動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)

1、2.2 動物細胞工程,生產(chǎn)單克隆抗體等,動物細胞工程常用的技術(shù),動物細胞培養(yǎng),動物細胞核移植,動物細胞融合,是其他動物細胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。,一.動物細胞培養(yǎng),如何進行細胞培養(yǎng)?,2.2.1動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù),從動物機體中取出相關(guān)組織，將它們分散成單個細胞，然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細胞生長和增殖。,(一)概念,閱讀P44-P45頁回答問題,問題1：試說動物細胞培養(yǎng)大致過程、原理,(二) 動物細胞培養(yǎng)過程,胚胎或幼齡動物的器官、組織,細胞懸液,10-50代細胞,剪碎,胰蛋白酶或膠原蛋白酶,胰蛋白酶處理分瓶培養(yǎng),原代培養(yǎng),動物細胞培養(yǎng)不能最終培養(yǎng)成生物體,細胞增殖緩慢，核型可能變化,貼壁

2、生長 接觸抑制,10代以內(nèi)，保持正常二倍體核型,傳代培養(yǎng),單個細胞,培養(yǎng)液,原理： 有絲分裂,問題4：為什么用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理？,問題2：、為什么選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細胞培養(yǎng)材料？,因為其細胞生命力旺盛，分裂能力強，分化程度低。,問題3、為什么培養(yǎng)前要將組織細胞分散成單個細胞？,分散成單個細胞、細胞群（團）后容易培養(yǎng)，細胞所需的營養(yǎng)容易供應(yīng)，其代謝廢物容易排出,動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，胰 蛋白酶處理動物組織，可以使動物組織細胞間的蛋白質(zhì)和 細胞外的其他成分酶解，獲得單個細胞。,問題5：為什么用胰蛋白酶處理而不用胃蛋白酶？,動物細胞培養(yǎng)的最適P

3、H值為7.2-7.4，胰蛋白酶作用的適宜PH為7.2-8.4，胃蛋白酶適宜PH為2.胃蛋白酶在PH為7.2-7.4的動物細胞培養(yǎng)中無活性。,問題6：用胰蛋白酶處理不會把所培養(yǎng)的細胞消化掉嗎？,控制好時間！長時間處理當(dāng)然會損傷細胞。,當(dāng)原代培養(yǎng)的細胞處于接觸抑制后, 用胰蛋白酶處理,使細胞從瓶壁上脫離下來,然后加入新的培養(yǎng)液,將細胞分離稀釋,并從原培養(yǎng)瓶內(nèi)轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)瓶內(nèi),這個過程稱傳代培養(yǎng).（分瓶培養(yǎng)的過程）,傳代培養(yǎng),原代培養(yǎng),定義：人們通常將動物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。,強調(diào)一：原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng),原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)、細胞株和細胞系（了解）,細胞株：傳代細胞一般能傳到40-50

4、代，遺傳物質(zhì)一般不會發(fā)生改變，叫細胞株。,細胞系：傳代50代以后，部分細胞遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，能無限增殖，獲得不死性，叫細胞系。,強調(diào)二：細胞貼壁過程,細胞貼壁：在培養(yǎng)瓶懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。,培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿壁要求：表面光滑、無毒、易于帖附。,當(dāng)貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時,細胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞的接觸抑制。,強調(diào)三：接觸抑制,多細胞動物和人體的細胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，根據(jù)你所學(xué)的內(nèi)環(huán)境的知識，思考以下問題： 1.體外培養(yǎng)細胞時需要提供哪些物質(zhì)？ 2.體外培養(yǎng)的細胞需要什么樣的環(huán)境條件？,P46討 論,充足營養(yǎng)（糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量

5、元素等合成成分及血清、血漿等天然成分。）,適宜溫度、PH和氣體環(huán)境；無菌無毒環(huán)境,(三) 動物細胞培養(yǎng)的條件P46,1、無菌、無毒環(huán)境（無菌處理和添加抗生素目的？更換培養(yǎng)液的好處？）,2、營養(yǎng):與體內(nèi)相同，液體合成培養(yǎng)基：糖、氨基酸、促生長因子、水、無機鹽、微量元素等，通常需加入血清、血漿等一些天然成分。,3、溫度和PH,4、氣體環(huán)境95%空氣、5%CO2-維持培養(yǎng)液PH,適宜的溫度：人和哺乳動物細胞最適溫度為36.50.5。 適宜的酸堿度：PH：7.2-7.4,動物細胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨特之處？,主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、無機鹽）、維生素和動物血清等。獨

6、特之處有：1、液體培養(yǎng)基 2、成分中有動物血清等,P47最上面 1、大規(guī)模的生產(chǎn)生物制品。 2、培養(yǎng)的動物細胞作為基因工程的受體細胞。 3、檢測判斷物質(zhì)的毒性。 4、培養(yǎng)正常或各種病變的細胞，用于生理、病理、藥理等方面的研究，如用于 等，為 及其他疾病提供理論依據(jù)。,(四) 動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用,篩選抗癌藥物,治療和預(yù)防癌癥,植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較,我收獲了什么？,背誦 1、動物細胞培養(yǎng)的過程、注意問題 2、動物細胞培養(yǎng)的條件、注意問題 3、動物細胞培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng)的比較,相互接觸,接觸抑制,單層,胰蛋白酶,衰老或死亡,不死性,降低,減少,活細胞的膜具有,選擇透過性，大分子染料不

7、能進入細胞，故不染色。,中,低溫,新陳代謝,酶,抗原,二.動物細胞核移植技術(shù)和克隆動物,將動物的一個細胞核，移入一個已經(jīng)去掉細胞核的卵母細胞中，使其重組并發(fā)育成為一個新的胚胎，這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體（克隆動物）,分 類,細胞分化程度低，恢復(fù)全能性容易,細胞分化程度高，恢復(fù)全能性不容易,(一)、 動物細胞核移植概念：,(二)、體細胞核移植的過程：,請看教材P48圖2-21,思考： 1.核移植的受體細胞是什么？處在什么時期？用此細胞作為受體細胞有什么好處？ 2.通過什么手段激活受體細胞，構(gòu)建重組胚胎？,M中期卵母細胞,誘導(dǎo)方法：物理或化學(xué)方法激活受體細胞，完成 細胞分裂和發(fā)育進程。,卵母細

8、胞體積大，便于操作；含有營養(yǎng)物質(zhì)豐富，提供早期胚胎發(fā)育所需的營養(yǎng)；含有激活細胞核體現(xiàn)全能性的物質(zhì)。,(二)、體細胞核移植的過程：,P49討論：,1.在體細胞的細胞核移植到受體卵母細胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細胞的核？,為使核移植的胚胎或動物的遺傳物質(zhì)全部 來自有重要利用價值的動物提供的體細胞，在 供體細胞的細胞核移至受體細胞之前，必須將 受體細胞的遺傳物質(zhì)去掉或?qū)⑵淦茐?P49小資料）。,培養(yǎng)的動物細胞一般當(dāng)傳代至1050代左 右時，部分細胞核型可能會發(fā)生變化，其細胞 遺傳物質(zhì)可能會發(fā)生突變，而10代以內(nèi)的細胞 一般能保持正常的二倍體核型。因此，在體細 胞核移植中，為了保證供體細胞正常的

9、遺傳基 礎(chǔ)，通常采用傳代10代以內(nèi)的細胞。,2.用于核移植的供體細胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細胞，想一想，這是為什么？,3.你認(rèn)為用上述體細胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動物，是對體細胞供體動物進行了100%的復(fù)制嗎？為什么？,絕大部分DNA來自于供體細胞核，但其核外還有 少量的DNA，即線粒體中的DNA是來自于受體卵 母細胞。,此外，即便動物的遺傳基礎(chǔ)完全相同，但動物的 一些行為、習(xí)性的形成與所處環(huán)境有很大關(guān)系， 核供體動物生活的環(huán)境與克隆動物所生活的環(huán)境 不會完全相同，其形成的行為、習(xí)性也不可能和 核供體動物完全相同，從這一角度看，克隆動物 不會是核供體動物100%的復(fù)制。,(三)、體細胞核移植

10、技術(shù)的應(yīng)用前景：,1、在畜牧業(yè)中可以加速家畜遺傳改良的進程,2、保護瀕危物種,3、醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)及組織器官的移植,4、了解胚胎發(fā)育和 衰老過程；追蹤研 究疾病的發(fā)展過程 和治療疾病,閱讀課本P50頁,(四)、體細胞核移植技術(shù)存在的問題：,思考與探究,1.幼齡與老齡動物的組織細胞比較，分化程度低的與分化程度高的組織細胞比較，哪一種更易于培養(yǎng)？思考一下，這是什么道理？,提示：細胞的衰老與動物機體的衰老有著密切的關(guān)系，細胞的增殖能力與供體的年齡有關(guān)，幼齡動物細胞增殖能力強，有絲分裂旺盛，老齡動物則相反。所以，一般來說幼年動物的組織細胞比老年動物的組織細胞易于培養(yǎng)。同樣，組織細胞的分化程度

11、越低，則增殖能力越強，所以更容易培養(yǎng)。,思考與探究,2.動物細胞培養(yǎng)要經(jīng)過脫分化的過程嗎？為什么？,動物細胞培養(yǎng)不需經(jīng)過脫分化過程。因高度分化的動物細胞發(fā)育潛能變窄，失去了發(fā)育成完整個體的能力，所以，動物細胞也就沒有類似植物組織或細胞培養(yǎng)時的脫分化過程了。要想使培養(yǎng)的動物細胞定向分化，通常采用定向誘導(dǎo)動物干細胞，使其分化成所需要的組織或器官。,3.1997年，美國威斯康星州的一個奶牛場有一頭 名叫盧辛達（Lucinda）的奶牛，年產(chǎn)奶量為 30.8 t，創(chuàng)造了世界奶牛產(chǎn)奶量最高新紀(jì)錄。目 前世界各國高產(chǎn)奶牛場奶牛，年平均產(chǎn)奶量一般 為十幾噸，而我國奶牛產(chǎn)奶量年平均水平僅為34 t。 （1）能利

12、用體細胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達嗎？請說明理由。,可以。盧辛達的產(chǎn)奶量很高，有高產(chǎn)奶的遺傳基礎(chǔ)，利用盧辛達的體細胞克隆的奶牛其遺傳物質(zhì)基本上全部來自該奶牛，其克隆牛具有高產(chǎn)的遺傳基礎(chǔ)，如果精心培育和飼養(yǎng)，有可能在世界范圍內(nèi)推廣，克隆牛再與高產(chǎn)的公牛自然繁殖，可得到很多高產(chǎn)的后代，從而加快奶牛改良進程。,該克隆牛不能無限制地推廣，其數(shù)量不宜過多，尤其是在小范圍內(nèi)不能無限的繁殖，以避免奶牛群出現(xiàn)近親繁殖而引起種質(zhì)衰退。,（2）如果將克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達的任務(wù)交給你，你將如何對它進行克??？,從盧辛達耳朵（也可用別的組織、器官，耳朵在活體上容易取）上剪取一小塊組織，在體外培養(yǎng)獲得該組織（如軟骨組織）的細胞。從屠宰場取廢棄的牛卵巢，抽取卵母細胞體外培養(yǎng)成熟。用顯微針去除卵母細胞的核，再將耳細胞注入卵母細胞，用電刺激方法使卵母細胞與體細胞融合，這時供體核就進入了受體卵母細胞，再用電刺激或化學(xué)物質(zhì)激活注入了體細胞核的卵母細胞，