瓊脂糖凝膠電泳實驗

1、. 瓊脂糖凝膠電泳實驗2011-11-03 09:43:56 來源：生物秀 評論：0 我要評論實驗二瓊脂糖凝膠電泳實驗【實驗?zāi)康摹浚?） 學習瓊脂糖凝膠電泳的基本原理；（2） 掌握使用水平式電泳儀的方法；（3） 學習在含有甲醛的凝膠上進行rna電泳的方法?！緦嶒炘怼凯傊悄z電泳是基因工程實驗室中分離鑒定核酸的常規(guī)方法。核酸是兩性電解質(zhì)，其等電點為ph2-2.5，在常規(guī)的實驗二 瓊脂糖凝膠電泳實驗【實驗?zāi)康摹浚?） 學習瓊脂糖凝膠電泳的基本原理；（2） 掌握使用水平式電泳儀的方法；（3） 學習在含有甲醛的凝膠上進行rna電泳的方法?！緦嶒炘怼凯傊悄z電泳是基因工程實驗室中分離鑒定核酸的常

2、規(guī)方法。核酸是兩性電解質(zhì)，其等電點為ph2-2.5，在常規(guī)的電泳緩沖液中（ph約8.5），核酸分子帶負電荷，在電場中向正極移動。核酸分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，具有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，但主要為分子篩效應(yīng)。因此，核酸分子的遷移率由下列幾種因素決定：（1）dna的分子大小。線狀雙鏈dna分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與dna分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中移動，因而遷移得越慢。（2）dna分子的構(gòu)象。當dna分子處于不同構(gòu)象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋質(zhì)粒dna在瓊脂糖凝膠中移動的速度是不一樣的，超螺

3、旋dna移動得最快，而開環(huán)狀dna移動最慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條dna帶難以確定是質(zhì)粒dna不同構(gòu)象引起還是因為含有其他dna引起時，可從瓊脂糖凝膠上將dna帶逐個回收，用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現(xiàn)相同的dna圖譜，則為同一種dna。（3）電源電壓。在低電壓時，線狀dna片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的dna片段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb 的dna 片段的分辨率達到最大，所加電壓不得超過5v/cm。（4）離

4、子強度影響。電泳緩沖液的組成及其離子強度影響dna的電泳遷移率。在沒有離子存在時（如誤用蒸餾水配制凝膠），電導(dǎo)率最小，dna幾乎不移動；在高離子強度的緩沖液中（如誤加10電泳緩沖液），則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴重時會引起凝膠熔化或dna變性。溴化乙啶(ethidium bromide, eb)（1） 能插入dna分子中形成復(fù)合物，在波長為254nm紫外光照射下eb能發(fā)射熒光，而且熒光的強度正比于核酸的含量，如將已知濃度的標準樣品作電泳對照，就可估算出待測樣品的濃度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑， 所以現(xiàn)在也開發(fā)出了安全的染料，如sybergreen。常規(guī)的水平式瓊脂糖凝膠電泳適合于dna和rna的分

5、離鑒定；但經(jīng)甲醛進行變性處理的瓊脂糖電泳更適用于rna的分離鑒定和northern 雜交，因為變性后的rna是單鏈，其泳動速度與相同大小的dna分子量一樣，因而可以進行rna分子大小的測定，而且染色后條帶更為銳利，也更牢固結(jié)合于硝酸纖維素膜上，與放射性或非放射性標記的探針發(fā)生高效雜交。精品.【試劑與器材】（一）材料電泳儀、水平電泳槽、樣品梳子、瓊脂糖等（二）試劑1、 50?tae(1000ml)：242g tris,57.1ml 冰醋酸，18.6g edta。2、 eb溶液：100ml水中加入1g溴化乙啶，磁力攪拌數(shù)小時以確保其完全溶解，分裝，室溫避光保存。3、 dna加樣緩沖液：0.25%溴

6、酚藍，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。4、 rna甲醛變性膠上樣緩沖液：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青，1mm edta(ph8.0)，50%甘油（w/v），用depc水配制，高壓滅菌備用。5、 5?甲醛變性膠電泳緩沖液：0.1m mops(ph7.0)，40mm醋酸鈉，5mm edta(ph8.0)，用depc水配制，過濾除菌，室溫避光保存。淡黃色緩沖液可正常使用，深黃色應(yīng)棄用?！静僮鞣椒ā浚ㄒ唬┏Ｒ?guī)的水平式瓊脂糖電泳制備瓊脂糖凝膠：按照被分離dna分子的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量；一般情況下，可參考下表：瓊脂糖的含量（%） 分離線狀dna分子的有效范圍（kb）0.3

7、60-50.6 20-10.7 10-0.80.9 7-0.51.2 6-0.41.5 4-0.22.0 3-0.11制備瓊脂糖凝膠：稱取瓊脂糖，加入1x電泳緩沖液，待水合數(shù)分鐘后，置微波爐中將瓊脂糖融化均勻。在加熱過程中要不時搖動,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液；加熱時應(yīng)蓋上封口膜,以減少水份蒸發(fā)。2膠板的制備：將膠槽置于制膠板上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙，待膠溶液冷卻至50左右時，加入最終濃度為0.5微克/毫升的eb(也可不把eb加入凝膠中,而是電泳后再用0.5g/ml的eb溶液浸泡染色15分鐘)，搖勻，輕輕倒入電泳制膠板上，除掉氣泡；待凝膠冷卻凝

8、固后，垂直輕拔梳子；將凝膠放入電泳槽內(nèi)，加入1x電泳緩沖液，使電泳緩沖液液面剛高出瓊脂糖凝膠面；3加樣：點樣板或薄膜上混合dna樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1x。用10 l微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個樣品，應(yīng)更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序和點樣量）。4電泳：加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，dna的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5v/cm。當瓊脂糖濃度低于0.5%，電泳溫度不能太高。樣品由負極（黑色）向正極（紅色）方向移動。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當溴酚藍移動到距離膠板

9、下沿約1cm處時，停止電泳。5觀察和拍照：電泳完畢，取出凝膠。在波長為254nm的紫外燈下觀察染色后精品.（2）的或已加有eb的電泳膠板。dna存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存之。（二） 在含有甲醛的凝膠上進行的rna電泳（選做）配制23 ml甲醛電泳膠：0.336g瓊脂糖溶于20ml depc水中，冷卻至60?c，加入5ml的5x甲醛變性膠電泳緩沖液和5.5ml的甲醛，在通風櫥內(nèi)倒膠，冷卻30分鐘后使用。甲醛變性膠rna樣品的制備：1l rna，5?甲醛變性膠電泳緩沖液0.5l，甲醛0.7l，甲酰胺2l，65oc加熱15min，迅速冰浴，加1l上樣緩沖液和0.

10、2l的eb。步驟：1 用3%過氧化氫浸泡電泳槽、膠板、梳子30分鐘以上。2 膠板的制備：按常規(guī)瓊脂糖電泳法。3 預(yù)電泳：1甲醛變性膠電泳緩沖液，預(yù)電泳10 min。電壓為5v/cm。4 小心地進行點樣，記錄樣品次序與點樣量；然后開始電泳，電壓為3-4v/cm。5 觀察和拍照：在波長為254nm的紫外燈下觀察電泳膠板并拍照保存圖片?！咀⒁馐马椗c提示】（1）eb是強誘變劑并有中等毒性，易揮發(fā)，配制和使用時都應(yīng)戴手套，并且不要把eb灑到桌面或地面上。凡是沾污了eb的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。簡單處理方法為：加入大量的水進行稀釋（達到0.5mg/ml以下），然后加入0.2倍體積新鮮配制

11、的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍體積新鮮配制的0.5mol/l 的亞硝酸鈉，混勻，放置1天后，加入過量的1mol/l碳酸氫鈉。如此處理后的eb的誘變活性可降至原來的1/200左右。（2）由于eb會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀dna，使dna遷移率降低。因此，如果要準確地測定dna的分子量，應(yīng)該采用跑完電泳后再用0.5g/ml的eb溶液浸泡染色的方法。（3）總rna的分析：哺乳動物的rna由28s rrna、18s rrna和mrna以及其它小分子rna組成，28s和18s rrna處為明顯的亮帶（相當于4.5kb和1.9kb），28s/18s應(yīng)為1.5-2.

12、5/1；植物、昆蟲、酵母和兩棲動物的rna帶分布較小，約為0.5-3.0kb左右；假如28s/18s小于1/1，或者出現(xiàn)拖帶，說明rna已經(jīng)有部分降解，如果28s和18s rrna大部分已降解，則需重新制備?！緦嶒灠才拧恐恍枰惶欤荷衔缗湓噭┑鼓z，下午跑電泳并觀察拍照?！緦嶒瀳蟾嬉笈c思考題】1、附上電泳結(jié)果的圖片并進行正確的標注（如下圖）精品.m：1kb dna ladder；1：質(zhì)粒dna2、瓊脂糖凝膠電泳中dna分子遷移率受哪些因素的影響？3、如果樣品電泳后很久都沒有跑出點樣孔，你認為有哪幾方面的原因？電泳流程圖：精品.凝膠加樣緩沖液 緩沖液類型6緩沖液貯存溫度0.25%溴酚藍40.25%二甲苯青ff40%（w/v）蔗糖水溶液0.25溴酚藍室溫0.25%二甲苯青ff15%聚蔗糖(ficoll400)0.25%溴酚藍40.25%二甲苯青ff30%甘油水溶液0.25%溴酚藍440%(w/v)蔗糖水溶液堿性加樣緩沖液:300mmol/l naoh6mmol/l edta18%聚蔗糖(ficoll400)40.15%溴甲酚綠0.25%二甲苯青ff 使用以上凝膠加樣緩沖液的目的有三：增大樣品密度；以確保dna均勻進入樣品孔內(nèi)；使樣品呈現(xiàn)顏色，從而使加樣操作更為便利，含有在電塊中能以可預(yù)知速率向陽極泳動的染料。溴酚藍在瓊脂糖中移動的速率約為二甲苯青ff的2.2倍，而與瓊脂糖