大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn).ppt

質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)回顧,三大步、七小步、四離心,三溶液及三合一,兩注意,大腸桿菌感受態(tài)的制備及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化,2015.06.20,一、什么是感受態(tài)細(xì)胞（Competentcell）,細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的狀態(tài)，處于這種狀態(tài)的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。,Naturestate,Competentstate,載體（vector),病毒,質(zhì)粒,噬菌體,二、什么是轉(zhuǎn)化及與其相似的概念,轉(zhuǎn)導(dǎo)（Transduction),轉(zhuǎn)化（Transformation),轉(zhuǎn)染（Transfection),/users/chagedor/biol_4684/Methods/genes.html,PEI,脂質(zhì)體，磷酸鈣等,載體（vector),病毒,質(zhì)粒,噬菌體,轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的相同及不同,轉(zhuǎn)導(dǎo)（Transduction),/kroberts/Lecture/Chapter%207/horizontal.html,三、如何篩選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞（發(fā)揚(yáng)個(gè)性）,抗性篩選,藍(lán)白斑篩選,四、制備感受態(tài)細(xì)胞的方法,通常制備感受態(tài)細(xì)胞的方法有兩種：電擊法和化學(xué)法,兩種方法比較,電擊法制備感受態(tài)及轉(zhuǎn)化的原理,+,-,1970年M.Mandel和A.Higa發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)氯化鈣處理的生長(zhǎng)期大腸桿菌容易吸收噬菌體DNA。,CaCl2方法的歷史,CaCl2方法的歷史,赫伯特波伊爾,斯坦利柯恩,StanleyCohen,HerbertBoyer,1973年實(shí)現(xiàn)了質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞。,感受態(tài)制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化,（1）實(shí)驗(yàn)材料,E.ColiDH5（無(wú)質(zhì)粒）,（2）實(shí)驗(yàn)試劑,p32質(zhì)粒,（實(shí)驗(yàn)五提取得到的質(zhì)粒）,液體培養(yǎng)基,低滲MgCl2和CaCl2溶液,（1）CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)過(guò)程,(大冷),0.5,(小冷),（2）質(zhì)粒轉(zhuǎn)化（Heatshock),100ul,5,5,（熱激+復(fù)蘇）,（共冷）,100,(0.5ul),10分鐘,冰上放置10分鐘,加入200微升含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，37攝氏度，復(fù)蘇30min.,100,（3）質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)及篩選,液培中，將上述液體加到含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)皿中，用滅過(guò)菌的玻璃棒涂布均勻，放置30分鐘。,氨卞霉素,(ug/ml),（個(gè)/ug）,CaCl2方法制備感受態(tài)的原理,1、在“小冷”條件下發(fā)生了什么改變？,（1）處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的大腸桿菌細(xì)胞膜上存在大量的Adhensionzones,（2）低溫使得細(xì)胞膜的膦脂雙分子層的流動(dòng)性變慢,2、在“大冷”條件下發(fā)生了什么改變？,（1）低滲的CaCl2和MgCl2溶液使得細(xì)胞發(fā)生膨脹,（2）Ca+2離子與細(xì)胞膜上的磷酸根離子結(jié)合,（3）低溫條件下Ca+2會(huì)使細(xì)胞膜膦脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來(lái)，離開所在區(qū)域。,（4）Mg+2對(duì)于Ca+2具有協(xié)同作用,質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的原理,3、感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒共同冰浴時(shí)發(fā)生什么改變？,（1）質(zhì)粒DNA可以圍繞在感受態(tài)細(xì)胞周圍,（2）Ca+2又與質(zhì)粒DNA結(jié)合形成抗脫氧核糖核酸酶（DNase）的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在感受態(tài)細(xì)胞膜的外表面上,4、在熱休克時(shí)發(fā)生什么改變？,短暫的42熱脈沖處理，感受態(tài)細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，致使細(xì)胞膜的通透性增加，質(zhì)粒DNA分子便進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，完成轉(zhuǎn)化。,總結(jié),（1）在制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)一定要在低溫進(jìn)行（溫度的要求）,（2）在熱休克質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的過(guò)程中一定要注意快速（時(shí)間的要求）,“四步冷、一步熱”,重點(diǎn)及思考題,重點(diǎn)：,CaCl2方法制備大腸感受態(tài)細(xì)胞的原理；質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過(guò)程的步驟及關(guān)