課件：0409蛋白質1-1-2-1(1).ppt

第一章 蛋白質化學,蛋白質是許多不同的-氨基酸按一定的序列通過酰胺鍵（蛋白質化學中專稱為肽鍵）縮合而成的，具有較穩(wěn)定的構象并具有一定生物功能的生物大分子,Protein,第一節(jié) 蛋白質的元素組成,N含量在各種蛋白質中比較接近 15%18% ，平均為16%。 每1g 氮相當于 6.25g 的蛋白質,蛋白質平均含N量為16,這是凱氏定氮法測定蛋白質含量的理論依據(jù)： 粗蛋白質含量蛋白質含N量6.25,方法：常用6 mol/L的鹽酸或4 mol/L的硫 酸，回流煮沸時間約 20 h。 優(yōu)點：不引起消旋作用，得到的是L-氨基酸。 缺點：色氨酸被沸酸完全破壞；含有羥基的氨 基酸（絲氨酸、蘇氨酸）有一小部分 被分解；天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基 被水解成了羧基。,第二節(jié) 蛋白質的氨基酸組成,1. 酸水解,一、蛋白質的水解,2. 堿水解,方法：一般用5 mol/L氫氧化鈉煮沸1020 h。 優(yōu)點：色氨酸在水解中不受破壞。 缺點：多數(shù)氨基酸受到不同程度的破壞，產生 消旋現(xiàn)象，得到的是D-和L-氨基酸的混 合物。此外，引起精氨酸脫氨（生成鳥 氨酸和尿素）。,3. 酶水解,方法：用于蛋白質肽鏈斷裂的蛋白水解酶或稱 蛋白酶（proteinase）已有十多種，常用 的有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（或稱糜 蛋白酶）及胃蛋白酶等。 優(yōu)點：不產生消旋作用，也不破壞氨基酸。水解 位點特異，用于一級結構分析，肽譜 缺點：使用一種酶往往水解不徹底，需幾種酶協(xié)同作用才能使蛋白質完全水解。該法主要用于部分水解。,二、氨基酸的功能：,1. 組成蛋白質 2. 一些aa及其衍生物充當化學信號分子 -amino butyric acid (-氨基丁酸)、Serotonic(5-羥色胺，血清緊張素)、melatonin(褪黑激素，N-乙酰-甲氧基色胺)，都是神經遞質，后二者是色氨酸衍生物(神經遞質是一個神經細胞產生的影響第二個神經細胞或肌肉細胞功能的物質)。 Thyroxine(甲狀腺素，動物甲狀腺thyroid gland產生的Tyr衍生物)和吲哚乙酸(植物中的Trp衍生物)都是激素(激素就是一個細胞產生的調節(jié)其它細胞的功能的化學信號分子)。,3. 氨基酸是許多含N分子的前體物 核苷酸和核酸的含氮堿基、血紅素、葉綠素的合成都需要aa 4. 一些基本氨基酸和非基本aa是代謝中間物 精氨酸、Citrulline(瓜氨酸)、Ornithine(鳥氨酸)是尿素循不(Urea cycle)的中間物，含氮廢物在脊椎動物肝臟中合成尿素是排除它們的一種重要機制。,三、氨基酸的結構與分類 1809年發(fā)現(xiàn)Asp，1938年發(fā)Thr，目前已發(fā)現(xiàn)180多種。但是組成蛋白質的aa常見的有20種，稱為基本氨基酸（編碼的蛋白質氨基酸），還有一些稱為稀有氨基酸，是多肽合成后由基本aa經酶促修飾而來。此外還有存在于生物體內但不組成蛋白質的非蛋白質氨基酸(約150種)。 （一）編碼的蛋白質氨基酸（20種） 也稱基本氨基酸或標準氨基酸，有對應的遺傳密碼。,-氨基酸的一般結構 氨基在-位，為L-構型.,除脯氨酸外，均為-氨基酸 除甘氨酸外，均為手性氨基酸,氨基酸的分類,1. 按R基的化學結構分類 可以分為三類：脂肪族、芳香族和雜環(huán)族 脂肪族氨基酸 含一氨基一羧基的中性氨基酸,甘氨酸 Gly, G,丙氨酸 Ala, A,纈氨酸 Val, V,亮氨酸 Lue, L,異亮氨酸 Ile, I,R基均為中性烷基（Gly為H），R基對分子酸堿性影響很小，它們幾乎有相同的等電點。（6 .00.03） Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。 從Gly至Ile，R基團疏水性增加，Ile 是這20 種a.a 中脂溶性最強的之一（除Phe 2.5、Trp3.4 、Tyr 2.3以外）。,絲氨酸 （Ser,S）,蘇氨酸 （Thr,T）,半胱氨酸 （Cys,C）,甲硫氨酸 （Met,M）,含羥基或硫脂肪族氨基酸,含羥基的有兩種：Ser和Thr Ser的-CH2 OH基（pKa=15），在生理條件下不解離，但它是一個極性基團，能與其它基團形成氫鍵，具有重要的生理意義。在大多數(shù)酶的活性中心都發(fā)現(xiàn)有Ser殘基存在。 Thr 中的-OH是仲醇，具有親水性，但此-OH形成氫鍵的能力較弱，因此，在蛋白質活性中心中很少出現(xiàn)。 Ser和Thr的-OH往往與糖鏈相連，形成糖蛋白。 含硫的兩種：Cys、Met Cys中R含巰基（-SH），Cys 具有兩個重要性質： （1）在較高pH值條件，巰基離解。 （2）兩個Cys的巰基氧化生成二硫鍵，生成胱氨酸 ( CysssCys),二硫鍵在蛋白質的結構中具有重要意義。 Cys還常常出現(xiàn)在酶的活性中心。 Met的R中含有甲硫基（-SCH3），硫原子有親核性，易發(fā)生極化，因此，Met是一種重要的甲基供體。 Cys與結石 在細胞外液如血液中，Cys以胱氨酸(Cystine)氧化形式存在，胱氨酸的溶解性最差。 胱氨酸尿(Cystinuria)是一種遺傳病，由于胱氨酸的跨膜運輸缺陷導致大量的胱氨酸排泄到尿中。胱氨酸在腎(Kidney)、輸尿管(ureter)、膀胱(urinary bladder)中結晶形成結石(Calculus, calculi)，結石會導致疼痛、發(fā)炎甚至尿血。 大量服用青霉胺(Penicillcemine)能降低腎中胱氨的含量，因為青霉胺與半胱氨酸形成的化合物比胱氨酸易溶解。,酸性氨基酸及酰胺,天冬氨酸 （Asp,D）,谷氨酸 （Glu,E）,天冬酰胺 （Asn,N）,谷氨酰胺 （Gln,Q）,Asp、Glu，一般稱酸性氨基酸 Asp側鏈羧基pKa（-COOH）為3.86，Glu側鏈羧基pKa（-COOH）為4.25 它們是在生理條件下帶有負電荷的僅有的兩個 氨基酸。 Asn、Gln 酰胺基中氨基易發(fā)生氨基轉移反應，轉氨基反應在生物合成和代謝中有重要意義,堿性氨基酸,賴氨酸 （Lys,K）,精氨酸 （Arg,R）,Lys的R側鏈上含有一個氨基，側鏈氨基的pKa為10.53。生理條件下，Lys側鏈帶有一個正電荷（NH3+），同時它的側鏈有4個C的直鏈，柔性較大，使側鏈的氨基反應活性增大。（如肽聚糖的短肽間的連接） Arg是堿性最強的氨基酸，側鏈上的胍基是已知堿性最強的有機堿，pKa值為12.48，生理條件下完全質子化。 His含咪唑環(huán)，咪唑環(huán)的pKa在游離氨基酸中和在多肽鏈中不同，前者pKa為6.00，后者為7.35，它是20種氨基酸中側鏈pKa值最接近生理pH值的一種，在接近中性pH時，可離解平衡。它是在生理pH條件下唯一具有緩沖能力的氨基酸。 His含咪唑環(huán)，一側去質子化和另一側質子化同步進行，因而在酶的酸堿催化機制中起重要作用。,2、芳香族氨基酸,苯丙氨酸 （Phe,F）,酪氨酸 （Tyr,Y）,色氨酸 （Trg,W）,都具有共軛電子體系,易與其它缺電子體系或電子體系形成電荷轉移復合物( charge-transfer complex)或電子重疊復合物。在受體底物、或分子相互識別過程中具有重要作用。 這三種氨基酸在近紫外區(qū)有特殊吸收峰，蛋白質的紫外吸收主要來自這三種氨基酸，在280nm處，TrpTyrPhe。 Phe疏水性最強.。 酪氨酸的-OH磷酸化是一個十分普遍的調控機制，Tyr在較高pH值時，酚羥基離解。 Trp有復雜的共軛休系，比Phe和Tyr更易形成電荷轉移絡合物。,3、雜環(huán)氨基酸,組氨酸 （His,H）,脯氨酸 （Pro,P）,Pro，有時也把His、Trp歸入此類。 Pro是唯一的一種環(huán)狀結構的氨基酸，它的-亞氨基是環(huán)的一部分，因此具有特殊的剛性結構。它在蛋白質空間結構中具有極重要的作用，一般出現(xiàn)在兩段-螺旋之間的轉角處，Pro殘基所在的位置必然發(fā)生骨架方向的變化,2. 按R基的極性分類(能否與水形成氫鍵),20種基本氨基酸可以分成以下四組： 1、非極性氨基酸（八種） Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met、 Pro 這類氨基酸的R基都是疏水性的，在維持蛋白質的三維結構中起著重要作用。,2、極性不帶電荷的氨基酸（七種） 6種，絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。這類氨基酸的側鏈都能與水形成氫鍵，因此很容易溶于水。 酪氨酸的-OH磷酸化是一個十分普遍的調控機制，Ser和Thr的-OH往往與糖鏈相連，Asn和Gln的-NH2很容易形成氫鍵，因此能增加蛋白質的穩(wěn)定性。,3、極性帶正電荷的氨基酸,三種堿性氨基酸：Lys、Arg、His 在 pH7 時帶正電荷。 當膠原蛋白中的Lys側鏈氧化時能形成很強的分子間(內)交聯(lián)。Arg的胍基堿性很強，與NaOH相當。 His是一個弱堿，在 pH6.0 時，His 的 R 基 50% 以上質子化，但 pH7.0 時，質子化的分子不到10% His 是 R 基的pK值在7附近的唯一的氨基酸。 是天然的緩沖劑，它往往存在于許多酶的活性中心。,4、極性帶負電荷的氨基酸 兩種酸性氨基酸：Asp、Glu。在pH67時，谷氨酸和天冬氨酸的第二個羧基解離，因此，帶負電荷。 酶的活性中心：His、Ser、Cys 非極性aa一般位于蛋白質的疏水核心，帶電荷的aa和極性aa位于表面。,三個有特性的氨基酸,一是脯氨酸（Pro），因為它是一個環(huán)狀的亞 氨基酸。它的氨基和其它氨基酸的羧基形成的 肽鍵有明顯的特點，較易變成順式肽鍵。,二是甘氨酸（Gly），它是唯一的在碳原子上只有兩個氫原子，沒有側鏈的氨基酸。為此它既不能和其它殘基的側鏈相互作用，也不產生任何位阻現(xiàn)象，進而在蛋白質的立體結構形成中有其特定的作用。 第三個是半胱氨酸(Cys)。它的個性不僅表現(xiàn)在其側鏈有一定的大小和具有高度的化學反應活性，還在于兩個 Cys 能形成穩(wěn)定的帶有二硫（橋）鍵的胱氨酸。二硫鍵不僅可以在肽鏈內，也可以在肽鏈間存在。更有甚者，同樣的一對二硫鍵能具有不同的空間取向。,（浙江大學2006年題）按氨基酸R基的極性性質將其分為哪幾類？請寫出各類的性質，氨基酸的名稱以及三字符號和單子符號 解析：主要考察編碼蛋白質的20種氨基酸的結構和極性及單字和三字符號,二、非編碼的蛋白質氨基酸 也稱修飾氨基酸，是在蛋白質合成后，由基本氨基酸修飾而來。 Prothrombin(凝血酶原)中含有-羧基谷氨酸，能結合Ca2+。 結締組織中最豐富的蛋白質膠原蛋白含有大量4-羥脯氨酸和5-羥賴氨酸。 （1）4-羥脯氨酸 （2）5-羥賴氨酸 這兩種氨基酸主要存在于結締組織的纖維狀蛋白（如膠原蛋白）中。 （3）6-N-甲基賴氨酸（存在于肌球蛋白中） (4)-羧基谷氨酸 存在于凝血酶原及某些具有結合Ca2+離子功能的蛋白質中。 （5）Tyr的衍生物： 3.5 -二碘酪氨酸、甲狀腺素 （甲狀腺蛋白中） （6）鎖鏈素由4個Lys組成（彈性蛋白中）。,（三）非蛋白質氨基酸 除參與蛋白質組成的20多種氨基酸外，生物體內存在大量的氨基酸中間代謝產物，它們不是蛋白質的結構單元，但在生物體內具有很多生物學功能，如尿素循環(huán)中的L-瓜氨酸和L-鳥氨酸。 （1）L-型 氨基酸的衍生物 L-瓜氨酸 L-鳥氨酸 （2）D-型氨基酸 D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短桿菌肽S） （3）-、-、-氨基酸 -Ala（泛素的前體）、-氨基丁酸（神經遞質）。, -丙氨酸是遍多酸（泛酸）（一種維生素）的前體成分 氨基丁酸是傳遞神經沖動的化學介質 L-瓜氨酸、L-鳥氨酸是尿素循環(huán)的中間體,甜菜堿,肌氨酸,鳥氨酸,胍氨酸,四、氨基酸的重要理化性質,（一）一般物理性質 -氨基酸為無色晶體，熔點極高，一般在200以上。有的無味、有的味甜、有的味苦、谷氨酸的單鈉鹽有鮮味，是味精的主要成分。 各種氨基酸在水中的溶解度差別很大，除胱氨酸和酪氨酸外一般都能溶于水，并能溶解于稀酸或稀堿中，但不能溶解于有機溶劑。通常酒精能把氨基酸從其溶液中沉淀析出。 脯氨酸和羥脯氨酸能溶于乙醇或乙醚中。,（二）氨基酸的光吸收,構成蛋白質的20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠紫外區(qū)(220nm)均有光吸收。 在近紫外區(qū)(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力，因為它們含有苯環(huán)共軛雙鍵系統(tǒng)。 Tyr：max275nm，275=1.4x103; Phe：max257nm，257=2.0x102; Trp：max280nm，280=5.6x103 蛋白質由于含有Tyr、Phe、Trp(尤其Tyr和Trp)，也有紫外光吸收能力，一般最大吸收在280nm處。,分光光度計定量分析依據(jù)：,Lambert-Beer定律 A=Log Io/I = C L,所謂兩性離子是指在同一個氨基酸分子上帶有能放出質子的NH3+正離子和能接受質子的COO- 負離子。 氨基酸是兩性電解質。,（三）、氨基酸的酸堿性質,氨基酸在晶體和水溶液中主要以兼性離子形式存在 -氨基酸都含有-COOH和-NH2，都是不揮發(fā)的結晶固體，熔點200-350，不溶于非極性溶劑，而易溶于水，這些性質與典型的羧酸（R-COOH）或胺（R-NH2）明顯不同。 三個現(xiàn)象： 晶體熔點高離子晶格，不是分子晶格。 不溶于非極性溶劑極性分子 介電常數(shù)高（氨基酸使水的介電常數(shù)增高，而乙醇、丙酮使水的介電常數(shù)降低。）水溶液中的氨基酸是極性分子。,原因：-羧基pK1在2.0左右，當pH3.5，-羧基以-COO-形式存在。-氨基pK2在9.4左右，當pH8.0時，-氨基以-NH3+形式存在。在pH3.5-8.0時，帶有相反電荷，因此氨基酸在水溶液中是以兩性離子離子形式存在。 Gly熔點232比相應的乙酸（16.5）、乙胺（80.5）高，可推測氨基酸在晶體狀態(tài)也是以兩性離子形式存在。,氨基酸的兩性解離性質及等電點,pH = pI 凈電荷=0,pH pI 凈電荷為正,pH pI 凈電荷為負,(pK1),(pK2),在一定的pH條件下，氨基酸分子中所帶的正電荷數(shù)和負電荷數(shù)相等，即凈電荷為零，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值稱為該種氨基酸的等電點(isoelectric point，pI)。 即氨基酸的等電點是它呈現(xiàn)電中性時所處環(huán)境的pH值。,1、概念,氨基酸的解離常數(shù)可用測定滴定曲線的實驗方法求得,在pH2.34和pH9.60處，Gly具有緩沖能力。 滴定開始時，溶液中主要是Gly+。 起點：100% Gly+ 凈電荷：+1 第一拐點： 50%Gly+ ，50%Gly 平均凈電荷：+0.5 第二拐點： 100%Gly 凈電荷：0 等電點pI 第三拐點： 50%Gly ， 50%Gly- 平均凈電荷：-0.5 終點： 100% Gly- 凈電荷：-1 第一拐點：pH=pK+lgGly/Gly+，pH=pK1=2.34 第二拐點：100%Gly，凈電荷為0，此時的pH值稱氨基酸的等電點pI。 第三拐點：pH=pK2+lgGly-/Gly=pK2=9.6,Handerson-Hasselbalch方程: pH=pKa+log 質子受體/質子供體 計算緩沖溶液pH的主要公式 緩沖容量與緩沖對的濃度有關, 越濃緩沖能力越大 與pH及pK有關, pH=pK時緩沖能力最大 2. 計算緩沖對的濃度比值 計算在任一pH條件下一種酸或堿(或氨基酸) 離子化的百分數(shù),2、氨基酸等電點的計算,可見，氨基酸的pI值等于該氨基酸的兩性離子兩側的基團pK值之和的二分之一。,A. 等電點時，氨基酸的溶解度最小，容易沉淀。 利用該性質可分離制備某些氨基酸。例如谷氨酸的生產，即將微生物發(fā)酵液的pH值調至3.22（谷氨酸的等電點）而使谷氨酸沉淀析出。 B. 利用各種氨基酸的等電點不同，可通過電泳法、離子交換法等在實驗室或工業(yè)生產上進行混合氨基酸的分離或制備。 氨基酸的等電點可由其分子上解離基團的解離常數(shù)來確定,3、應用,2019/8/27,45,可編輯,1. 某氨基酸溶于pH7的水中，所得氨基酸溶液的pH為8，問此氨基酸的pI是大于8、等于8還是小于8？ 解析：主要從氨基酸的解離特點考慮，先確定其兩性離子狀態(tài)（即等電點狀態(tài)），然后分析氨基酸溶液變?yōu)?時是從水中吸收了質子還是釋放了質子。 解答：氨基酸晶體主要以兩性離子形式存在，溶于pH7的水中，溶液的pH從7升為8，說明氨基酸在溶解的過程中從水中吸收了質子。溶液中有如下平衡： AA + H2O AA+ + OH- 要使AA+ 所帶電荷為零，必須加堿，這會使pH8， 故氨基酸的pI 8。,2. 計算下列溶液的pH值： （1）0.1 mol/L Gly 0.05 mol/L NaOH的等體積混合液 (2) 0.1 mol/L Gly 0.05 mol/L HCl的等體積混合液 解答： （1）Gly 和 NaOH的反應為：,0.1 mol/L Gly 0.05 mol/L NaOH的等體積混合后 Gly - = OH-=0.05/2=0.025 (mol/L) Gly = (0.1-0.05)/2 = 0.025 (mol/L) 此時溶液存在如下平衡：,根據(jù)公式pH= pKa + lg 質子受體/質子供體 混合后溶液的pH值為 pH=pKa2 +lg(Gly- /Gly )=9.6+lg(0.025/0.025)=9.6,（2）Gly 和HCl的反應為：,0.1 mol/L Gly 0.05 mol/L HCl的等體積混合后 Gly+ = H+ = 0.05/2=0.025 (mol/L) Gly = (0.1-0.05)/2 = 0.025 (mol/L) 此時溶液存在如下平衡：,根據(jù)公式pH= pKa + lg 質子受體/質子供體 混合后溶液的pH值為 pH=pKa1 +lg (Gly / Gly+ ) = 2.34 + lg(0.025/0.025)=2.34,3. 制備1L pH 3.2, 0.1 mol/L 甘氨酸緩沖液， 需0.1 mol/L 甘氨酸鹽酸鹽(Cl- +H3N-CH2-COOH)和0.1 mol/L 甘氨酸(+H3N-CH2-COO-) 各多少？ 解答：甘氨酸鹽酸鹽(Cl- +H3N-CH2-COOH) 實際上為二元酸，它的解離式為,pH=pKa1 + lg (Gly / Gly+ ), 3.2=2.34 + lg (Gly / Gly+ ) lg (Gly / Gly+ ) = 3.2 - 2.34 = 0.86, Gly / Gly+ =7.24 因為配制甘氨酸緩沖溶液所用的甘氨酸鹽酸鹽和甘氨酸的原始濃度相同，所以它們的濃度之比就是它們所用的體積之比， V Gly / V Gly+ = 7.24 已知緩沖溶液的總體積為1 L, V Gly / (1-V Gly ）= 7.24， V Gly = 0.879 (L), V Gly+ = 0.121 (L),（四）氨基酸的化學性質,氨基酸是離子化合物，但在溶液狀態(tài)時，存在 下列平衡：,化學反應中可用左邊的結構式表示氨基酸。,氨基酸分子的-氨基、-羧基能參加反應，有的側鏈R基團也能參加反應,1. -NH2參加的反應 A. ?；磻?酰化試劑：芐氧酰氯、叔丁氧甲酰氯、苯二甲酸酐、對-甲苯磺酰氯。這些?；瘎┰诙嚯暮偷鞍踪|的人工合成中被用作氨基保護劑。 丹磺酰氯（DNS-Cl，5二甲基氨基萘-1-磺酰氯） DNSCl可用于多肽鏈NH2末端氨基酸的標記和微量氨基酸的定量測定。 N GlyAlaSerLeuPhe C N DNSGlyAlaSerLeuPhe C 水解 DNSGly、 Ala、 Ser、 Leu、 Phe DNS-氨基酸在紫外光激發(fā)后發(fā)黃色熒光。,（生物體內）在酶和ATP存在條件下，羧酸也可與氨基酸的氨基作用，形成?；a物。 苯甲酸與Gly的氨基的?；磻巧矬w內解毒作用的一個典型的例子。 苯甲酸是食品防腐劑，在生物體內轉變成N-苯甲酰-Gly后，可經尿排出。,B. 烷基化反應 -氨基中的氮是一個親核中心，能發(fā)生親核取代反應。 Sanger反應（2,4一二硝基氟苯，DNFB或FDNB） 二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸），黃色，層析法鑒定，被Sanger用來測定多肽的NH2末端氨基酸。 Edman反應（苯異硫氰酸酯，PITC） 苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-氨基酸） 苯乙內酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸） PTH-氨基酸，無色，可以用層析法分離鑒定。被Edman用來鑒定多肽的NH2末端氨基酸,含硫氨基酸的烷基化反應 硫原子也是親核中心，可發(fā)生親核取代反應。 生物體內，最重要的甲基化試劑是S-腺苷甲硫氨酸（SAM），是由Met與ATP作用得到的S-烷基化產物。 在酶催化下，SAM可以使多種生物分子的氨基甲基化，如磷脂酰膽堿的生物合成。 S-腺嘌呤核苷-高半胱氨酸（比Cys多一個-CH2）,C. 形成西佛堿反應,西佛堿是以氨基酸為底物的某些酶促反應如轉氨基反應的中間物。,氨基酸的-氨基能與醛類化合物反應生成弱堿，即所謂西佛堿（Schiffs base）。,D.與甲醛的反應,氨基酸甲醛滴定法,判斷蛋白質水解或合成的進度,E. 與亞硝酸的反應,在標準條件下測定生成的N2體積，即可計算出氨基酸的量。,用途：范斯萊克（Van Slyke）法測定氨基氮的基礎。可用于氨基酸定量和蛋白質水解程度的測定。,F. 與熒光胺反應,熒光胺,熒光產物,熒光產物激發(fā)波長 x = 390 nm , 發(fā)射波長 M = 475 nm , 該反應非常靈敏（1ng），可根據(jù)熒光強度M測定氨基酸含量,G. 脫氨基反應,經相應的氨基酸氧化酶、轉氨酶催化的反應。,2、-羧基參加的反應 脫羧基反應: 是生成胺類的重要反應,成鹽、成酯 分別與堿、醇作用, 可用于羧基的保護 成酰氯的反應（使羧基活化） 氨基被保護后，羧基可與二氯亞砜或五氯化磷反應，生成酰氯。 此反應使氨基酸的羧基活化，易與另一個氨基酸的氨基結合，在多肽的人工合成中常用。,3、 -氨基和-羧基參加的反應,（1）與茚三酮的反應 常用于氨基酸的定性或定量檢測,脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應產生黃色物質，其余所有的-氨基酸與茚三酮反應均產生藍紫色物質。,（2）成肽反應,這是多肽和蛋白質生物合成的基本反應。,（1）Tyr的酚基 在3和5 位上可發(fā)生親電取代反應，如碘化、硝化。 Pauly反應可用于檢測Tyr,Tyr的酚基可以與重氮化合物，如重氮苯磺酸，結合生成橘黃色化合物,橘黃色,4. 側鏈R基參加的反應,（2）His的咪唑基與重氮鹽（重氮苯磺酸）的反應,棕紅色,簡述組氨酸的作用 解答：（1）His的咪唑基pK值在氨基酸和多肽鏈中分別為6.00和7.35，后者接近生理條件。故在生理條件下，咪唑基既可以作為質子受體，又可以作為質子供體，在pH7 附近具有明顯的緩沖能力。血紅蛋白由于含有較多的His 殘基，使其在pH7附近有明顯的緩沖能力。 （2） His的咪唑基供出質子或接受質子的速度十分迅速，因而在很多酶的活性中心均有His殘基參與 （3）組氨酸中的咪唑基能夠發(fā)生多種化學反應?？梢耘cATP發(fā)生磷酰化反應，形成磷酸組氨酸，從而使酶活化。 （4）組氨酸的咪唑基也能發(fā)生烷基化反應。生成烷基咪唑衍生物，并引起酶活性的降低或喪失,(3) Cys巰基（-SH）參加的反應性質很活潑,作用：這些反應可用于巰基的保護。,A. 在弱堿性條件下，與鹵代烴（如芐氯、碘乙酰胺等）反應，生成穩(wěn)定的烴基衍生物。,作用：與金屬離子的螯合性質可用于體內解毒。,B. 與各種金屬離子，如對羥基汞苯甲酸，形成穩(wěn)定程度不同的絡合物,作用：氧化還原反應可使蛋白質分子中二硫鍵形成或 斷裂。,胱氨酸,+2H,- 2H,C. 很容易被氧化形成二硫鍵（SS）,次磺酸sulfenic,亞磺酸sulfinic,磺酸sulfonic,S-nitrosothiol,S-nitrothiol,（4）羥基參加的反應,作用：可用于修飾蛋白質（酶）。,二異丙基氟磷酸,Ser 和 Thr 的羥基能夠與酸作用形成酯。在蛋白質分子中，Ser 常與磷酸結合。 SersSer 是大多數(shù)蛋白水解酶活性中心的主要組分，多種?；噭┠芘c酶活性中心的 Ser 羥基作用，導致酶的失活。,Ser,（一）電泳分離 舉例：Glu、Leu 、His 、Lys，4種混合樣，在pH6.0時，泳動方向及相對速度。 Glu Leu His Lys pI 3.22 5.98 7.59 9.74,五、 氨基酸的分析分離,（二）分配層析一般原理 層析即色層分析又稱色譜(chromatograph) 固定相(stationary phase) 流動相(mobile phase) 1891年Nerst提出分配定律即： 當一種溶質在兩種互不相溶的溶劑中分配時，在一定溫度下達到平衡后，溶質在兩相中的濃度比為一常數(shù)稱為分配系數(shù)(Kd),有效分配系數(shù)Keff,Keff =,某一物質在動相中的總量,某一物質在靜相中的總量,上述逆流分溶的結果可用曲線表示,逆流分溶曲線,管號,各管中溶質的總含量,分溶曲線與轉移次數(shù)的關系,溶劑系統(tǒng)體積,相對濃度,(二）分配柱層析,可以同檢測器、記錄儀、餾分收集器、輸液泵構成層析系統(tǒng)。,(三)紙層析,Rf主要與R基的極性有關，溶劑的pH可影響R基的極性，氨基酸與濾紙的吸附作用也影響Rf。,紙層析中的Rf值,Rf=,溶劑前沿,氨基酸顯色點,濾紙,原點,2. 以正丁醇：乙酸：水體系為溶劑（p