焦磷酸測(cè)序技術(shù)的原理

1、Pyrosequencing技術(shù)的原理Pyrosequencing是一項(xiàng)全新的DNA測(cè)序技術(shù)，可以快速、準(zhǔn)確地測(cè)定一段較短的目標(biāo)片段。其基本原理如下：第1步：1個(gè)特異性的測(cè)序引物和單鏈DNA模板結(jié)合，然后加入酶混合物（包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS和Luciferin）。第2步：向反應(yīng)體系中加入1種dNTP,如果它剛好能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對(duì)，則會(huì)在DNA 聚合酶的作用下，添加到測(cè)序引物的3末端，同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦磷酸（PPi）。第2步圖示(圖片來(lái)自互聯(lián)網(wǎng))第3步：在ATP硫酸化酶的作用

2、下，生成的PPi可以和APS結(jié)合形成ATP;在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見(jiàn)光。通過(guò)CCD光學(xué)系統(tǒng)即可獲得一個(gè)特異的檢測(cè)峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。第3步圖示(圖片來(lái)自互聯(lián)網(wǎng))第4步：反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。第4步圖示(圖片來(lái)自互聯(lián)網(wǎng))第5步：加入另一種dNTP,使第2-4步反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息。第4步圖示(圖片來(lái)自互聯(lián)網(wǎng))Pyrosequecing技術(shù)操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于SNP位點(diǎn)檢測(cè)、等位基因頻率測(cè)定、細(xì)菌和病毒分型等領(lǐng)域。附件列表

3、下載次數(shù)：0 如果您認(rèn)為本詞條還有待完善，請(qǐng) 編輯詞條上一篇SNP（單核苷酸多態(tài)性）下一篇閱讀質(zhì)粒圖譜具體事例【摘要】 建立了一種將序列標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)與焦磷酸測(cè)序技術(shù)結(jié)合的相對(duì)基因表達(dá)量測(cè)定法(簡(jiǎn)稱(chēng)“SRPP”)。先用來(lái)源特異性引物對(duì)不同來(lái)源的同一基因通過(guò)反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記上特異性標(biāo)簽，PCR后用焦磷酸測(cè)序法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列解碼，使得測(cè)序結(jié)果中的序列代表基因的來(lái)源，峰高代表基因在不同來(lái)源中的相對(duì)表達(dá)量。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)本方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，SRPP可以同時(shí)準(zhǔn)確測(cè)定同一基因在3個(gè)不同來(lái)源中的表達(dá)量，并實(shí)際測(cè)定了Egr1基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表達(dá)量差異

4、。 【關(guān)鍵詞】 序列標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄, 聚合物鏈反應(yīng)，焦磷酸測(cè)序，基因表達(dá)1 引 言差異表達(dá)基因與疾病密切相關(guān)，深入研究可在基因水平揭示疾病的發(fā)病機(jī)制。目前，用于檢測(cè)基因表達(dá)水平的技術(shù)主要有SAGE法1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法2,3和基因芯片法4等。但這些方法存在儀器設(shè)備昂貴、定量性能差以及同時(shí)測(cè)定基因表達(dá)量的來(lái)源數(shù)目受限等缺點(diǎn)。焦磷酸測(cè)序技術(shù)是新近發(fā)展起來(lái)的一種基于酶催化化學(xué)反應(yīng)的測(cè)序技術(shù)58，不需要使用熒光標(biāo)記，定量性能好。目前，焦磷酸測(cè)序技術(shù)多用于單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、微生物分型和基因甲基化分析等。本研究將焦磷酸測(cè)序技術(shù)用于基因表達(dá)量差異的比較分析，考察了其可行性和準(zhǔn)確性，并將其應(yīng)用于檢

5、測(cè)Egr1基因在糖尿病、肥胖癥和正常小鼠中的差異表達(dá)。 2 實(shí)驗(yàn)部分2.1 儀器、試劑與材料21R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司);Gene Spe微量核酸蛋白測(cè)定儀(日本Naka Instrument公司);PTC225 PCR擴(kuò)增儀、Opticon實(shí)時(shí)熒光PCR儀(美國(guó)MJ Research公司)。焦磷酸測(cè)序裝置由本實(shí)驗(yàn)室自行組裝9,10。此裝置主要由焦磷酸測(cè)序反應(yīng)模塊、熒光信號(hào)放大和數(shù)據(jù)采集3部分組成。反應(yīng)模塊由位于中間的反應(yīng)池通過(guò)毛細(xì)管與四周的dNTP儲(chǔ)液池相連組成。通過(guò)注射器施壓使4種dNTP循環(huán)加入反應(yīng)池完成測(cè)序反應(yīng)。熒光信號(hào)通過(guò)R6335光電倍增管(日本Hamama

6、tsu Photonics K.K.公司)放大后，經(jīng)BPCL微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x(北京中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所)采集數(shù)據(jù)。Hotstar Taq DNA聚合酶、Omniscript RT kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國(guó)Qiagen公司);Trizol(上海Inviotrogen公司);熒光素、熒光素酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶和5磷酸化硫酸腺苷(美國(guó)Sigma公司); DynabeadsM280鏈霉親和素磁珠(挪威Dynal AS公司); Klenow DNA 聚合酶(美國(guó)Promega公司);所有引物均由上海Invitrogen公司合成。實(shí)驗(yàn)中用到的糖尿病、肥胖和正常小鼠的肝組織由南京師范

7、大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。2.2 RNA的提取用Trizol試劑盒抽提RNA，用紫外分光光度法測(cè)定RNA濃度及純度。2.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈取等量的不同來(lái)源的總RNA，分別以來(lái)源特異性反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄。即取總RNA 0.052.0 g至Nucleasefree的小管中，加DEPCH2O至12 L;65 反應(yīng)5 min后，置冰上至少1 min;在上述各小管中加入10第一鏈合成緩沖液2 L，0.5 mmol/L dNTP混合物，10 U RNase 抑制劑，200 U Omniscript Reverse Transcriptase，1 mol/L反轉(zhuǎn)錄引物，加DEPCH2O至總體積為20 L

8、。反轉(zhuǎn)錄條件為：37 反應(yīng)1 h, 93 反應(yīng)5 min，然后中止反應(yīng)。2.4 基因特異性PCR不同來(lái)源的cDNA等比例混合，以共用引物CP(5CCA TCT GTT CCC TCC CTG TC3)和生物素標(biāo)記的基因特異性引物(GSP)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR體系為： cDNA等比例混合液1 L， 0.3 mol/L CP和GSP，1.5 mmol/L Mg2+， 0.2 mmol/L dNTP 混合物，10PCR 緩沖液 5 L，5Q 溶液 10 L ， 1 U HotStar Taq DNA聚合酶，并加入滅菌蒸餾水至50 L。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?94 變性 15 min，熱循環(huán)35次(94

9、, 40 s; 60 , 40 s; 72 , 1 min )， 72 延伸10 min， 4 保存。基因特異性引物的序列見(jiàn)表1。表1 實(shí)驗(yàn)用引物2.5 焦磷酸測(cè)序固相單鏈模板的制備取5 L戴諾磁珠(Dynabeads)，用磁鐵吸棄上清液。磁珠以100 L B&W Buffer(10 mmol/L TrisHCl, pH 7.5, 1 mmol/L EDTA, 2.0 mol/L NaCl)洗滌兩遍，最終懸浮于50 L B&W 緩沖液中;加入50 L PCR產(chǎn)物，37 反應(yīng)30 min;用磁鐵吸棄上清液，磁珠以180 L H2O洗滌兩遍，加入0.1 mol/L NaOH溶液20 L，混勻室溫放

10、置5 min使PCR產(chǎn)物變性;磁鐵吸棄上清液，磁珠以100 L B&W 緩沖液洗滌兩遍，100 L 1退火緩沖液洗一遍，最終溶于8 L 1退火緩沖液中;加入1 L 10 mol/L測(cè)序引物，93 混勻30 s，55 退火3 min，4 保存，待測(cè)序用。 2.6 焦磷酸測(cè)序反應(yīng)焦磷酸測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)混合液的組成為：0.1 mol/L TrisAc緩沖液(pH 7.7)，2 mmol/L EDTA，10 mmol/L Mg(Ac)2，0.1% BSA，1 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)，3 mol/L 5磷酸化硫酸腺苷(adenosine5phosphosulfate，APS)，0.4 g/L PVP

11、，0.4 mmol/L D蟲(chóng)熒光素，210-4 U/L三磷酸腺苷硫酸化酶，210-3 U/L 三磷酸腺苷雙磷酸酶，1810-3 U/L無(wú)外切酶活性的Klenow DNA聚合酶，14.6 mg/L熒光素酶。3 結(jié)果與討論3.1 方法原理焦測(cè)序技術(shù)是一種基于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)定量測(cè)定引物延伸副產(chǎn)物焦磷酸鹽(PPi)的測(cè)序技術(shù)。其原理是：引物與模板DNA退火后, 在DNA 聚合酶(polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、熒光素酶(luciferase) 和三磷酸腺苷雙磷酸酶(apyrase)的協(xié)同作用下完成循環(huán)測(cè)序反應(yīng)。當(dāng)加入的dNTP與模板互補(bǔ)時(shí)，DNA模板與互補(bǔ)的

12、dNTP聚合可以產(chǎn)生等摩爾PPi;在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化下，PPi與5磷酸化硫酸腺苷(APS)反應(yīng)生成等量的ATP;在熒光素酶催化作用下，ATP與蟲(chóng)熒光素(luciferin)反應(yīng)發(fā)出熒光。產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度與聚合的測(cè)序模板量和堿基數(shù)成正比，根據(jù)加入的dNTP類(lèi)型和測(cè)得的熒光信號(hào)強(qiáng)度就可實(shí)時(shí)記錄模板DNA 的核苷酸序列。反應(yīng)方程式如下：(DNA)n+dNTPpolymerase(DNA)n+l+PPi(1)PPi+APSATP sulfurylaseATP+SO2-4(2)ATP+Luciferin+O2luciferaseAMP+PPi+Oxyluciferin+CO2+hv(3)dNT

13、PApyrasedNDP+PiApyrasedNMP+Pi(4)ATPApyraseADP+PiApyraseAMP+Pi(5)為了定量測(cè)定基因表達(dá)量差異，本研究將堿基序列標(biāo)記法與焦磷酸測(cè)序解碼技術(shù)相結(jié)合，其關(guān)鍵點(diǎn)在于：在不同來(lái)源的同一基因中標(biāo)記上區(qū)別樣品來(lái)源的特異性標(biāo)簽;對(duì)標(biāo)記序列進(jìn)行解碼和定量測(cè)定。采用反轉(zhuǎn)錄引物將來(lái)源特異性堿基標(biāo)記到各來(lái)源待測(cè)基因，然后用焦磷酸測(cè)序定量測(cè)定標(biāo)記序列。具體測(cè)定過(guò)程如圖1所示：(1) 用來(lái)源特異性反轉(zhuǎn)錄引物對(duì)不同來(lái)源的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。引物由4部分組成：5端為共用序列;位于引物中間的4個(gè)堿基為人為設(shè)計(jì)的來(lái)源特異性標(biāo)簽，在圖1中以深淺不同的4個(gè)小圓點(diǎn)表示;3端為

14、oligo(dT)n和用于固定oligo(dT)n位置的兩個(gè)兼并堿基。來(lái)源特異性反轉(zhuǎn)錄引物的堿基組成和數(shù)目都相同，只是位于中間的來(lái)源特異性堿基的排列位置有所差異;(2) 不同來(lái)源的cDNA稀釋后等比例混合;(3) 用生物素標(biāo)記的基因特異性引物和共用引物擴(kuò)增上述混合物，通過(guò)改變基因特異性引物就可以進(jìn)行任何基因的表達(dá)量差異分析;(4) 用磁性微球技術(shù)將PCR產(chǎn)物制備成單鏈，根據(jù)來(lái)源特異性反轉(zhuǎn)錄引物中來(lái)源標(biāo)簽序列進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。測(cè)序結(jié)果中，各來(lái)源特異性堿基的相對(duì)峰高即代表相對(duì)基因表達(dá)量差異。本方法稱(chēng)之為SRPP法(Sequencetagged reversetranscription PCR wit

15、h pyrosequencing)。圖1 堿基序列標(biāo)記法結(jié)合焦磷酸測(cè)序解碼技術(shù)測(cè)定基因表達(dá)量差異的原理圖Fig.1 Principle of comparative gene expression analysis by coupling sequencetagged reversetranscription polymerase chain reaction(PCR) with pyrosequencing (SRPP)由于不同來(lái)源的同一基因在單管中只用一對(duì)引物進(jìn)行PCR，并且擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基組成和含量完全一樣，僅4個(gè)堿基的排列順序不一樣，具有相同的保留時(shí)間。所以來(lái)源不同，表達(dá)量不同的同一基因

16、在單管中能實(shí)現(xiàn)等比例擴(kuò)增。SRPP測(cè)定峰高比值也即能代表起始基因的相對(duì)表達(dá)量。3.2 焦磷酸測(cè)序的定量特性在同一焦磷酸測(cè)序反應(yīng)體系中，產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度與ATP的量成正比，而ATP的量與聚合的dNTP 個(gè)數(shù)成正比，所以可以根據(jù)圖譜中測(cè)得的信號(hào)強(qiáng)度推測(cè)出模板DNA相對(duì)含量。為了驗(yàn)證焦磷酸測(cè)序的定量特性，人為設(shè)計(jì)了一條測(cè)序單鏈(5GG TT CC AA G T C A CCCCGCCCGC3 )和一條測(cè)序引物(5GCGGGCGGGG3)，使測(cè)序單鏈的3端與測(cè)序引物單鏈的5端完全互補(bǔ)。兩條單鏈退火后按dTTPdGTPdATPSdCTP的順序循環(huán)遞加dNTP進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。結(jié)果顯示，待測(cè)模板上測(cè)序引物的

17、延伸序列為“T G A C TT GG AA CC”12個(gè)堿基，其信號(hào)強(qiáng)度跟同質(zhì)區(qū)的相同堿基個(gè)數(shù)成正比。這一結(jié)果表明，峰強(qiáng)度與被引物延伸模板的量成正比，可通過(guò)測(cè)定各峰的峰高之比確定對(duì)應(yīng)的模板的相對(duì)含量。本研究利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)的定量特性，通過(guò)測(cè)序圖譜中的峰高比值分析不同來(lái)源的基因相對(duì)表達(dá)量。3.3 來(lái)源特異性基因的標(biāo)記及標(biāo)記模板的等比例擴(kuò)增SRPP法定量的關(guān)鍵在于能否在單管中等比例擴(kuò)增經(jīng)標(biāo)記的不同來(lái)源的同一基因。為了驗(yàn)證SRPP法是否具有此特性，人工模擬了一系列Actb基因的3個(gè)不同來(lái)源(分別命名為“來(lái)源G”，“來(lái)源T”和“來(lái)源C”)進(jìn)行測(cè)定。具體方法為取同一來(lái)源的RNA樣品分成3等份，分別用

18、來(lái)源特異性反轉(zhuǎn)錄引物RTG(5CCA TCT GTT CCC TCC CTG TC gatc ttt ttt ttt ttt ttt VN3), RTT(5CCA TCT GTT CCC TCC CTG TC tacg ttt ttt ttt ttt ttt VN3)和RTC (5CCA TCT GTT CCC TCC CTG TC catg ttt ttt ttt ttt ttt VN3)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別被標(biāo)記上“來(lái)源G”、“來(lái)源T”和“來(lái)源C”的特異性標(biāo)簽(上述序列中的帶下劃線的斜體部分)。然后將上述經(jīng)標(biāo)記的cDNA模板，分別以111, 511, 151和115(來(lái)源G來(lái)源

19、T來(lái)源C)的體積比混合，作為系列人工模擬模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)定結(jié)果如圖2所示，序列中的第一個(gè)堿基“G”代表“來(lái)源G” 的模板;第二個(gè)堿基“T”代表“來(lái)源T”的模板;第三個(gè)堿基“C”代表“來(lái)源C” 的模板。3個(gè)堿基信號(hào)峰的相對(duì)強(qiáng)度代表著Actb基因在3個(gè)不同來(lái)源中的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)計(jì)算峰高的比值即可得到所測(cè)基因在不同來(lái)源中的表達(dá)差異。由于dNTP不穩(wěn)定，存在少量的分解產(chǎn)物PPi，在焦磷酸測(cè)序中可能會(huì)出現(xiàn)背景峰，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。為此，焦磷酸測(cè)序中每種dNTP都連續(xù)加入兩次，所以圖2中每次焦磷酸測(cè)序都出現(xiàn)6個(gè)峰。其中第1次得到的峰為信號(hào)峰，第2次為dNTP背景峰，計(jì)算結(jié)果時(shí)要在信號(hào)強(qiáng)度中扣除

20、背景。3種來(lái)源模板等量混合(111)的測(cè)序結(jié)果如圖2A所示，測(cè)得的峰高比為1.11.01.0 (來(lái)源G來(lái)源T來(lái)源C)，此測(cè)定值與模板理論比例111十分相近;如圖2(BD)所示， 圖2 Actb基因在不同人工模擬3種來(lái)源中的表達(dá)量差異測(cè)序圖譜，3種來(lái)源的理論表達(dá)量比為111(A), 511(B), 151(C)和115(D)(每種dNTP都連續(xù)加入兩次以扣除其背景吸收)Fig.2 Pyrograms of simulated templates prepared by pooling three sourcespecific cDNAs at the ratios of 111 (A), 511

21、 (B), 151 (C), and 115 (D), respectively. PCR was performed by using the common primer and the Actb genespecific primer. Each deoxyribonucleoside triphosphate(dNTP) was dispensed twice for detecting the background due to pyrophosphoric acid(PPi) impurity in dNTP solution模板比例為511, 151 和115 的SRPP測(cè)定結(jié)果分

22、別為：5.11.01，0.974.81和0.20.21。結(jié)果表明，不同比例的各標(biāo)記模板(各模板的差別僅是4個(gè)堿基的排列序列不同)得到了等比例擴(kuò)增，沒(méi)有序列歧視性，即通過(guò)測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的比例就可以間接得到不同來(lái)源中基因的表達(dá)量差異。3.4 準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性，將本方法的測(cè)定結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行比較。采用本方法平行測(cè)定2次，Actb基因在小鼠腎、心和腦中的相對(duì)表達(dá)量之比分別為38.819.841.3和40.019.540.5。平均值為39.419.640.9。同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR測(cè)得Actb基因在腎、心和腦中的相對(duì)表達(dá)量比值為37.822.040.2。與兩種方法測(cè)定結(jié)果一致, 說(shuō)明SRPP可以用于準(zhǔn)確測(cè)定同一基因在不同來(lái)源中的表達(dá)量差異。3.5 Egr1基因在糖尿病小鼠、肥胖小鼠和正常小鼠肝中的