2 O2 處理大塊牛松質骨后成分分析.doc

2O2處理大塊牛松質骨后成分分析作者：羅卓荊胡蘊玉劉智廣【關鍵詞】骨移植關鍵詞:骨移植；氨基酸分析；移植，異種摘要:目的研究大塊牛松質骨（MBCB）處理后的各種成分及高濃度H2O2消除異種骨抗原性的機制.方法采用干燥失重法及殘渣法檢測經過系統(tǒng)去抗原處理后的大塊異種骨的有機、無機質及水份含量；將25塊大塊新鮮牛松質骨均分為5組，分別用高濃度H2O2浸泡0，24，48，72和96h，采用氨基酸分析方法研究不同H2O2處理時間的骨塊中羥脯氨酸、脯氨酸含量.結果經處理后，MBCB為色白，并呈現(xiàn)出多孔樣結構，掃描電鏡觀察，松質骨呈清晰的多孔結構，孔壁光滑；5組檢測樣品中羥脯氨酸及脯氨酸的含量隨著H2O2處理時間的延長均有同步下降的趨勢，但各組間無顯著性差異（P>；0.05）；5組檢測樣品中18種氨基酸含量及氨基酸總量隨著H2O2處理時間的延長亦有同步下降的趨勢，僅0h與96h組間18種氨基酸以及總氨基酸含量有顯著性差異（P<；0.05），其余各組間無顯著性差異（P>；0.05）；5組檢測樣品中羥脯氨酸及脯氨酸在總氨基酸總量所占比例隨著H2O2處理時間的延長無明顯變化，各組間無顯著性差異（P>；0.05）.結論大塊異種骨經系統(tǒng)去抗原處理后，保持了一定的有機及無機質比例，既具有良好的力學特性又消除了其抗原性，提示高氧化劑引起蛋白質變性是消除大塊異種骨抗原性的主要原因.Keywords:bonetransplantation；aminoacidanalysis；com-ponent，heterologousAbstract:AIMToanalysethecomponentsofantigen-elimi-natedmassivebovinecancellousbone（MBCB）andtostudythemechanismofhighconcnH2O2eliminatingtheantigenici-tyofxenogenicbone.METHODSDry-weightlostmethodwasappliedtomeasuretheorganic，mineral，andwatercom-ponentsinMBCB；25massivefleshbovinecancellousboneblocksweredistributedinto5groups，whichweredippedin300mL・；L-1concnH2O2for0，24，48，72，96h.Thequan-titiesofhydroxyprolineandprolineinthefivegroupsweremeasuredbyaminoacidanalysis.RESULTSAftertheanti-geneliminatingprogram，MBCBoccurredaswhitecolourandporousstructure.SEMshowedthewallofbonetrabeculainthecenterpartofMBCBwasquiteclear.ThequantitiesofhydroxyprolineandprolinedecreasedalittlewiththetimetreatedinhighconcnH2O2inthefivegroups，butnodiffer-encesbetweenthefivegroupswerefound；thesamedecreas-ingtendencywasfoundtothequantitiesof18aminoacidsoftheboneblocksinthefivegroups；differencewasonlyfoundbetween0hand96hgroup（P<；0.05）.Thepercentofhy-droxyprolineandprolineinaminoacidswasnotfoundanydifferenceinthefivegroups（P>；0.05）.CONCLUSIONTheMBCBmaycontainreasonablerateoforganicandminer-almaterial，whichisbeneficialtokeepingthemechanicprop-ertyofMBCBafteritsantigen-eliminatingprogram.Denatu-ralizationofproteinintheconditionofoxidationofhighcon-cnH2O2wouldbethemajormechanismtoeliminatetheanti-genicityofmassivexenogenicbone.0引言在以往顆粒型異種松質骨處理與應用的基礎上1，為了更廣泛地應用大塊異種骨修復四肢大節(jié)段骨缺損，我們對高濃度H2O2去抗原處理異種骨的機制進行研究，同時對異種骨經去抗原處理后的成分進行分析，為異種骨塊的臨床應用提供實驗基礎.1材料和方法1.1材料新鮮牛肱骨上端松質骨.1.2方法大塊去抗原牛松質骨（antigen-extractedmassivebovinecancellousbone，MBCB）選取新鮮牛肱骨上端松質骨，截取15mm20mm30mm形狀規(guī)則長方體骨塊，用50壓力水反復沖洗，瀝干；50下11氯仿甲醇脫脂24h；50下300mL・；L-1H2O2浸泡24h；重復步驟2次，脫脂共24h3，H2O2處理24h3；雙蒸水透析12h2；0.3mol・；L-1的HCl內脫鈣處理5min，雙蒸水反復沖洗至pH6.0；冷凍干燥，密封包裝.1.2.1MBCB的掃描電鏡SEM觀察4mm大小的電鏡樣品分別取材于新鮮牛松質骨及MBCB，多聚甲醛固定，鋨酸及乙晴處理，真空鍍膜，掃描電鏡觀察.1.2.2MBCB的成分檢測參照中華人民共和國藥典1995版，干燥失重法及殘渣法.檢測步驟:取相同小坩鍋4個，置80烘烤24h，蒸發(fā)坩鍋內水分；選取密封的MBCB凍干骨4塊，編號A，B，C，D，分別準確稱質量（m），再分別放入坩鍋內稱質量（m1）；將MBCB及坩鍋同置于110烘烤24h，干燥塔內涼至室溫后稱質量（m2）；將塊型牛松質骨載體及坩鍋再置于馬佛電阻爐內，800灼熾7h，干燥塔內涼至室溫后準確稱質量（m3）；計算方法含水量mwater=m1-m2，含有機質morganic=m2-m3，含無機質mmineral=m3-（m1-m）.1.2.3MBCB的氨基酸分析將25塊新鮮牛肱骨松質骨塊經水洗、脫脂后分為5組，各組5枚骨塊，分別置于50300mL・；L-1H2O2溶液中0，24，48，72和96h進行浸泡處理，將處理后的異種骨塊進行氨基酸檢測分析.將上述各組樣品均置于80下烘干24h，在干燥室內冷卻至室溫后準確稱取20mg，放于消化管中；加入6mol・；L-1HCl共3mL，立即旋緊管蓋，置110下酸水解22h；將酸水解液倒入蝶型坩鍋內，于100水浴揮發(fā)鹽酸，再加入少量蒸溜水，蒸干共3次；用適量pH2.2檸檬酸鈉緩沖液溶解，使其終濃度為干骨樣品20g・；L-1；12589g離心15min，取上清液備用，做羥脯氨酸、脯氨酸及氨基酸總量定量分析.羥脯氨酸、脯氨酸測定:Beckman121MB型氨基酸分析儀，分析程序為自編膠原特異性氨基酸分析程序2；填充樹脂為BeckmanAA10型，柱床10cm，pH2.20，配制pH3.0檸檬酸鈉緩沖液和茚三酮試劑3，600mol・；L-1羥脯氨酸、脯氨酸標準液（上海華美生物工程公司）用pH2.20緩沖液配制；柱溫46恒溫；上樣量50L；緩沖液流速10mL・；h-1，茚三酮流速5mL・；h-1；檢測波長440nm，數據處理系統(tǒng)為HP-3394A積分儀.骨樣品中羥脯氨酸、脯氨酸含量用下式計算1，4Cs=S樣品氨基酸標準液濃度樣品稀釋倍數氨基酸分子質量S標準1000Cs干骨羥脯氨酸或脯氨酸含量（mg・；g樣品標準液中羥脯氨酸或脯氨酸波峰面積；S標準樣品液中羥脯氨酸或脯氨酸波峰面積.采用方差分析方法處理實驗數據，比較H2O2不同浸泡處理時間的各組中羥脯氨酸、脯氨酸含量.氨基酸總量的測定:紫外/可見光分光光度計（BeckmanDU-60），氨基酸標準液（Beckman公司，內含18種氨基酸，每種氨基酸濃度為100mol・；L-1，氨基酸終濃度1800mol・；L-1），分別準確吸取各組骨水解液10L、氨基酸標準液20L、空白對照之雙蒸水20L，用雙蒸水補足定容至2mL，加入茚三酮試劑2mL，置100水浴5min，流水冷卻至室溫，測吸光度，檢測波長為570nm.在波長570nm條件下，骨樣品中羥脯氨酸及脯氨酸吸光度極低，故骨樣品中總氨基酸含量Cs總由18種氨基酸含量Cs18加上由440nm檢測的羥脯氨酸Cs羥脯及脯氨酸Cs脯含量組成.Cs18用以下公式計算Cs18=A樣品18種氨基酸標準液濃度稀釋倍數18種氨基酸平均分子質量A標準Cs18骨樣品中18種氨基酸含量（mg・；g-1）；A樣品樣品液中吸光度；A標準標準液中吸光度.氨基酸總量Cs總=Cs18+Cs羥脯+Cs脯2結果2.1MBCB的大體及SEM觀察MBCB經系列化學處理后，色白，并呈現(xiàn)出多孔樣結構，具有一定的韌性及堅硬度.新鮮牛松質骨掃描電鏡觀察，未顯示出多孔隙結構，孔隙被骨髓及油脂等充滿；MBCB掃描電鏡觀察，松質骨呈清晰的多孔結構，孔壁光滑（Fig1（略）.2.2MBCB成分檢測結果MBCB中水分、無機質、有機質質量分數見Tab1.w（水）=m水m=65.61392.0100%=4.7%；w（有機質）=m有m=666.71392.0100%=47.9%；w（無機質）=m無m=659.71392.0100%=47.4%.表1MBCB中水分、無機質、有機質質量分數（略）2.3H2O2處理異種骨的氨基酸分析5組檢測樣品中羥脯氨酸及脯氨酸的含量隨著H2O2處理時間延長均有同步下降的趨勢，但變化程度并不明顯，各組間無顯著性差異（P>；0.05，Tab2）.骨樣品中18種氨基酸及總氨基酸含量隨著H2O2處理時間的延長均有同步下降趨勢，但變化并不明顯，僅0h與96h組間18種氨基酸以及總氨基酸含量有顯著性差異（P<；0.05，Tab3），其余各組間無顯著性差異（P>；0.05）.5組檢測樣品中羥脯氨酸及脯氨酸在總氨基酸總量中所占比例隨著H2O2處理時間的延長無明顯變化，各組間無顯著性差異（P>；0.05，Tab4）.表2骨樣品中羥脯氨酸、脯氨酸質量分數（略）表3骨樣品中氨基酸質量分數表4氨基酸中羥脯氨酸、脯氨酸質量分數（略）3討論松質骨由骨小梁及骨小梁間的骨髓成分構成，骨髓內包含大量的各種血細胞以及血管、神經、脂肪等組織，骨髓將骨小梁間隙填充，在掃描電鏡下未能見到松質骨的多孔樣結構.異種骨抗原分布研究資料表明，骨中的主要抗原成分集中于骨細胞、成骨細胞、軟骨細胞以及骨髓細胞、血漿等5.在本實驗中，反復采用50壓力水沖洗，使松質骨中細胞低滲裂解，氯仿甲醇脫脂清除骨小梁間的大量脂肪組織，以高濃度H2O2浸泡處理，二者交替進行，結合離心處理，將牛松質骨內的脂肪、細胞及殘片均有效清除.處理后的牛松質骨在SEM觀察下顯示清晰的多孔結構，孔壁干凈、光滑，未見其他物質殘留，徹底清除異種骨中的主要抗原物質，為骨生長因子的復合及新骨的長入提供理想的微環(huán)境4.正常成熟骨中含水質量分數為20%25%、有機質40%和無機鹽60%，無機鹽決定骨的強度，而有機質決定骨的彈性和韌性.本實驗中凍干MBCB的成分檢測結果表明，MBCB的水分殘留質量分數低于5%，而膠原等有機質和無機骨礦各占47%左右，由于保持了合理的有機及無機質比例，故也保持MBCB一定的韌性和強度6.成熟骨的有機質中大約90%為膠原，其余為氨基多糖、其他蛋白質、肽類及脂類.骨基質中的膠原主要是型膠原，由兩條1肽鏈和一條2肽鏈相互擰成的三聯(lián)螺旋結構.肽鏈組成有以下兩個主要特點肽鏈的氨基酸排列順序中，每隔兩個其他氨基酸殘基就有一個甘氨酸；肽鏈中含有其他蛋白質中含量極少的羥脯氨酸與羥賴氨酸，脯氨酸及賴氨酸的含量也較多，羥脯氨酸與脯氨酸殘基是維持原膠原分子三聯(lián)螺旋構型的重要組成部分.在型膠原肽鏈的1000個氨基酸殘基中，甘氨酸約占330個，脯氨酸約占129個，羥脯氨酸約占96個，賴氨酸約占30個，羥賴氨酸約占4個.不同組織中的膠原所含羥脯氨酸及羥賴氨酸殘基差很大，因此，檢測骨基質中羥脯氨酸及脯氨酸含量，可特異地反應骨基質有機質中包括膠原蛋白在內的各種組成成分的變化.以往認為，高濃度H2O2處理異種骨，其消除抗原性的原理在于清除骨基質中抗原性較強的蛋白成分，即脫蛋白過程.我們發(fā)現(xiàn)，骨基質中的氨基酸總量隨著H2O2處理的時間延長并無明顯的降低，而羥脯氨酸及脯氨酸在氨基酸總量中所占比例也未發(fā)生明顯改變，沒有表現(xiàn)出大量去除蛋白的現(xiàn)象.回顧以往的研究結果，牛松質骨在H2O2浸漬時間越長，骨塊機械強度損失越嚴重6，以及H2O2處理時間越長，異種骨抗原性消除越徹底7，分析H2O2消除異種骨抗原性的機制可能在于強氧化