶液中會(huì)發(fā)生皺

10、縮或腫脹，甚至破裂。 BSS溶液。,11-3 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工具與條件,3、培養(yǎng)基 動(dòng)物細(xì)胞對營養(yǎng)要求較高，包括必需氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽、輔酶、激素、生長因子、血清（多數(shù)情況下需加入10%的胎?；蛐∨Ｑ澹┑?。 分類：天然、合成、無血清培養(yǎng)基三種。,（1）天然培養(yǎng)基,直接采用取自動(dòng)物體液或是從組織中提取的成分做培養(yǎng)液。常用動(dòng)物血清（胎牛血清、小牛血清）、組織提取液、雞胚胎汁等。 優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)價(jià)值高，培養(yǎng)效果好 缺點(diǎn)：成分復(fù)雜、來源有限、成本較高 血清（serum）：纖維蛋白已被除去(如通過血凝或去纖維蛋白法)的血漿。,11-3 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工具與條件,血清的生物功能 1.提供基本營養(yǎng)

11、物質(zhì)：氨基酸、維生素、無機(jī)物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等，是細(xì)胞生長必須的物質(zhì)。 2.提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素、類固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長因子如成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。 3.提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要的低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過程中起重要作用。,11-3 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工具與條件,血清對培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用： 提供促接觸和伸展因子，使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷。血清蛋白形成的粘度，可以保護(hù)細(xì)胞攪拌時(shí)免受機(jī)械損傷。 血清中含有抗蛋白酶成分，可以使用血清來終止內(nèi)皮 細(xì)

12、胞、骨髓樣細(xì)胞釋放胰蛋白酶的消化作用。 血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如硒等。,（2）合成培養(yǎng)基,優(yōu)點(diǎn)：成分已知，便于對培養(yǎng)條件進(jìn)行控制。 缺點(diǎn)：無法替代天然培養(yǎng)基中一些未知成分 解決途徑合成培養(yǎng)基中添加小牛血清，彼此互補(bǔ) 目前常用的合成培養(yǎng)基包括：MEM、DMEM、RPMI1640、F12、M199等，具體配方參見本章附錄（P123）,（2）合成培養(yǎng)基,例如 MEM培養(yǎng)基：厄爾利（Earle）于1951年開發(fā)成功。含有少量氨基酸、維生素、谷氨酰胺以及必須的無機(jī)鹽，組成簡單。 DMEM培養(yǎng)基：由杜爾貝科（Dulbecco）等在MEM培養(yǎng)基基礎(chǔ)上研制而成，增加了各已有

13、成分的含量，同時(shí)又根據(jù)葡萄糖高低分為高糖型（4,500mg/L）和低糖型（1,000mg/L），高糖型適合生長較快、貼附性差的細(xì)胞（例如腫瘤細(xì)胞）培養(yǎng)。,（3）無血清培養(yǎng)基,血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)：含有豐富的利于細(xì)胞生長的成分 血清培養(yǎng)基缺點(diǎn)： （1）動(dòng)物血清來源有限，價(jià)格高，不宜大量使用 （2）動(dòng)物血清成分復(fù)雜且成分不穩(wěn)定，使生長過程不易檢測控制。 （3）雖然血清對細(xì)胞生長有效，但會(huì)對后期培養(yǎng)產(chǎn)物的分離、提純以及檢測造成一定困難。,（3）無血清培養(yǎng)基,無血清培養(yǎng)基(Serum free medium,SFM)是不含血清的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加已知組分組成。試圖全部替代血清成分。 基礎(chǔ)培

14、養(yǎng)基較常用的是DMEM、F12培養(yǎng)基。 添加組分主要包括：生長因子、激素（胰島素、胰高血糖素等）、結(jié)合蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)、酶抑制劑、氫化考地松等。,11-3 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工具與條件,4、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)常用溶液 （1）平衡鹽溶液（Balanced salt solution，BSS ）主要由生理鹽水和葡萄糖組成，具有維持細(xì)胞滲透壓、調(diào)控培養(yǎng)液酸、堿度平衡的功能。 例如：Hanks液、Earle液（緩沖能力強(qiáng)） 注：酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為pH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。,4、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)常用溶液,（2）培養(yǎng)基pH調(diào)整液 動(dòng)物細(xì)胞對酸堿度要求十分嚴(yán)格，大部分合成培養(yǎng)

15、液都呈微酸性，若滅菌前調(diào)整到標(biāo)準(zhǔn)值，滅菌后又會(huì)降低，因此pH調(diào)整液應(yīng)單獨(dú)配制和滅菌，在培養(yǎng)液滅菌后再加入調(diào)整pH值最好。 常用pH調(diào)整液有：3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO3溶液、HEPES液等。 注：HEPES （4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸）是一種非離子兩性緩沖液，其在pH 7.2 - 7.4范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力：,4、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)常用溶液,（3）細(xì)胞消化液 使用目的：培養(yǎng)前讓組織塊消化解離成分散細(xì)胞，或傳代培養(yǎng)時(shí)使細(xì)胞脫離器皿表面并分散解離。 胰蛋白酶溶液：水解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)，使細(xì)胞分散，使用濃度0.125或0.25%，用無 Ca2+、 Mg2+的 Hanks或PBS緩沖液配制，p

16、H值6.8-7.2，2-10分鐘消化完后加血清終止反應(yīng)。 乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）消化液：非酶性解離細(xì)胞，毒性小、經(jīng)濟(jì)、操作方便，使用濃度0.02%。 注：若將兩者結(jié)合使用，解離效果更好： EDTA：胰蛋白酶體積比=1：1或2：1,4、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)常用溶液,（4）抗生素溶液 作用：防止微生物污染。 常用抗生素有青霉素、鏈霉素、卡那霉素、制霉菌素等。 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用：培養(yǎng)基內(nèi)最終使用濃度 為 青霉素100U/ml、鏈霉素100微克/ml（雙抗）。,11-4 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生長和增殖過程,1、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的一般過程 一般經(jīng)過：組織獲得與消化、接種、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)幾個(gè)環(huán)節(jié) 原

17、代培養(yǎng)期 傳代期 衰退期,圖11-8 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程生長曲線,11-4 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生長和增殖過程,2、動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)（Primary culture）：從體內(nèi)取出組織接種直接長出單層細(xì)胞到第一次傳代培養(yǎng)前的階段（一般持續(xù)1-4周）。 原代（初代）培養(yǎng)期特點(diǎn)：在這個(gè)階段，細(xì)胞有分裂但不旺盛，細(xì)胞多呈二倍體核型。這樣的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞。 優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞生物性狀尚未發(fā)生很大變化，在一定程度上能反映體內(nèi)的形態(tài)學(xué)特征，是藥物測試、研究細(xì)胞分化等很好的實(shí)驗(yàn)材料。,11-4 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生長和增殖過程,傳代期 原代細(xì)胞一經(jīng)傳代后便稱為細(xì)胞系。在此期間，細(xì)胞增殖旺盛，并維持二倍體核型。一般當(dāng)傳代1

18、0-50次后，細(xì)胞增殖逐漸減慢，以致完全停止。 衰退期 該階段細(xì)胞仍然生存，但是增殖很慢或不增殖。細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后開始凋亡。,11-4 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生長和增殖過程,2.1 組織塊原代培養(yǎng)法 比較常用早期簡易的原代培養(yǎng)方法： （1）組織塊的分離：將組織塊剪碎成1mm3大小，加Hanks緩沖液，用吸管吸打，低速離心，收集沉淀即為組織塊。也可用注射器擠壓，或用網(wǎng)篩分離得到細(xì)小的組織塊。,11-4 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生長和增殖過程,（2）接種與培養(yǎng)：用吸管吸出組織塊，放入培養(yǎng)瓶內(nèi)，每小塊間隔0.5厘米，使其均勻貼在培養(yǎng)瓶的壁上（可涂血清）。然后將貼有組織塊的瓶壁朝上，加入培養(yǎng)液，塞上瓶塞，將培養(yǎng)瓶緩慢

19、翻轉(zhuǎn)使培養(yǎng)液覆蓋組織塊，傾斜置于37的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。,11-4 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生長和增殖過程,（3）生長周期：一般情況下，組織塊貼壁后24小時(shí)細(xì)胞就從組織塊四周長出，24小時(shí)后可再補(bǔ)充培養(yǎng)液，3-5天即可形成單層細(xì)胞再更換培養(yǎng)液即首次傳代培養(yǎng) ，若5-7天組織塊中央的組織細(xì)胞逐漸壞死脫落。,11-4 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生長和增殖過程,2.2 組織消化原代培養(yǎng)法 （1）取材與消化酶解法制備單細(xì)胞 根據(jù)不同的組織對象采用適當(dāng)?shù)拿赶韩@得動(dòng)物細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，然后進(jìn)行培養(yǎng)。 最常用的有胰蛋白酶和膠原酶，此外鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶等也可用于動(dòng)物細(xì)胞的消化。 消化傳代細(xì)胞常用EDTA與胰蛋白酶

20、一起使用。,組織消化原代培養(yǎng)法,胰蛋白酶法適用消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎組織、羊膜、上皮、肝、腎等 膠原酶解：適用于結(jié)締、上皮、癌組織等，使膠原酶最終濃度為200u/ml，36.5，靜置448小時(shí)，上面懸液經(jīng)離心獲得或纖維細(xì)胞沉淀，沉淀重置于生理鹽水，去掉未解向組織塊后沉淀得到上皮樣細(xì)胞。,組織消化原代培養(yǎng)示意圖,組織消化原代培養(yǎng)法,（2）原代培養(yǎng)期檢查 1.檢查細(xì)胞形態(tài)及活力：倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶中原代細(xì)胞，生長良好者輪廓不清晰，較透明；生長不良者反而輪廓清晰，形態(tài)不規(guī)則，胞內(nèi)有空泡、顆粒等。 四唑氮藍(lán)法(MTT)法可以檢測細(xì)胞活力：活細(xì)胞的線粒體脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍(lán)紫

21、色產(chǎn)物甲暨（Formazan)并沉淀在細(xì)胞中。,組織消化原代培養(yǎng)法,2.培養(yǎng)液pH及污染檢查：含血清的新鮮培養(yǎng)液呈桃紅色，pH在7.27.4之間。CO2的積累使培養(yǎng)液pH下降，當(dāng)超出緩沖范圍時(shí)，培養(yǎng)液變黃，需要34天更換一次培養(yǎng)液。CO2培養(yǎng)箱能自動(dòng)控制5%的CO2含量。 細(xì)菌污染時(shí)培養(yǎng)液變渾濁；支原體易透過 濾器，污染不易被發(fā)現(xiàn)。,倒置顯微鏡：組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，具有相差物鏡。,11-4 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生長和增殖過程,3、動(dòng)物細(xì)胞傳代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)（Passage culture/Subculturing）是

22、指將原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的過程，一般可傳代50代左右。傳代培養(yǎng)期間的細(xì)胞稱為細(xì)胞系。 注意：每進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)稱為傳一代，即從細(xì)胞接種培養(yǎng)到分離再培養(yǎng)期間的一段時(shí)間。在細(xì)胞的一代中，細(xì)胞約能倍增36次。,11-4 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生長和增殖過程,傳代培養(yǎng)方法 懸浮生長的細(xì)胞可以采用加入新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散傳代，或者采用自然沉降法加入新鮮培養(yǎng)基后再吹打分散進(jìn)行傳代。 貼壁生長的動(dòng)物細(xì)胞，原代培養(yǎng)細(xì)胞分裂增殖擴(kuò)展成片后需要進(jìn)行細(xì)胞分離重新接種培養(yǎng)。一般采用酶消化法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 視頻：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù): ,11-4 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生長和增殖過程,酶消化傳代過程 1、吸出或者倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)的舊培

23、養(yǎng)液。 2、加入胰蛋白酶和EDTA混合液蓋滿瓶底， 輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶 3、25分鐘后檢查，有細(xì)胞間隙變大、細(xì)胞 質(zhì)回縮現(xiàn)象時(shí)添加培養(yǎng)液終止消化。 4、吸出消化液，加入Hanks液輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，洗 去殘留消化液。 5、加入培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打瓶壁，使細(xì) 胞脫落制成懸液。 6、計(jì)數(shù)，接種進(jìn)行傳代培養(yǎng)。,動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng),問題：,1.為何要定期用胰蛋白酶使細(xì)胞從瓶壁上脫離下來？ 2.比較動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基的成分. 3.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是否能像植物細(xì)胞一樣 最終培養(yǎng)成新個(gè)體？,獲得細(xì)胞,細(xì)胞的全能性,細(xì)胞株、細(xì)胞系,植物體,培養(yǎng)結(jié)果,或細(xì)胞分泌蛋白,快速繁殖、培育無病毒植株等,培養(yǎng)目的,

24、葡萄糖、動(dòng)物血清,蔗糖、植物激素,培養(yǎng)基特有成分,液體培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)基性質(zhì),細(xì)胞增殖,原理,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),植物組織培養(yǎng),比較項(xiàng)目,2、植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程：,動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官,細(xì)胞懸浮液,胰蛋白酶或膠原蛋白酶,10代細(xì)胞,原代培養(yǎng),無限傳代,單個(gè)細(xì)胞,加培養(yǎng)液,遺傳物質(zhì)未改變,遺傳物質(zhì)改變,剪碎,胰蛋白酶,11-5 細(xì)胞株與保存,1.細(xì)胞系(Cell line) 是由原代培養(yǎng)經(jīng)傳代培養(yǎng)純化，獲得的以一種細(xì)胞為主的、能在體外長期生存的不均一的細(xì)胞群體。第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞即稱之為細(xì)胞系。 不能連續(xù)培養(yǎng)的為有限細(xì)胞系(Finite cell

25、line)，能連續(xù)培養(yǎng)下去的為連續(xù)細(xì)胞系(Infinite cell line)。,11-5 細(xì)胞株與保存,2.細(xì)胞株(Cell strain) 指從一個(gè)經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì)胞株。 細(xì)胞株的建立需要從細(xì)胞系群體中分離出一個(gè)細(xì)胞，并使其在體外繁殖成為新細(xì)胞群體。,11-5 細(xì)胞株與保存,3. 動(dòng)物細(xì)胞株類型 包括： 原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞 有限細(xì)胞系、無限細(xì)胞系（不具有接觸抑制現(xiàn)象；理想的藥物生產(chǎn)細(xì)胞） 二倍體細(xì)胞、異倍體細(xì)胞 融合細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞、基因工程細(xì)胞,11-5 細(xì)胞株與保存,（1）原代細(xì)胞 常用有：雞胚細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞或鼠

26、腎細(xì)胞、血液淋巴細(xì)胞 1949年，恩德斯（Enders）利用人胚胎組織細(xì)胞生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)滅活疫苗，開創(chuàng)了動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行生物制藥的先河。 缺點(diǎn)：具有需要大量動(dòng)物組織、成本高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等。 藥物篩選、藥理研究。,11-5 細(xì)胞株與保存,（2）二倍體傳代細(xì)胞 二倍體細(xì)胞具有正常細(xì)胞的特點(diǎn)：二倍體染色體、具有貼壁和接觸抑制特性、無致瘤性。 有限細(xì)胞系（傳代次數(shù)一般都不超過50代）。 WI-38： 1961年Wister 38研究所從女性高加索人的正常胚肺組織中獲得的一株人2倍體細(xì)胞系WI-38。培增時(shí)間24h；貼壁生長；第一批獲得批準(zhǔn)用于生產(chǎn)的二倍體細(xì)胞有對病毒敏感，第一個(gè)用于疫苗（脊髓灰質(zhì)滅活疫苗）

27、生產(chǎn)。 MRC-5：二倍體，成纖維，生長比WI-38快。,11-5 細(xì)胞株與保存,（3）融合細(xì)胞 通過細(xì)胞融合技術(shù)可得到具有兩親本特征 的細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞：脾臟B淋巴細(xì)胞與 骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞。用于抗體藥物生產(chǎn)。 （4）基因工程細(xì)胞 將藥用蛋白基因轉(zhuǎn)化入動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，多用于大量生產(chǎn)藥物。,11-5 細(xì)胞株與保存,（5）轉(zhuǎn)化細(xì)胞 細(xì)胞轉(zhuǎn)化是指細(xì)胞發(fā)生遺傳改變而產(chǎn)生永生化，即由限定性細(xì)胞系轉(zhuǎn)化為連續(xù)性細(xì)胞系，可以在體外進(jìn)行無限傳代和生長繁殖。 不同于癌細(xì)胞，沒有致瘤性。 倍增時(shí)間短，對培養(yǎng)條件與生長因子要求低。 由于轉(zhuǎn)化細(xì)胞常常由于染色體斷裂而變成異倍體，失去正常細(xì)胞的特點(diǎn)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞于20世紀(jì)

28、80年代獲得批準(zhǔn)用于生產(chǎn)。,11-5 細(xì)胞株與保存,轉(zhuǎn)化方法 1.細(xì)胞自轉(zhuǎn)化 體外培養(yǎng)的細(xì)胞自發(fā)出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。這種現(xiàn)象在許多正常二倍體長期傳代過程中出現(xiàn)?？赡艿囊蛩匕ǎ貉遒|(zhì)量、溫度或pH不穩(wěn)定、病毒污染等。 2.人工誘發(fā)轉(zhuǎn)化 采用誘導(dǎo)劑使正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。凡是可以改變DNA結(jié)構(gòu)的因素都可以稱為誘導(dǎo)劑，包括化學(xué)、物理和病毒誘導(dǎo)劑。,常用細(xì)胞株,CHO細(xì)胞(Chinese hamster ovary cell)：從中國倉鼠卵巢分離的細(xì)胞，亞二倍體，有多種突變株。貼壁生長，也可以懸浮培養(yǎng)，對剪切力和滲透壓改變有較高的忍受能力。 CHO細(xì)胞能表達(dá)糖基化蛋白藥物：組織纖維蛋白溶酶原激活劑(Tiss

29、ue plasminogen activator，tPA)、促紅細(xì)胞生成素（Erythropoiefin，EPO）、乙型肝炎病毒表面抗原（Hepatitis B virussurface antigen, HBsAg）、粒細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte colony stimulating factor,G-CSF）、DNA酶I、凝血因子VIII等。 比二倍體減少1條(2n-1)或幾條染色體的細(xì)胞稱亞二倍體,常用細(xì)胞株,Vero細(xì)胞（Vero cell）:是1962年日本從非洲綠猴腎中分離的細(xì)胞。成上皮型，異倍體，貼壁型，是最常用的大規(guī)模培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞之一。,常用細(xì)胞株,BHK-21

30、細(xì)胞（Baby hamster kidney cell）：是1961年英國從幼地鼠的腎臟分離的細(xì)胞。成纖維樣，異倍體。常用于增殖病毒制備疫苗和重組蛋白(例如重組凝血因子VIII)。,11-5 細(xì)胞株與保存,4 .動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存 （1）先酶消化分散成單個(gè)細(xì)胞，用冷凍保護(hù)液（含10%血清的培養(yǎng)液+10%甘油或二甲基砜DMSO）冷卻，同時(shí)將細(xì)胞稀釋成2-5*106個(gè)/ml。 （2）分裝： 1ml /安瓶 （3）冷凍機(jī)內(nèi)冷凍至-25 （4）液氮罐長期冷凍保存。 （5）細(xì)胞復(fù)蘇： 37水浴快速融化,11-6 動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng),1、懸滴培養(yǎng) 是最早建立的體外培養(yǎng)技術(shù)，是組織和器官培養(yǎng)的經(jīng)典方法。 將培

31、養(yǎng)液滴于蓋玻片上并鋪展開，將待培養(yǎng)的組 織或器官植塊放于鋪展開的培養(yǎng)液中央部位，然后將蓋玻片翻轉(zhuǎn)放于凹載玻片上，密封后進(jìn)行培養(yǎng)。,11-6 動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng),2、灌注小室培養(yǎng) 是在懸滴法基礎(chǔ)上的改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)營養(yǎng)液的循環(huán)供應(yīng)與流出。 3.培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法 1923年，卡雷爾（Carrel）設(shè)計(jì)成功卡氏瓶，可以保證動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境和生長空間。 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法是目前動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng)的主要方法之一。,11-6 動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng),培養(yǎng)對象直接接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)再放入培養(yǎng)箱,11-6 動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng),4 培養(yǎng)板培養(yǎng)法 接種在培養(yǎng)板孔（48、96）內(nèi)，然后置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 目前常規(guī)方法之一,11-

32、6 動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng),5 轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 1933-1934年，蓋爾（Gey）和劉易（Lewis）建立了旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)方法，將培養(yǎng)物接種于一管狀培養(yǎng)器皿中，再將其固定在一可以旋轉(zhuǎn)的裝置上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)方法克服了靜置培養(yǎng)的不足，例如：細(xì)胞生長環(huán)境不均勻、不利于營養(yǎng)的吸收等，培養(yǎng)物可以交替地接觸培養(yǎng)液和氣體環(huán)境，利于細(xì)胞或組織生長。,11-6 動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng),6 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法 將轉(zhuǎn)管換成培養(yǎng)瓶，增加了培養(yǎng)液與空氣接觸面積,11-7 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng),1 懸浮培養(yǎng) 是指細(xì)胞在反應(yīng)器培養(yǎng)液中自由懸浮生長。 主要用于非貼壁依賴型的少數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)：雜交瘤細(xì)胞、血液白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，某些腫瘤細(xì)胞等。 優(yōu)

33、點(diǎn)：細(xì)胞呈單個(gè)游離態(tài)存在，傳代時(shí)無需再消化分散；增殖快，產(chǎn)量高，培養(yǎng)過程簡單。 貼壁型細(xì)胞貼附在微載體上或者包裹在微囊中后可以接種在適當(dāng)生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)。,11-7 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng),2. 微載體培養(yǎng) 微載體（Microcarrier）：是直徑60-250m的帶正電荷微粒（葡聚糖聚合物），適于貼壁型細(xì)胞生長。 1967年，維茨爾（Van Wezel）開發(fā)了微載體系統(tǒng)。,11-7 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng),微載體培養(yǎng)成既能滿足動(dòng)物細(xì)胞的貼壁要求，又能使微珠懸浮起來，實(shí)現(xiàn)3D培養(yǎng)，擺脫了傳統(tǒng)的培養(yǎng)瓶（管）培養(yǎng)限制（面積有限，占用空間大，細(xì)胞產(chǎn)率低，監(jiān)控不便，勞動(dòng)強(qiáng)度大） 。,11-7 動(dòng)物細(xì)胞

34、大規(guī)模培養(yǎng),2.1 微載體特點(diǎn) 1.良好的生物相容性、無毒無害 2.有好的黏附性，一般帶正電荷 3.大的比表面積：顆粒均勻，孔徑均一 4.良好的傳質(zhì)性能 5.強(qiáng)的機(jī)械性能：重復(fù)利用、保護(hù)細(xì)胞 6.好的熱穩(wěn)定性：能高壓滅菌,11-7 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng),2.2 微載體分類 1.實(shí)心微載體 優(yōu)點(diǎn)：易于細(xì)胞在表面貼壁，機(jī)械強(qiáng)度高，容易接種操作 缺點(diǎn)：細(xì)胞濃度低；細(xì)胞容易受剪切力、攪拌、碰撞等影響；細(xì)胞易老化脫落。,11-7 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng),2.多孔微載體 優(yōu)點(diǎn)：比表面積更大生長空間大；內(nèi)部生長可使 細(xì)胞免受機(jī)械損傷；易固定化培養(yǎng)，可以采用高 的攪拌速度和通氣量，強(qiáng)化傳質(zhì)。 缺點(diǎn)：容易產(chǎn)生營養(yǎng)傳遞

35、障礙，積聚代謝副產(chǎn)物。,11-7 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng),2.3 微載體培養(yǎng)細(xì)胞方法 1、選擇合適的微載體類型：細(xì)胞貼壁率高、細(xì)胞容納量大等 2、浸泡水化及消毒：用含Ca2+、Mg2+的PBS浸泡微載體3h，洗滌1次，高壓滅菌。,11-7 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng),3、接種：根據(jù)不同細(xì)胞類型決定接種濃度。 細(xì)胞在微載體表面的貼附是關(guān)鍵，主要取決于細(xì)胞與微載體的接觸概率和親和性，也與培養(yǎng)基組成（血清提供促接觸和伸展因子）、要慢速攪拌等相關(guān)。多數(shù)細(xì)胞都可在24小時(shí)內(nèi)貼壁。 4、培養(yǎng)與觀察、細(xì)胞計(jì)數(shù)：觀察形態(tài)是否正常，并計(jì)數(shù)控制密度。,11-7 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng),微載體細(xì)胞培養(yǎng)生長過程 1.游離期：接種的細(xì)

36、胞在培養(yǎng)液中呈懸浮態(tài)。 2.吸附期：不同類型的細(xì)胞的貼壁時(shí)間有所差異，多數(shù)細(xì)胞都可在24小時(shí)內(nèi)貼壁。 3.繁殖期：懸浮細(xì)胞貼壁后經(jīng)過一段停滯后開始分裂。隨著細(xì)胞數(shù)量的增多，細(xì)胞間開始接觸并連接成片。出現(xiàn)接觸性抑制。 4.退化期：細(xì)胞長滿載體表面，隨著營養(yǎng)物的消耗和代謝物的積累，密度抑制現(xiàn)象出現(xiàn)，細(xì)胞開始退化。如不及時(shí)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞脫落死亡。,11-7 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng),2.3 微載體培養(yǎng)細(xì)胞方法 5、消化與細(xì)胞回收：細(xì)胞貼壁率高、細(xì)胞容納量大等。 酶消化法：碳酸氫鈉堿性溶液浸泡，貼壁性差，使細(xì)胞脫落；用含EDTA的PBS緩沖液洗滌微球，胰蛋白酶-EDTA 37浸泡攪動(dòng)消化15min后，血清終

37、止 6、細(xì)胞收獲：離心沉降法(400r/min,2min)或100um過濾法。 7、傳代培養(yǎng)：“球傳球”傳代培養(yǎng)技術(shù),11-7 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng),球傳球接種技術(shù) 將貼滿細(xì)胞的微載體與新鮮微載體混合，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因隨機(jī)碰撞而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移貼附在新載體表面的技術(shù)。 優(yōu)點(diǎn)： （1）避免了細(xì)胞收獲與微載體再生過程，方便、高效。 （2）防止細(xì)胞調(diào)亡：通過定期更換微載體也能為細(xì)胞的分裂生長提供了新的生長空間，在長期培養(yǎng)過程中保持細(xì)胞活力，延長了細(xì)胞壽命，提高了細(xì)胞分泌物的產(chǎn)量。,11-8 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器,機(jī)械攪拌式：漿葉改造 充氣攪拌式：需要改造 微載體培養(yǎng)：解決空間分布與貼壁，連續(xù)灌注培養(yǎng) 中空纖維式：

38、解決貼壁、營養(yǎng)氣體有效吸收交換、連續(xù)灌注培養(yǎng),柱式中空纖維生物反應(yīng)器,中空纖維是一種細(xì)微的管狀結(jié)構(gòu)，管壁為極薄的半透膜。 主體是由微孔中空纖維管束制成的中空絲，纖維束由外殼包裹，因此可分為中空內(nèi)腔與中空外腔兩部分，每部分各有其進(jìn)出口。新鮮培養(yǎng)液從中空內(nèi)腔導(dǎo)入。氣體在管體部分通過，其中一部分則均勻地?cái)U(kuò)散至殼體內(nèi)部。,中空纖維反應(yīng)器,板框式：平行排列的中空纖維床,優(yōu)點(diǎn)：克服了纖維軸向流動(dòng)時(shí)營養(yǎng)供應(yīng)與產(chǎn)物積累存在的濃度梯度,中心灌流式,柱式中空纖維生物反應(yīng)器評價(jià),模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)。 既可用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。細(xì)胞如果是附壁性的，則附著在纖維外殼表面，在培養(yǎng)結(jié)束后用胰

39、蛋白酶消化液將其消化沖出；若是非附壁性的，應(yīng)采用微濾材料將其截留在反應(yīng)器內(nèi)而讓培養(yǎng)液排出。 優(yōu)點(diǎn)：無剪切力影響，高密度培養(yǎng)，傳質(zhì)效率高。 缺點(diǎn)：容易堵塞，價(jià)錢昂貴。,11-9 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的影響因素,1、有毒物質(zhì)或抑制因子產(chǎn)生 氨：來自培養(yǎng)基+代謝，積聚影響細(xì)胞生長和蛋白糖基化。 乳酸：來自細(xì)胞的糖代謝，抑制乳酸脫氫酶，抑 制糖酵解，能量產(chǎn)生減少，抑制細(xì)胞生長。 甲基乙二醛：脂類、氨基酸的代謝產(chǎn)物，對細(xì)胞 有潛在的損傷作用，改變有機(jī)物-NH3和-SH2。 CO2：毒害細(xì)胞或改變代謝水平、增大細(xì)胞滲透壓。,11-9 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的影響因素,2、物理因素 滲透壓：影響細(xì)胞生長、死亡速度

40、，影響產(chǎn)物積累； 載體：空間大小、孔隙大小，貼壁性、細(xì)胞移動(dòng)性 細(xì)胞死亡與凋亡：凋亡基因bcl-2 原因：營養(yǎng)成分耗盡、有毒產(chǎn)物積累 如谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補(bǔ)加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)凋亡。另外，動(dòng)物細(xì)胞在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。 參數(shù)控制：在線監(jiān)控 pH、溫度、氧氣、攪拌等,采取怎樣的工藝操作才可以消除細(xì)胞凋亡，保證高的細(xì)胞濃度？,1.減少細(xì)胞調(diào)亡 （1）可以去除氨、乳酸、甲基乙二醛等代謝 物質(zhì)。 （2）保證營養(yǎng)供給。 2.連續(xù)性收獲產(chǎn)品,11-10 動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)制備藥用蛋白,轉(zhuǎn)基因微生物在生產(chǎn)分子量較小、結(jié)構(gòu)較為簡單的異

41、源蛋白方面具有優(yōu)越性，微生物表達(dá)系統(tǒng)合成的復(fù)雜真核蛋白存在折疊方式不正確、缺乏翻譯后加工修飾等缺陷，動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)可以較好地解決這些問題。 大多數(shù)哺乳動(dòng)物蛋白翻譯后的修飾，例如：糖基化、磷酸化和乙?；?，是保持生物學(xué)活性、穩(wěn)定性及抗原性的前提。,11-10 動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)制備藥用蛋白,1. 動(dòng)物轉(zhuǎn)基因方法 （1）物理法-電穿孔法 利用脈沖電場提高細(xì)胞膜的通透性，在細(xì)胞膜上形成納米級的微孔，達(dá)到增加通透性的效果，從而使外源DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。 簡單、效率較高。,11-10 動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)制備藥用蛋白,（2）化學(xué)方法 DEAE-萄聚糖法 早期使用轉(zhuǎn)基因法，效率低。 原理：帶負(fù)電的DNA吸附在帶

42、正電荷的DEAE（二乙氨乙基）表面形成顆粒，通過胞飲作用進(jìn)入胞內(nèi)。,11-10 動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)制備藥用蛋白,磷酸鈣-DNA共沉法： 比前者高，但轉(zhuǎn)基因效率還較低。 原理：形成磷酸鈣-DNA沉淀顆粒，Ca2+能促使細(xì)胞膜脂裂開形成孔隙，使DNA進(jìn)入，也可通過胞飲作用進(jìn)入胞內(nèi)。,11-10 動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)制備藥用蛋白,脂質(zhì)體載體包埋法 將需轉(zhuǎn)移的外源DNA或RNA與脂質(zhì)體混合帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體內(nèi)形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物。由于脂質(zhì)體具有磷脂雙層結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞膜類似，因此可以與受體細(xì)胞膜融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。效率高。,11-10 動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)制備藥用蛋白,（3）生物學(xué)

43、方法 逆轉(zhuǎn)錄病毒法 逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種整合型的單鏈RNA病毒。 將目的基因重組到反轉(zhuǎn)錄病毒載體上，感染細(xì)胞。 病毒進(jìn)入細(xì)胞后，利用宿主細(xì)胞編碼出反轉(zhuǎn)錄酶， 將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成dsDNA，再自行和復(fù)制，再整 合到宿主細(xì)胞DNA上，但機(jī)制不明確。 如牛乳頭瘤病毒BPV，載體容量?。?KB）可表達(dá)干擾素、生長素等基因。,11-10 動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)制備藥用蛋白,2. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞與篩選 需選用在體外能無限生長的細(xì)胞作為受體細(xì)胞。采異用特性選擇標(biāo)記用于快速有效地篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 例如：胸腺嘧啶核苷激酶(Thymidine kinase,TK)： 當(dāng)轉(zhuǎn)入TK-細(xì)胞時(shí)，其基因產(chǎn)物可使宿主細(xì)胞獲得對HAT培養(yǎng)液的抗性。,11-