MTT原理、步驟、結(jié)果分析方法及注意事項(xiàng)

1、MTT原理、步驟、結(jié)果分析方法及注意事項(xiàng)一、MTT原理MTT全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-2)-3,5-diphenytetrazoliumromide，漢語化學(xué)名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定

2、細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，須被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機(jī)溶劑對實(shí)驗(yàn)者也有損害。二、MTT溶液的配制方法通常，此法中的MTT濃度為5 mg/mL。因此，可以稱取MTT 0.5 g，溶于100 mL的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22 m濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。

3、實(shí)驗(yàn)的時(shí)候我一般關(guān)閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。需要注意的是，MTT法只能用來檢測細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細(xì)胞絕對數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果的時(shí)候，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性，MTT吸光度最好在0-0.7范圍內(nèi)。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4C避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5 mg/mL保存在-20C長期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往細(xì)胞培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配置那么多液體，尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對不能再用了。MTT有致癌性，用的時(shí)候小心,有條件最好使用透明的一次性乳膠手套

4、.配成的MTT需要無菌環(huán)境，MTT對微生物很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者你不放心的時(shí)候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉.配制MTT時(shí)用PBS（pH=7.4）溶解。PBS配方：Nacl 8 g Kcl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.24 g調(diào)pH為7.4,定容1.0 L。三、普通MTT法實(shí)驗(yàn)步驟：1：接種細(xì)胞。用含10胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1000-10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200 uL。2：培養(yǎng)細(xì)胞。同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間）。3：呈色。培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液（

5、5 mg/mL用PBS配制，pH=7.4) 20 uL.繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心移除孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150 uL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。4：比色。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。四、藥物MTT法實(shí)驗(yàn)步驟：A：貼壁細(xì)胞：1：收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100 uL,鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度 1000-10000孔（邊緣孔用無菌PBS填充）。2：5% CO2，37孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物，原

6、則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個(gè)梯度,每孔100 uL,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔。建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況。3：5% CO2，37孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。4：每孔加入20 uL MTT溶液（5 mg/mL，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5：終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。6：每孔加入150 uL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD=490 nm處測量各孔的吸光值。7：同時(shí)

7、設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。B：懸浮細(xì)胞：1：收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1106/ml，按次序?qū)⒀a(bǔ)足的1640（無血清）培養(yǎng)基40 uL；加Actinomycin D（有毒性）10 uL用培養(yǎng)液稀釋(儲存液100 mg/mL，需預(yù)試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；需檢測物10uL；細(xì)胞懸液50uL（即5104cell/孔），共100 uL加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對照（加100 mL 1640培養(yǎng)基）。2：置37，5% CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。3：每孔加入10 u

8、L MTT溶液（5 mg/mL，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD=570 nm（630 nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值）。4：離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 uL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD=570 nm（630 nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值。5：同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。五、注意事項(xiàng)：(1) 選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。(2) 避免血清干擾。一般選小于10的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。(3) 設(shè)空白對照。與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗(yàn)步驟保持一致，最后比色以空白調(diào)零。(4) MTT實(shí)驗(yàn)吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線關(guān)系。(5) 用96孔板培養(yǎng)細(xì)胞做MTT測細(xì)胞活力,應(yīng)該加多少1640培養(yǎng)基,多少M(fèi)TT和DMSO合適根據(jù)書上說的加200 uL 1640培養(yǎng)基，20 uL MTT，150 uL DMSO加