ctDNA檢測技術(shù).docx

ctDNA檢測技術(shù)循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)來源于腫瘤細(xì)胞的凋亡、壞死或分泌產(chǎn)生的DNA片段，是循環(huán)游離DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA)的一部分1。ctDNA含有與其來源腫瘤DNA同樣的基因缺陷，如點(diǎn)突變，重排，擴(kuò)增等2；其在血液中的半衰期短，可實(shí)時反映腫瘤的動態(tài)變化3;作為液體活檢的一種，可克服組織活檢中由于腫瘤異質(zhì)性帶來的缺陷，檢測更全面4,因此ctDNA的檢測可用于癌癥早期診斷與癌癥分期、腫瘤的療效評估、復(fù)發(fā)監(jiān)測和預(yù)后判斷等5。由ctDNA的質(zhì)量和數(shù)量變化大, 因此需要高特異性和高靈敏度的檢測方法。目前常用的方法有數(shù)字PCR (digital PCR, dPCR)、BEAMing (bead, emulsion,amplification and magnetic)、高通量測序(next generation sequencing, NGS)、ARMS等6。1.數(shù)字PCR1999年Vogelstein等提出了數(shù)字PCR(digtal PCR,dPCR)的概念7。數(shù)字PCR包括兩部分，即PCR 擴(kuò)增和熒光信號分析。先將是樣品稀釋后分配到大量微小的反應(yīng)單元中，每個單元包含或不包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子,然后分別對目標(biāo)分子進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行采集。數(shù)字PCR采用直接計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行定量分析, 有熒光信號的反應(yīng)單元中至少包含一個拷貝的目標(biāo)分子，記為1，無熒光信號的則即為0，理論上，在樣品中極限稀釋的情況下，有熒光信號的反應(yīng)單元數(shù)目等于目標(biāo)DNA 分子的拷貝數(shù)。但是有的反應(yīng)單元中可能包含兩個或兩個以上的目標(biāo)分子，這時需要用泊松概率分布公式進(jìn)行計(jì)算8。不同于傳統(tǒng)的qPCR技術(shù),數(shù)字PCR 不受擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值(CT) 和擴(kuò)增效率的影響，無需參照，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好，可實(shí)現(xiàn)絕對定量分析9。根據(jù)反應(yīng)單元類型不同，數(shù)字PCR分為三類: 微反應(yīng)室/ 孔板數(shù)字PCR、微流控芯片和微滴數(shù)字PCR系統(tǒng)。微反應(yīng)室/孔板數(shù)字PCR借助高通量自動上樣設(shè)備和增加的反應(yīng)單元數(shù),實(shí)現(xiàn)快速精確取樣，提高檢測靈敏度。微流控芯片技術(shù)是一種基于含有數(shù)千個超高密度親疏水微孔芯片的dPCR平臺，可實(shí)現(xiàn)高通量、低成本分析。微滴數(shù)字PC( droplet digital PC,ddPCR)是將含有目標(biāo)分子的樣品分成成千上萬個納升級的油包水微滴，再對每個微滴進(jìn)行擴(kuò)增，和熒光信號的采集，更容易實(shí)現(xiàn)小體積和高通量10。數(shù)字PCR可絕對定量，是目前靈敏度最高的檢測技術(shù)，但其也存在一定缺點(diǎn)，如生成的微滴必須服從泊松分布，所以不適合高濃度DNA樣本檢測，；只能檢測已知的突變且一次只能檢測一種突變11,12。2.BEAMing技術(shù)BEAMing技術(shù)在檢測ctDNA內(nèi)體腫瘤突變具有非常高的靈敏度，它是結(jié)合了數(shù)字PCR以及流式技術(shù)的一種檢測方法，最早是由Bert Vogelstein提出。其方法是每一類DNA分子都會專一的與磁性珠相連接，然后DNA分子之間的差異可以通過流式細(xì)胞儀檢測熒光標(biāo)記來做出評估。這種方法是基于小珠(Bead)、乳濁液(Emulsion)、擴(kuò)增(Amplification)、磁性(Magnetic)，這四個主要組分來構(gòu)建的，所以被稱作為BEAMing13。 BEAMing 技術(shù)的過程包括：首先是分離和純化血漿中的DNA；接著是預(yù)擴(kuò)增步驟，通過使用常規(guī)PCR 擴(kuò)增目的基因片段，使用引物與已知的標(biāo)記序列混合；然后，這些DNA 模板再通過乳液PCR 擴(kuò)增，應(yīng)用引物探測這些序列，通過鏈酶親和素磁珠相互作用與有磁性的微膠珠結(jié)合。通過這種方式設(shè)計(jì)的系統(tǒng)，在反應(yīng)結(jié)束之前，每個乳液液滴中生成的PCR 產(chǎn)物將保持對微膠珠的附著性，使其可以很容易地通過磁性進(jìn)行分離和純化14。并且，BEAMing技術(shù)是利用磁珠來吸附游離DNA，它可以從1萬個健康細(xì)胞DNA中檢測出那一個ctDNA分子，具有較高的敏感性，同時在很多研究中其在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的突變都和ctDNA部分突變是一致的15,16。BEAMing技術(shù)相比其他檢測技術(shù)具有很多優(yōu)勢：（一）在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室條件下，數(shù)以萬計(jì)的DNA分子可以通過該種方法來進(jìn)行評估。（二）特異的突變可以通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分離篩選以備進(jìn)一步分析和研究。（三）BEAMing技術(shù)可以用來對特定組織或者人群中罕見的突變，以及研究一般基因序列或轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物的變異都可以提供相應(yīng)的鑒別和定量分析。由于外周血流中ctDNA 拷貝的數(shù)量是很低的，特別是相較于野生型DNA 來說。出于這個原因，使用PCR 進(jìn)行DNA 擴(kuò)增是BEAMing 過程中的一個重要部分，是確保可靠檢測的保證5。然而，BEAMing 這項(xiàng)檢測技術(shù)只能檢測已知突變，且成本較高17 同時，它的操作也較復(fù)雜，通量低，且單分子擴(kuò)增在非均一的微滴中實(shí)現(xiàn)，需要RCR預(yù)擴(kuò)增，會增加試驗(yàn)誤差12。3.基于NGS技術(shù)的檢測方法ctDNA檢測技術(shù)，除了基于PCR檢測方法之外，還有一種以高通量測序技術(shù)，又稱“下一代”測序技術(shù)（NGS）為基礎(chǔ)的檢測方法。這種方法主要是選定十幾到幾十個腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行測序，測序通量和效率高。根據(jù)富集策略的不同，基于NGS的技術(shù)目前又可分為靶向擴(kuò)增子測序(TAS)及目標(biāo)序列捕獲測序(TCS)。靶向擴(kuò)增子測序(TAS)技術(shù)是針對目的基因設(shè)計(jì)幾十對甚至上百對PCR引物，利用多重PCR擴(kuò)增富集。代表性方法有標(biāo)記擴(kuò)增深度測序(TAM-Seq)。Forshew等18 通過TAM-Seq測序技術(shù)，檢測患者癌細(xì)胞中ctDNA片段，從而找到腫瘤樣品中的遺傳突變。這種方法無需外科手術(shù)或者活檢，就可以找到癌癥突變。目標(biāo)序列捕獲測序(TCS)技術(shù)是針對目的基因設(shè)計(jì)探針，通過捕獲雜交的方法富集，代表性方法有深度測序腫瘤個體化建檔法（CAPP-Seq）。Newman等19從腫瘤基因突變數(shù)據(jù)庫找復(fù)發(fā)突變相關(guān)的外顯子，再從腫瘤基因圖譜庫的407位非小細(xì)胞肺癌患者全基因組測序結(jié)果篩選。然后應(yīng)用迭代算法使每個非小細(xì)胞肺癌患者樣本的錯義突變最大化來簡化篩選器(selector)的大小，最后的selector能識別139個復(fù)發(fā)突變基因中的521個外顯子和12個內(nèi)含子，長度約為125kb，平均能夠識別4個單核苷酸突變（SNV），在96%的肺腺癌或鱗癌患者身上有效?；贜GS技術(shù)的檢測方法靈敏度高，能同時檢測多個基因的多種變異。但是其技術(shù)復(fù)雜，數(shù)據(jù)處理困難，實(shí)驗(yàn)室水平差異較大，儀器與試劑的成本相對較高。想要臨床應(yīng)用，首先要將其標(biāo)準(zhǔn)化12。4.ARMS技術(shù)ARMS，全稱為突變擴(kuò)增系統(tǒng)（Amplification refractory mutation system），是由Newton等人首先建立并用于檢測基因已知突變的方法20。利用PCR引物3端堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能進(jìn)行有效擴(kuò)增的基本原理，根據(jù)已知突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，使3末端堿基分別與突變和野生型模板堿基進(jìn)行互補(bǔ)，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，達(dá)到將“突變”模板與“野生”模板區(qū)分的目的12。ARMS法的主要特點(diǎn)有高特異性，高靈敏度以及耗時短，成本低，操作簡單等特點(diǎn)。其檢測結(jié)果的高特異性關(guān)鍵在于引物設(shè)計(jì)。ARMS法所用的引物是通過篩選能夠識別單個位點(diǎn)等位基因的引物，進(jìn)而保證了結(jié)果的高特異性。而ARMS法檢測點(diǎn)突變的檢出率還取決于PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化和防止引物與靶DNA錯配可能發(fā)生的錯配延伸。PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化可以通過改變引物濃度、靶DNA濃度、Taq酶濃度以及反應(yīng)體系溫度進(jìn)行調(diào)整21。此外，在反應(yīng)體系中加入甲酰胺可以減少非特異性擴(kuò)增，在引物3末端引入第二個錯配堿基也可以提高引物的特異性21。通過在體系中加入多對引物可以實(shí)現(xiàn)多重?cái)U(kuò)增，實(shí)現(xiàn)基因的多位點(diǎn)突變檢測22。ARMS法檢測靈敏度明顯高于直接測序法等其他方法，可檢測出樣品中含量低至0.1%1.0%的突變基因；且該方法結(jié)合PCR技術(shù)，操作簡單，耗時短，成本低，結(jié)果直觀23。目前，ARMS法已成為國際上腫瘤個體化分子檢測最重要、最先進(jìn)的技術(shù)之一，其在臨床應(yīng)用中的優(yōu)勢已被業(yè)內(nèi)專家廣泛認(rèn)可。但該方法只能用于檢測已知突變，在一定程度上限制其應(yīng)用。ARMS法檢測可以分為實(shí)時熒光定量PCR和巢式ARMS法電泳檢測。實(shí)時熒光定量PCR是指ARMS技術(shù)結(jié)合探針對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，在實(shí)時定量PCR平臺上實(shí)現(xiàn)對樣品DNA中稀有突變的檢測24。而巢式ARMS法電泳檢測是利用凝膠電泳技術(shù)檢測擴(kuò)增帶，從而實(shí)現(xiàn)結(jié)果分析25。隨著ARMS技術(shù)的發(fā)展，商品化的ARMS試劑盒相繼問世，包括人表皮生長因子受體（EGFR）基因突變檢測試劑盒，人KARS基因突變檢測試劑盒，四項(xiàng)耳聾基因檢測試劑盒等13?？偨Y(jié) 作為重要的腫瘤分子標(biāo)志物，ctDNA在腫瘤的診斷、治療監(jiān)測、預(yù)后等方面發(fā)揮著重要的作用，而DNA測序技術(shù)的發(fā)展使得通過檢測ctDNA來指導(dǎo)腫瘤的臨床進(jìn)展變得更加切實(shí)可行。數(shù)字PCR技術(shù)、BEAMing技術(shù)、NGS技術(shù)、ARMS技術(shù)在ctDNA的檢測中各具其獨(dú)特的優(yōu)勢和不足之處，實(shí)際應(yīng)用時應(yīng)結(jié)合具體條件決定采用何種檢測方法。相信隨著技術(shù)的進(jìn)步，ctDNA 將會逐漸從科研領(lǐng)域向臨床轉(zhuǎn)化發(fā)展。參考文獻(xiàn)1 Yong E. 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