限制性核酸內(nèi)切酶切割原理方法結果分析及應用

1、PPT制作：杜雨濛、張佳佳、陳靚,限制性核酸內(nèi)切酶切割原理、方法、結果分析及應用,課堂內(nèi)容回顧：,1、定義： 1、定義：限制性核酸內(nèi)切酶是可以識別特定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵進行切割的一類酶，簡稱限制酶。,2、分類： （根據(jù)酶的基因、蛋白質結果、依賴的輔助因子及DNA裂解的特異性，將限制性內(nèi)切酶分為三種類型）,型酶：具有DNA修飾的作用在非特異位點處切割DNA。型酶：是最重要的工具酶能在DNA分子內(nèi)部的特異位點識別和切割DNA雙鏈，所 以通常所說的限制性內(nèi)切酶就指這一類酶。型酶：與型酶一樣，具有限制與修飾活性，其切割位點很難預測,型酶：具有DNA修飾的作用

2、在非特異位點處切割DNA。型酶：是最重要的工具酶能在DNA分子內(nèi)部的特異位點識別和切割DNA雙鏈，所 以通常所說的限制性內(nèi)切酶就指這一類酶。型酶：與型酶一樣，具有限制與修飾活性，其切割位點很難預測。,3、命名： 規(guī)則： 第一個字母（大寫）：取自該酶的細胞屬名 第二、三個字母（小寫）：該細胞的種名 第四個字母（羅馬數(shù)字）：代表同一菌株中 不同限制性內(nèi)切酶的編號 例如：EcoR、Hind 等等,限制性核酸內(nèi)切酶切割原理,1、類和類酶： 在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾（甲基化）作用且依賴于ATP的存在。類酶結合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而類酶在識別位點上切割DNA分子，然后從底

3、物上解離。 2、類由兩種酶組成： 一種為限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶），它切割某一特異的核苷酸序列； 另一種為獨立的甲基化酶，它修飾同一識別序列。類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應用，它們是重組DNA的基礎。絕大多數(shù)類限制酶識別長度為4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列，產(chǎn)生5或3黏性末端（也有一些產(chǎn)生平端或鈍端）,幾種限制性內(nèi)切酶的切割位點,例如：,3、同工異源酶：來源不同但能識別和切割同一位點的酶。如：BamH和Bst，Xho和Pae R7等可以相互代替使用。 4、同尾酶：識別序列不同，但產(chǎn)生相同末端的限制性內(nèi)切酶。如：BamH和Sau3A等由此產(chǎn)生的DNA片段可借黏性末端相互連接，

4、操作是具有更大的靈活性。,通過 使 用 (15 種 )限 制 性 內(nèi) 切 酶 酶 切 重 組質粒，說明限制性內(nèi)切酶的應用和限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析的方法o,方法：,1.質粒的構建 采用聚合酶鏈反應chainreaction，PCR)方法擴增出 MLCKcDNA 片段，插入質粒 pBKrsv中，構建成 pBKrsv-MLCK 重組質粒 2.酶切、構建、片段的純化和連接 按Maniatis等方法進行。 3.重組質粒的轉化 轉化采用“熱休克”法。 4.重組質粒的提取 挑取陽性克隆，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用堿裂解法提取重組質粒。 5.定量 取5LDNA溶液用4.5l去離子水稀釋，用紫外分光光度計比色，

5、讀取AZ60和AZ80吸光度值，計算出AZ60/AZ80比值，按下列公式計算質粒DNA濃度,本實驗中質粒DNA濃度為1.0g/L。 質粒 DNA 濃度(g/L)=AZ60X稀釋度/Z0=AZ60X5,6.重組質粒的限制性核酸內(nèi)切酶酶切 取0.5ml離心管15只，分別加入質粒 2l(2g)，依 次 加 入 限 制性內(nèi) 切 酶 Acc I、Apal I、Ava H、Bgl I、BglH、Nco I、OxanI、Puv H、PpUM I、SalI、Ssp I、SstI、Xba I、Hind皿、EcoR I各0.5微升及相 應的 NEBuffer2L、BSAL、去離子水 13.5L、 混勻、點動離心，

6、37 水浴孵育2小時。 7、配置1.5的瓊脂糖凝膠 稱取瓊脂糖0.6g,加入 1XTAE 緩 沖 液 40 ml置 微 波 爐 中,中 火120s，熔化后冷卻至60，加入3L10g/l溴化乙錠，混勻，倒入插好梳子的模具中，凝固后放入電泳槽中。電泳槽中加入1TAE緩沖液。 8、電泳 取酶切產(chǎn)物8l與DNA上樣緩沖液2l混勻，進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下可觀察到橘紅色DNA條帶，結果如圖,Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit.,結果 重組質粒pBKrsv-MLCK 全長7378bp，通過 DNAstar軟件分析獲得各酶酶

7、切位點的信息，選擇在插入片段中單獨存在和在插入片段與質粒序列中均含有的限制性內(nèi)切酶酶切位點，計算酶切后片段大小的理論值經(jīng)各種限制性內(nèi)切酶酶切后，獲得不同大小的片段，經(jīng)電泳分析與理論設計完全一致。,結果分析 限制性內(nèi)切酶酶譜分析往往用于對構建的重組質粒進行初分析所獲得的信息將有助于確定構建是否成功及其插入片段的方向(orientation)l在選擇限制性內(nèi)切酶時,應選擇在插入片段中單獨存在和在插入片段與質粒序列中均含有的限制性內(nèi)切酶酶切位點,這樣可保證酶切片段大小能滿足進一步分析的需要。 在進行限制性內(nèi)切酶實驗時首先應進行 DNA的定量，1U 酶的限制性內(nèi)切酶活性指在一定時間內(nèi)(60min)適當

8、溫度下和建議使用的緩沖液中,在50l反應體系中,將1g底物 DNA 完全消化所需要的酶量l單位活性依所用底物的不同而不同,使用其他底物時,應根據(jù)情況確定所用酶量l根據(jù)本實驗室的經(jīng)驗,1g底物 DNA 加入 5 U 的限制性內(nèi)切酶在2h時間內(nèi)可以酶切完全，通常延長消化。,實驗中可能出現(xiàn)的問題及其討論,解決方法 1.標準底物檢測酶活性 2.將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA 3.檢查反應系統(tǒng)是否最佳 4.換用對DNA甲基化不敏感的同類酶酶解，重新將質粒DNA轉化至dcm-,dam-基因型的細菌菌株 5.換用不同切割非甲基化位點的同類酶消化DNA，重新將質粒轉至dcm+,dam+菌株中擴增 6.將DN

9、A底物與DNA混勻進行切割驗證 7.換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進行驗證,一.如果DNA完全沒有被內(nèi)切酶切割？,1.內(nèi)切酶失活 2.DNA不純，含有SDS，酚，EDAT等內(nèi)切酶抑制因子 3.條件不適（試劑、溫度） 4.DNA酶切位點上的堿基被甲基化 5.DNA酶切位點沒有甲基化(如Dpn1) 6.DNA位點上存在其它修飾 7.DNA不存在該酶識別順序,解決方法,二.如果DNA切割不完全？,1.內(nèi)切酶活性下降 2.內(nèi)切酶稀釋方法不正確 3.DNA不純，反應條件不佳 4.內(nèi)切酶識別的DNA位點上的堿基被甲基化或存在其它修飾 5.部分DNA溶液粘在管壁上 6.內(nèi)切酶溶液粘度大，取樣不準 7.酶

10、切后DNA粘性末端退火 8.由于反應溶液、溫度使內(nèi)切酶變性 9.過度稀釋使酶活性降低 10.反應條件不適 11.識別位點兩側插入了可影響酶切效率的核酸順序,1.用5-10倍量過量消化 2.用酶貯藏液或反應緩沖液稀釋酶 3.同上 4.同上 5.反應前離心數(shù)秒 6.將內(nèi)切酶稀釋，增大取樣體積 7.電泳前將樣品置65保溫5-10分鐘，取出后置冰浴驟冷 8.使用標準反應緩沖液及溫度 9.適當稀釋酶液，反應液稀釋的酶不能貯藏 10.使用最佳反應體系 11.加大酶量5-10倍,1.用DNA作底物檢查酶切結果 2.電泳檢查DNA，換用其它酶切，純化DNA片段,三.如果DNA片段數(shù)目多于理論值？,1.其它內(nèi)切

11、酶污染 2.底物中含其它DNA雜質,解決方法,限制性核酸內(nèi)切酶的應用,用于DNA基因組物理圖譜的組建,基因的定位和基因分離,DNA分子堿基序列分析,比較相關的DNA分子和遺傳工程,將水稻葉綠體的DNA，用EcoR1限制性核酸內(nèi)切酶消化后，放入含有溴化乙錠的低熔點（LMP）的1%瓊脂糖凝膠中做電泳分離。從LMP中分離出分子大小為1.8-2.5kb之間的DNA片段，再與同樣經(jīng)過EcoR1限制性核制性內(nèi)切酶切割并用堿性磷酸酶做了脫磷酸化處理的pBR322質粒連接，然后將混合物轉移到大腸桿菌5346菌株，培養(yǎng)在氨芐青霉素選擇板上，形成Ampr轉化子菌落群體。這樣就構成了由EcoR 限制性核酸內(nèi)切酶切割的水稻DNA基因組庫。用Ampr轉化子菌落與32P放射性標記的psbA DNA探針做菌落雜交，可以分離出其中的陽性克隆體。從這些陽性克隆體中分離出來的重組體質粒DNA，經(jīng)進一步的分析，就能測出水稻葉綠體基因psbA的序列。,應