HBV感染培養(yǎng)人胎肝細(xì)胞后差異應(yīng)答基因的初步分離和鑒定.doc

HBV感染培養(yǎng)人胎肝細(xì)胞后差異應(yīng)答基因的初步分離和鑒定【摘要】目的：建立培養(yǎng)人胎肝細(xì)胞感染HBV后差異應(yīng)答基因的消減文庫(kù)，并從中克隆鑒定出新的應(yīng)答基因.方法：分別從HBV感染及未感染的胎肝細(xì)胞中提取總RNA，用SMARTPCR技術(shù)合成全長(zhǎng)雙鏈cDNA，經(jīng)Rsa酶切后將感染細(xì)胞的cDNA分為兩組，分別銜接兩個(gè)不同的接頭，再與未感染細(xì)胞的cDNA進(jìn)行兩輪抑制性雜交及兩輪抑制性PCR，將產(chǎn)物與T/A載體連接構(gòu)建成消減cDNA文庫(kù)，并轉(zhuǎn)染大腸桿菌進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增，挑取克隆進(jìn)行篩選排除假陽(yáng)性，再行序列分析，鑒定胎肝細(xì)胞感染HBV后的差異應(yīng)答基因.結(jié)果：成功構(gòu)建高效消減的HBV感染胎肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)，得到158個(gè)白色的克隆，隨機(jī)選擇了128個(gè)克隆經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得含有明確單一目的片斷的克隆99個(gè)，長(zhǎng)約100400bp，經(jīng)篩選后得到70個(gè)克隆，測(cè)序表明有16個(gè)差異表達(dá)的基因，其中可能的新基因有5個(gè).結(jié)論：用抑制性消減雜交技術(shù)成功建立了HBV感染培養(yǎng)人胎肝細(xì)胞的消減cDNA文庫(kù)，為進(jìn)一步大規(guī)模篩選HBV感染后的應(yīng)答基因奠定了基礎(chǔ)，初步篩選出的新基因片斷為進(jìn)一步研究宮內(nèi)感染的分子機(jī)制提供了依據(jù).【關(guān)鍵詞】HBV胎肝細(xì)胞雜交消減文庫(kù)克隆0引言慢性乙型肝炎易形成長(zhǎng)期免疫耐受和復(fù)雜疾病譜，從HBsAg攜帶、慢性乙型肝炎到肝硬化、肝癌等，宿主對(duì)病毒的反應(yīng)在發(fā)病機(jī)制中起重要作用.HBV與宿主相互作用不僅僅發(fā)生在細(xì)胞表面，很可能是一個(gè)非常復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，HBV與宿主組織細(xì)胞之間這種特定的相互作用決定著病毒的存活與疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，而這種相互作用反映在基因水平上則表現(xiàn)為病毒感染后宿主細(xì)胞基因表達(dá)譜的改變.完整的HBV感染肝細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究有可能使我們更深入地認(rèn)識(shí)HBV的分子致病機(jī)制，從而發(fā)現(xiàn)更多、更有效的抗病毒作用靶標(biāo).本研究我們用抑制性消減雜交技術(shù)克隆并鑒定HBV感染胎肝細(xì)胞后的應(yīng)答基因，為闡明HBV宮內(nèi)感染的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自Highclone公司，總RNA提取試劑盒購(gòu)自Promega公司，SMARTPCRcDNA合成試劑盒、PCRSelectcDNA消減雜交試劑盒、Advantage2cDNAPCR試劑盒、PCRSelectDifferentialScreening試劑盒、NucleoTrapPCR純化試劑盒及尼龍膜、單面乳膠膠片均購(gòu)自Clontech公司，32PdATP購(gòu)自北京福瑞生物工程公司核酸研究室.1.2方法1.2.1HBV感染培養(yǎng)人胎肝細(xì)胞1-2用纖維連接素包被培養(yǎng)皿，將凍存的22wk人胎肝細(xì)胞復(fù)蘇，加入經(jīng)過(guò)純化的人血清來(lái)源的HBVDNA病毒，檢測(cè)培養(yǎng)上清中HBcAg和細(xì)胞中HBVcccDNA同時(shí)陽(yáng)性的胎肝細(xì)胞做為感染組，同時(shí)培養(yǎng)的未感染細(xì)胞做為陰性對(duì)照組，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn).1.2.2抑制性消減雜交用總RNA提取試劑盒抽提兩組細(xì)胞的總RNA,按說(shuō)明書操作并進(jìn)行定性定量分析.用SMARTPCRcDNA合成試劑盒合成長(zhǎng)距離dscDNA，按說(shuō)明書操作，用CHROMASPIN1000進(jìn)行純化，按說(shuō)明書操作.取36LRsaI消化緩沖液和1.5LRsaI酶（166.7nkat）；混勻后于37孵育3h.以NucleoTrapPCR純化試劑盒純化消化后的cDNA樣品，按說(shuō)明書操作，經(jīng)乙醇沉淀后，溶于6.7L雙蒸水中，用紫外分光光度計(jì)定量，將濃度調(diào)節(jié)為300mg/L.以感染細(xì)胞為檢測(cè)方，以未感染細(xì)胞為驅(qū)動(dòng)方，加T4DNA連接酶1L（6.66kat），分別與接頭1和2連接，16h反應(yīng)過(guò)夜后進(jìn)行接頭連接效率檢測(cè).在鑒定連接效率滿意（>；25%）后，將連接有接頭1和2的檢測(cè)方dscDNA1.5L分別與1.5L驅(qū)動(dòng)方dscDNA在68下雜交8h后，立即將經(jīng)過(guò)第一次消減雜交的兩組體系混合，另加新變性的驅(qū)動(dòng)方cDNA1L，68雜交12h，稀釋（1200）.取1L稀釋后的第二次雜交后產(chǎn)物做模板，在50advantageTaq聚合酶作用下，以接頭1和2的外側(cè)序列分別為5及3引物，進(jìn)行第1次PCR擴(kuò)增；取第一次PCR產(chǎn)物3L，10倍稀釋后取1L做模板，以接頭1和2內(nèi)側(cè)序列分別為5及3的巢式PCR引物，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行PCR產(chǎn)物消減效率檢測(cè).1.2.3cDNA消減文庫(kù)的構(gòu)建及PCR鑒定克隆取3LPCR產(chǎn)物及2L線性化質(zhì)粒載體，在1LT4DNA連接酶的作用下，14反應(yīng)12h后，-20保存.取2L連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)染200L感受態(tài)大腸桿菌，225r/min搖菌1.5h，取200L菌液種植于含氨芐青霉素的LB/Xgal/IPTG培養(yǎng)板上，37培育18h.計(jì)數(shù)培養(yǎng)板中直徑>；1mm清晰的白色及藍(lán)色菌落數(shù).隨機(jī)挑取128個(gè)白色菌落于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37搖菌過(guò)夜，取菌液1L做模板，以接頭1和2內(nèi)側(cè)序列分別為5及3的PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選取含有明確單一目的片斷的克隆99個(gè)進(jìn)行雜交篩選.1.2.4斑點(diǎn)雜交法進(jìn)行差異篩選取鑒定過(guò)的含有單一明確目的片斷克隆的PCR反應(yīng)液5L加5L0.6mol/LNaOH，混勻變性；取2L新鮮變性cDNA，分別點(diǎn)樣于尼龍膜上；0.5mol/LTrisCl（pH7.6）中和，雜交爐中70烤膜2h固定.預(yù)雜交1h后加入32P標(biāo)記的4種探針：正向消減探針、檢測(cè)相未消減探針、反向消減探針、驅(qū)動(dòng)相未消減探針進(jìn)行雜交過(guò)夜，加入探針的cpm值為107.洗膜后進(jìn)行放射自顯影，選取差異表達(dá)的克隆.用（-20）引物測(cè)序，由北京鼎國(guó)公司代理.2結(jié)果2.1總RNA的定性定量分析紫外分光光度計(jì)檢測(cè)檢測(cè)相和驅(qū)動(dòng)相胎肝細(xì)胞總RNA量分別為500和150g/L，A260/280>；1.8，10g/L瓊脂糖凝膠電泳見(jiàn)RNA的28S和18S亞單位十分清晰，二者比例約為1.51，證實(shí)RNA質(zhì)優(yōu)量足.2.2SMARTPCR合成長(zhǎng)距離dscDNA在10g/L瓊脂糖凝膠電泳上見(jiàn)dscDNA為0.58.0kb的彌漫性條帶.2.3RsaI酶切可見(jiàn)dscDNA由0.58.0kb的彌漫性條帶降解為約0.22.0kb的條帶（圖1），證實(shí)酶切十分成功.圖1DscDNA樣品經(jīng)RsaI消化前后20g/L瓊脂糖凝膠電泳2.4DscDNA兩端接頭連接效率檢測(cè)將連接有接頭1和2的兩組胎肝細(xì)胞dscDNA分別用G3PDH3,5引物及以G3PDH3引物和接頭上5引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.結(jié)果顯示兩組胎肝細(xì)胞接頭連接效率均>；50%,即50%以上dscDNA已與接頭連接.2.5兩次抑制性PCR后的電泳兩次抑制性PCR后分別取8L擴(kuò)增產(chǎn)物在15g/L瓊脂糖凝膠電泳上可見(jiàn)正向和反向消減后的產(chǎn)物為約100600bp的彌漫性條帶,而未消減前的產(chǎn)物為較大分子質(zhì)量的彌漫性條帶（圖2）.圖2第2次PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳2.6cDNA消減文庫(kù)消減效率鑒定消減后PCR產(chǎn)物中G3PDH在28個(gè)循環(huán)后可見(jiàn)弱的條帶,而消減前G3PDH在18個(gè)循環(huán)后即可見(jiàn)明顯條帶（圖3），說(shuō)明所構(gòu)建的消減文庫(kù)具有很高的消減效率.18,23,28,32:PCR循環(huán)數(shù).圖3擴(kuò)增看家基因G3PDH檢測(cè)消減效率凝膠電泳2.7PCR鑒定克隆中插入的目的片斷cDNA消減文庫(kù)包含158個(gè)白色克隆，克隆飽滿清晰.隨機(jī)挑取128個(gè)白色克隆，用巢式引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，在20g/L瓊脂糖凝膠電泳上可見(jiàn)大小不等的插入片斷，約100400bp.2.8斑點(diǎn)雜交法進(jìn)行差異篩選結(jié)果顯示：正向雜交陽(yáng)性而反向雜交為陰性或正向雜交信號(hào)比反向雜交高5倍以上的克隆有70個(gè)（圖4）.2.9克隆的序列分析經(jīng)過(guò)差異篩選后的70個(gè)克隆測(cè)序表明插入cDNA片段大小為80400bp，部分基因?yàn)槎嗫截?，?jīng)GenBank(/BLAST)檢索有11個(gè)cDNA片段和已知基因同源性為100%，其中6個(gè)功能已知，5個(gè)功能未知；5個(gè)cDNA片段和已知基因同源性為50%84%，可能代表新基因(表1).112,AI:樣品序號(hào).圖4斑點(diǎn)雜交篩選目的基因表1和已知基因完全同源的cDNA片段3討論目前控制乙型肝炎流行的最主要手段是用乙型肝炎疫苗進(jìn)行預(yù)防接種.隨著乙肝疫苗的普遍使用，乙型肝炎的水平傳播已基本得到控制，而宮內(nèi)感染，新生兒出生后用乙肝疫苗和特異性高效價(jià)免疫球蛋白不能阻斷其傳播，因而成為我們國(guó)家乙型肝炎傳播的主要途徑.近幾十年來(lái)，關(guān)于HBV宮內(nèi)感染發(fā)生率的報(bào)道較多，然而對(duì)其具體機(jī)制研究較少3-6.本研究選擇胎肝細(xì)胞作為研究HBV宿主相互作用的模型，用抑制性消減雜交技術(shù)鑒定HBV感染胎肝細(xì)胞后的差異應(yīng)答基因譜變化，經(jīng)序列分析和同源性比較分析發(fā)現(xiàn)HBV感染胎肝細(xì)胞的過(guò)程可能涉及到物質(zhì)代謝和信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程.部分功能已知的差異應(yīng)答基因包括編碼合成甲氨酰磷酸合成酶1(CPS1)的基因，該酶參與催化尿素循環(huán)的起始步驟7；編碼乳酸脫氫酶的基因，該酶為糖代謝不可缺少的酶類；編碼CD59抗原的基因，CD59是一種廣泛分布于組織細(xì)胞表面的GPI錨固糖蛋白，是一個(gè)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子8；編碼3甲基3羥基戊二酸輔酶A合成酶(HMGCoAs)的基因,該酶與膽固醇和酮體的代謝有關(guān)9；編碼核受體結(jié)合蛋白(NRBP)的基因，NRBP參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路及亞細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸10-11，據(jù)Chua等12報(bào)道，NRBP與登革熱病毒的NS3蛋白相互作用而參與登革熱病毒的致病過(guò)程.還有5個(gè)和已知基因100%同源的cDNA片段功能未知；另有5個(gè)cDNA片段和已知基因同源性為50%84%，可能代表新基因，我們正在進(jìn)一步驗(yàn)證.我們研究結(jié)果表明這些基因可能在HBV感染胎肝細(xì)胞的過(guò)程中構(gòu)成一個(gè)相互作用的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，但是他們的具體作用機(jī)制，仍需大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這也是我們今后要做的重點(diǎn)工作之一.【參考文獻(xiàn)】1王方,王宇明,湯勃,等.纖維結(jié)合素對(duì)HBV感染原代培養(yǎng)人胎肝細(xì)胞的影響J.解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2004,29（5）:400-402.2王方,王宇明,湯勃,等.HBV體外感染培養(yǎng)人胎肝細(xì)胞的鑒定方法比較J.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,26（1）:74-77.3OhtoH,LinHH,KawanaT,etal.IntrauterinetransmissionofhepatitisBvirusiscloselyrelatedtoplacentalleakageJ.JMedVirol,1987,21(1):1-6.4XuDZ,YanYP,ZouS,etal.RoleofplacentaltissuesintheintrauterinetransmissionofhepatitisBvirusJ.AmJObstetGynecol,2001,185(4):981-987.5XuDZ,YanYP,ChoiBC,etal.RiskfactorsandmechanismoftransplacentaltransmissionofhepatitisBvirus:AcasecontrolstudyJ.JMedVirol,2002,67(1):20-26.6劉穎琳，鄺健全，張睿，等.胎兒感染乙型肝炎病毒的臨床研究J.中華婦產(chǎn)科雜志,2002,37(8):465-468.7KurokawaK,YorifujiT,KawaiM,etal.MolecularandclinicalanalysesofJapanesepatientswithcarbamoylphosphatesynthetase1(CPS1)deficiencyJ.JHumGenet,2007,52(4):349-354.8RuizArgellesA,LlorenteL.Theroleofcomplementregulatoryproteins(CD55andCD59)inthepathogenesisofautoimmunehemocytopeniasJ.AutoimmunRev,2007,6(3):155-161.9BodeHB,RingMW,SchwrG,etal.3Hydroxy3methylglutarylcoenzymeA(CoA)synthaseisinvolvedinbiosynthesisofisovalerylCoAinthemyxobacteriumMyxococcusxanthusduringfruitingbodyformationJ.JBacteriol,2006,188(18):6524-6528.10DeLangheS,HaatajaL,SenadheeraD,etal.InteractionofthesmallGTPaseRac3withNRBP,aproteinwithakinasehomologydomainJ.IntJMolMed,2002,9(5):451-459.11WangH,SunX,LuoY,etal.AdapterproteinNRBPa