（分析化學(xué)專業(yè)論文）單分子計數(shù)定量方法研究.pdf

山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 中文摘要 本論文共包括三部分，第一章是單個生物分子的檢測，第二章是全內(nèi)反射熒 光法檢測溶液中單個抗體分子，第三章是無標準溶液作參比的絕對單分子計數(shù)定 量分析法。 第一章對單分子檢測的研究現(xiàn)狀進行了綜述。介紹了單分子檢測的意義、原 理、主要研究內(nèi)容以及所使用的熒光顯微鏡的構(gòu)造和原理，從單分子的追蹤、分 子構(gòu)象動力學(xué)、馬達蛋白的運動、離子通道、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、單分子酶學(xué)、特 定序列核酸的單分子檢測、單分子計數(shù)等方面介紹了單分子檢測的現(xiàn)狀、方法， 本章共引用文獻8 i 篇。 第二章對全內(nèi)反射熒光顯微鏡檢測溶液中羊抗鼠i g g ( h + l ) 單分子的方法 進行了研究。討論了在單分子成像中，降低雜質(zhì)熒光的方法和激光功率、曝光時 間等條件的選擇。選擇激光功率為2 4k w ，曝光時間為1 0 0m s ，將緩沖溶液過 濾后再進行光漂白、對蓋玻片進行光漂白，有效地降低了雜質(zhì)熒光。使用全內(nèi)反 射隱失場激發(fā)，減小激發(fā)體積，并使用適宜的濾波片，提高了檢測的靈敏度，采 用高靈敏度的檢測器i c c d 可對p b s 溶液中的單個羊抗鼠i g g ( h + l ) 分子進行 成像。使用兩種方法對單分子進行了證明在1 0 x1 0 1 0 m o l l - 4 0 x1 0 9 m o l l 的 濃度范圍內(nèi)，檢測到的單分子的數(shù)目與溶液濃度有良好的線性關(guān)系，這不但可作 為單分子證明的依據(jù)，還可作為一種檢測溶液濃度的方法。 第三章提出了一種新的檢測溶液濃度的方法。將蓋玻片使用環(huán)氧丙氧丙基三 甲氧基硅烷處理，在玻片表面生成環(huán)氧集團，將a l e x a 4 8 8 標記的羊抗鼠i g g ( h + l ) 的p b s 緩沖溶液滴在硅烷化的蓋玻片上，靜置3 0m i n 左右，待溶劑揮 發(fā)后，溶液中的蛋白分子全都沉積在蓋玻片表面，環(huán)氧集團可和蛋白分子中的氨 基反應(yīng)，從而將蛋白分子共價結(jié)合在蓋玻片上滴加蒸餾水，溶解掉結(jié)晶在蓋玻 片表面的無機鹽，非常有效地去除了背景熒光，在此基礎(chǔ)上利用全內(nèi)反射熒光顯 微鏡結(jié)合i c c d 對固定在蓋玻片表面的蛋白分子成像并計數(shù)，可直接計算出溶液 的濃度檢測范圍為濃度5 0 x1 0 ”t o o l l - 5 0 x1 0 1 4 m o l l 關(guān)鍵詞：單分子成像，單分子計數(shù)，全內(nèi)反射，羊抗鼠i g g ( h + l ) 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 a b s t r a c t t h i st h e s i si n c l u d e st k r e ep a r t s ：d e t e c t i o no fs i n g l eb i o m o l e c u l e s d e t e c t i o no f s i n g l ea n t i b o d ym o l e c u l e si n s o l u t i o nb yt o t a l i n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u n r e s c c n c e m i c r o s c o p y , d e t e r m i n a t i o no f g o a ta n d - r a ti g g ( h 十l ) b yc o u n t i n gs i n g l em o l e c u l e s i nt h ec h a p t e ro n eo ft h i sd i s s e r t a t i o n ，t h ed e t a i lr e v i e wo fd e t e c t i o no fs i n g l e b i o m o l e c u l e sw a sd e l i v e r e d s i g n i f i c a n c e ，p r i n c i p l ea n db a s i cc o n t e n to fs i n g l e m o l e c u l e sd e t e c t i o na n ds t r u c r n e ，p r i n c i p l eo fm i c r o s c o p ei ns i n g l em o l e c u l e s d e t e c t i o nw e r ei n t r o d u c e d a c t u a l i t y , m e t h o do fs i n g l em o l e c u l e sd e t e c t i o nw 眥 i n t r o d u c e di na s p e c to ft r a c i n gs i n g l em o l e c u l e s ，s i n g l em o l e c u l e se n z y m o l o g y , d y n a m i c so fm o l e c u l a rc o n f o r m a t i o n , m o t i o no fm o t o rp r o t e i n , i o nc h a n n e l s ，c e l l s i g n a lc o n d u c t i o n , d e t e c t i o no fs p e c i f i cd n as e q u e n c e sa tt h es i n # e - m o l e c u l el e v e l ， c o u n t i n go f s i n g l em o l e c u l e s i nt h ec h a p t e 8 1r e f e r e n c e sh a v eb e e nr e f e r r e d i nt h ec h a p t e rt w o ，t h em e t h o do fd e t e c t i o ns i n g l eg o a ta n t i - r a ti g o ( h + l ) m o l e c u l e sb yt o t a li n t e r m r e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p yw a si n v e s t i g a t e d s e v e r a lp a r a m e t e r si n c l u d i n gl a s e rp o w e r , e x p o s u r et i m ew a so p t i m i z e df o ri m a g i n g o fs i n g l eg o a ta n t i - r a ti g g ( h + l ) m o l e c u l e s t h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n sw 般s u i t a b l e 幻ft h ei m a g i n go fs i n g l em o l e c u l e s ：l a s e rp o w e r , 2 4k w ；e x p o s u r et i m e , 1 0 0m s r e d u c eb a c k g r o u n df l u o r e s c e n c e b yp r e p h o t o b l u n c h i n gb u f f e r a f t e rf i l t r a t i o n , p r e - p h o t o b l a n c h i n gc o v e r s l i p ，r e d u c i n ge x c i t e dv o l u m e ，m a k i n gu s eo ff i t t i n gc u b e s ， i n c r e a s ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t y , t h e ni m a g i n gs i n g l eg o a ta n t i - r a ti g gm + l ) m o l e c u l e s b yi c c d t h e r ea r et w oe v i d e n c e sf o rp r o v i n gs i n g l em o l e c u l e s t h em o l e c u l a r n u m b e ri sl i n e rw i t hg o a ta n t i - r a ti g o ( h + l ) c o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g eo fi , o x1 0 。1 0 m o y l - 4 o 1 0 q m o l l , t i l i si sn o to n l yap o t e me v i d e n c ef o rs i n g l em o l e c u l e s , b u t a l s oam e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no f p r o t e i n h lt h ec h a p t e rt h r e e , an o v e lm e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no fp r o t e i nw a sp r e s e n t e d , c o v e r l i p sw e r od e a l e dw i t hg l y c i d o x y p r o p y l t r i m e t h o x y s i l a n ea n de p o x yg r o u pw a s c r e a t e do rt h es u r f a c eo fc o v c r l i p s ，a i e x a 4 8 8g o a ta n t i - r a t i g g 餌+ l ) i n p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e ( p b s ) b u f f e rw e r ea d d e do nac o v e r s l i p , 3 0m i n u t el a t e r , p r o t e i nm o l e c u l e sw e r ed e p o s i t e dt ot h e 簡h a c eo fc o v e r s l i p sb ye v a p o r a t i o ns o l v e n t , i i 山東大學(xué)碩l ：帶位論文 d i s t i l l e dw a t e ru r a 5a d d e dt ot h es u r f a c eo fc o v e r s l i p st od i s s o l v et h es a l td e p o s i t e dt o t h es u r f a c eo fc o v e s r l i p s ，r e d u c eb a c k g r o u n df l u o r e s c e n c ee f f i c i e n t l y , t h e ni m a g i n g a n dc o u n t i n gs i n g l eg o a ta n t i - r a ti g g ( h + l ) m o l e c u l e sa b s o r b e dt ot h es u r f a c eo fa c o v e r s l i pb yt o t a li n t e r n a lr e f e c t i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ea n di c c d ，c a l c u l a t e c o n c e n t r a t i o nd i r e c t l y d e t e r m i n a t i o nr a n g ei s5 0x1 0 ?！眒 o l l 5 o 1 0 hm o l l k e y w o r d s ：s i n g l em o l e c u l e si m a g i n g ，c o u n t i n go fs i n g l em o l e c u l e s ，t o t a li n t e r n a l r e f l e c t i o n , g o a ta n t i - r a ti g g 口+ l ) 原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨立進 行研究所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引剛的內(nèi)容外，本論文不包含任何 其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果。對本文的研究作出重要貢 獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本聲明的法律責(zé)任由本人 承擔(dān)。 論文作者簽名： 遺墊 日期：之! 叢：蘭l 關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解山東大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保 留或向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱 和借閱；本人授權(quán)山東大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān) 數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文和匯編本 學(xué)位論文。 ( 保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定) 緲者虢扯聊簽名肄 e t 期：乏叢墨蘭星7 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一章單個生物分子的檢測 1 1 單分子檢測的原理及意義 單分子檢測( s i n g l em o l e c u l e sd e t e c t i o n ，s m d ) 就是在單分子水平上對物質(zhì) 的性質(zhì)進行檢測，得到單個分子的信息。傳統(tǒng)的化學(xué)實驗都是以分子的聚合體為 研究對象，得到的是物質(zhì)的平均性質(zhì)。而平均性質(zhì)往往掩蓋了許多特殊的重要信 息。只有在單分子水平上進行實驗，才能得到分子的性質(zhì)分布，研究復(fù)雜體系中 的個體?；瘜W(xué)反應(yīng)中，各個過程是不同步的，如果使用大量分子進行實驗，會掩 蓋個別的反應(yīng)途徑。因此也只有使用單分子檢測的方法，才能跟蹤觀測化學(xué)反應(yīng) 途徑，并能檢測到反應(yīng)中間狀態(tài)。過去十多年分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的發(fā)展留下了 許多未知的問題。例如：蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和它們的功能有什么聯(lián)系? 生物分子之間 是怎樣反應(yīng)的? 蛋白質(zhì)怎樣折疊? 要解決這些問題，單分子檢測方法是一個非常 有力的工具【1 】。單分子的檢測方法主要有激光誘導(dǎo)熒光、拉曼光譜、掃描探針 技術(shù)和質(zhì)譜法等。其中激光誘導(dǎo)熒光方法以其高靈敏度成為單分子檢測的重要方 法，本綜述也主要介紹激光誘導(dǎo)熒光方法在單個生物分子檢測中的應(yīng)用。 因為大多數(shù)生物分子是不發(fā)熒光的，所以利用激光誘導(dǎo)熒光方法對單個生物 分子進行檢測，需要在一個生物大分子( 蛋白質(zhì)分子或核酸分子) 上標記一個或 多個熒光染料分子，染料分子在激光的激發(fā)下發(fā)射出的熒光被檢測器檢測到。檢 測器可測得染料分子熒光的強度、波長、熒光壽命、熒光各向異性、熒光猝滅等 參數(shù)。熒光有一個很重要的性質(zhì)，就是非常容易受周圍環(huán)境如：p h 值、離子濃 度、電荷、氧化還原狀態(tài)等的影響，熒光強度等參數(shù)對周圍微環(huán)境的變化是非 常敏感的。周圍微環(huán)境的變化會引起這些熒光參數(shù)的變化。因此，反過來，可以 通過測得這些熒光參數(shù)以及它們的變化，來得到有關(guān)單個生物分子的信息，如分 子運動、酶動力學(xué)、蛋白質(zhì)的構(gòu)像和功能、化學(xué)反應(yīng)的過程、分子的性質(zhì)等現(xiàn) 在有這樣一種趨勢，那就是盡可能多的同時獲得這些參數(shù)，也就是所謂的多維檢 測方法 2 】。 在激光誘導(dǎo)熒光法單分子的檢測中，為降低背景噪音，一般采用激發(fā)體積較 小的激光掃描共聚焦顯微鏡和全內(nèi)反射熒光顯微鏡。激光掃描共聚焦顯微鏡是近 1 0 多年來發(fā)展起來的一種新型高精度顯微鐃系統(tǒng)，輔以各類熒光探針或熒光染 山東大學(xué)碩十學(xué)位論文 料與被測物質(zhì)特異性結(jié)合，不僅可觀察固定的細胞、組織切片 3 ，4 】，還可對活 細胞的結(jié)構(gòu)、分子、離子進行實時動態(tài)地觀察和檢測【5 1 。激光掃描共聚焦顯微 鏡具有非常小的檢測體積( 工) ，因此具有很高黔靈敏度。共聚焦的成像原理是 采用點光源照射標本，在焦平面上形成了一個輪廓分明的小的光點，該點被照射 后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分咒器。分光 器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孑l ，分別稱為照明針 孔和探測針孔，約為0 1 o 2 岬，相對于焦平面上的光點。兩者是共軛的，即 光點通過一系列的透鏡最終會同時聚焦于照明針孔和探測針孔( 圖1 - 1 ) 。全內(nèi)反 射熒光顯微鏡則是通過激光的逝波激發(fā)，只探測離界面2 0 01 1 1 1 1 以內(nèi)的范圍，因 此也具有很高的靈敏度。 1 非焦兩2 共焦兩，囂焦掰光絨柬4 針孔5 焦衙光束6 光耀7 目鏡s 物鏡 圖1 1 共聚焦光路圖 利用激光誘導(dǎo)熒光法檢測單分子，最早是在1 9 7 6 年，h i r s c h f e l d 【6 】在一個 抗體分子上結(jié)合8 0 到1 0 0 個熒光分子，在低溫下第一次探測到液體中單個抗體 分子的熒光，直到1 9 8 9 年，m o e m e r 【7 】在低溫下首次觀測到分子晶體中摻雜的 單個熒光分子的熒光。1 9 9 0 年，s h e r a 等f 8 】首先在液體中檢測到了單個熒光分 子，檢測率為8 5 。t r a u t m a n 等人【9 】到1 9 9 4 年利用近場顯微鏡首次在室溫下 檢測到了單個分子。m a c l d i n 等人【1 0 】用遠場顯微饒檢測到了單分子?，F(xiàn)在， 隨著光學(xué)顯微鏡技術(shù)、探針技術(shù)的發(fā)展以及靈敏檢測器的出現(xiàn)，單分子檢測已成 為人們檢測分子性質(zhì)的重要工具，在化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)以及物理學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮 著重要的作用。 1 2 單個生物分子檢測的主要內(nèi)容 山東人掣覯上學(xué)位論文 對單個生物分子的檢測，主要是檢測蛋白質(zhì)分子和核酸分子，主要包括以下 內(nèi)容：單分子追蹤、生物分子構(gòu)象變化、酶動力學(xué)、核酸序列以及單分子計數(shù)等。 1 2 1 單分子擴散軌跡的檢測 在細胞內(nèi)，很多生物分子是在運動過程中完成其生理功能，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等 因此，研究分子在細胞內(nèi)的運動方式，對了解它們的功能有很重要的作用。分子 在細胞內(nèi)部不同部位、不同結(jié)構(gòu)區(qū)域內(nèi)，擴散方式是不同的，觀測細胞中單分子 的擴散方式還有利于探測細胞結(jié)構(gòu)。 檢測單分子的運動軌跡，必須使用寬場的顯微鏡，如果觀測分子膜或細胞膜 上的單分子應(yīng)使用全內(nèi)反射熒光顯微鏡，而觀測溶液中或細胞內(nèi)的單分子應(yīng)使用 落射熒光顯微鏡，成像使用i c c d 。因為光的衍射作用，在i c c d 上單分子的圖 像為一直徑大約2 5 0n i n 的點，而生物分子只有幾個納米或十幾個納米。因此要 對單個分子的擴散軌跡進行檢測，首先要對單分子進行定位。利用點傳播函數(shù) ( p o i n ts p r e a df u n c t i o n ，p s f ) 可對分子進行精確定位，精度有幾十個納米對 選定的某個運動中的分子，用c c d 以一定的頻率進行連續(xù)拍照，可得到這個分 子的一系列的照片。對每禎照片中的分子精確定位，標出它的坐標( x ，y ) 。分 析相鄰的兩禎照片中分子的位置，計算出分子在這段時間內(nèi)的位移c 。并根據(jù)公 式計算出擴散系數(shù)( d ) 薩( x i x n ) 2 + ( y n + i - y n ) 2 = 4 d t a x = x n + l o x n ， y = y i 件i - y x n ，y n 分別為追蹤的單分子在某禎照片中的橫坐標和縱坐標，x n + 1 y n + t 為這個分 子在t 時間后所拍的照片中的橫坐標和縱坐標。t 為拍攝相鄰兩張照片的時間 間隔。 通過分析分子的擴散常數(shù)的大小、分布以及分子的擴散方向，可得出分子的 擴散方式。如果分子的擴散常數(shù)分布窄，則分子為自由擴散，如果分子的擴散常 數(shù)分布很寬，則分子為不規(guī)則擴散，如果分子在一段時間內(nèi)擴散方向不變，說明 分子在作定向運動。 單分子追蹤的研究最初是研究緩沖溶液中【1 l ，1 2 】或雙分子脂膜上【1 3 ，1 4 】 單個分子的運動軌跡，現(xiàn)在已發(fā)展到觀測細胞內(nèi)單分子的運動。與體外易于控制 山東夫?qū)W顧 學(xué)位論文 的干凈環(huán)境相比，細胞內(nèi)有許多生物分子和熒光物質(zhì)，象卟啉、四羥酮醇等，這 種復(fù)雜的環(huán)境會產(chǎn)生很強的背景熒光，既所謂的自發(fā)熒光。細胞中的單分子檢測 最主要的就是在細胞內(nèi)背景熒光的基礎(chǔ)上檢測出發(fā)自單分子的相對較弱的信號。 b y a s s e e 等【1 5 】分男q 將t m r 標記的鐵傳遞蛋白、羅月明6 g ( r 6 g ) 、r 6 g 標記 的寡核營酸導(dǎo)入宮頸癌細胞中，在活細胞的細胞質(zhì)中檢測到了它們的單分子。這 個實驗說明雖然細胞內(nèi)的背景熒光比緩沖溶液中的要高，但它是穩(wěn)定的、連續(xù)的， 不會對檢測細胞內(nèi)單分子的光子爆發(fā)產(chǎn)生太大的影響。但使用i c c d 作檢測器， 對分子精確定位，須進一步提高檢測的靈敏度。這可通過下方法實現(xiàn)：( i ) 、使 用具有高的吸光系數(shù)和量子產(chǎn)率的熒光染料分子，如：藻紅蛋白、量子點等。( 2 ) 、 使用具有較長的吸收波長和發(fā)射波長的熒光染料分子，這樣有利于與細胞中的自 體熒光信號分離。( 3 ) 、多標記。就是一個蛋白分子上標記多個熒光分子，但這 樣可能會影響蛋白分子本身的性質(zhì)，改變它的運動。( 4 ) 選擇熒咒背景拔低的細 胞，或選擇細胞中熒光背景較低的位置進行單分子的觀測，如：細胞核中。( 5 ) 、 觀測細胞膜上的單分子時，使用探測體積小的全內(nèi)反射熒光顯微鏡。 s c h u t z 等【1 6 】觀測了標記了熒光分子的油脂分子在肌細胞膜上的運動。位 置精度有5 0n m 。i i n o 等【：7 】用全內(nèi)反射熒光顯微鏡觀n t 單個綠熒光蛋白分 子在纖維原細胞膜上的運動。通過對熒光分子的追蹤發(fā)現(xiàn)，綠熒光蛋白分子容易 形成低聚物，形成低聚物后，擴散系數(shù)下降了1 0 到4 0 。g o u l i a n 等人 1 8 】將 藻紅蛋白分子注射到非洲綠猴腎表皮細胞中，觀測了單個蛋白分子在細胞質(zhì)、細 胞核中的擴散，記錄下了分子的二維運動軌跡( 對應(yīng)分子三維運動軌跡在焦平面 上的投影) ，計算出分子的擴散系數(shù)，并對擴散系數(shù)的分布進行了統(tǒng)計。他們發(fā) 現(xiàn)擴散系數(shù)的分布比在甘油溶液中的擴散和簡單擴散的理論分布要寬很多，這說 明不能用簡單擴散特定系數(shù)的模式來說明分子在細胞內(nèi)的運動。k u e s 等【1 9 】將 單個p 4 k 分子標記上4 6 個a l e x a 熒光分子，觀測了單個p 4 k 分子在3 t 3 細胞 核內(nèi)的擴散。他們發(fā)現(xiàn)有的分子在細胞陔內(nèi)擴散運動，有的分子固定在某一位置 不動( 圖1 - 2 ) 。這同以前熒光漂白后恢復(fù)實驗的結(jié)果是一致的。但他們還發(fā)現(xiàn)， 在細胞核內(nèi)擴散的分子也可分為兩部分，一部分擴散距離較遠，而另一部分在一 個相對很小的區(qū)域內(nèi)運動，這可能是因為一些結(jié)合分離的反應(yīng)造成的。他們還 檢測了單個富含鳥苷酸的核蛋白顆粒( u s n r n p ) 在3 3 3 細胞核內(nèi)的運動【2 0 1 ， 4 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 發(fā)現(xiàn)u s n r n p 在細胞核內(nèi)至少有三種不同的擴散動力學(xué)，對應(yīng)著高、中、低三 種不同的擴散系數(shù)。 圖i - 2p 4 k 分子在3 1 3 細胞核內(nèi)的擴散軌跡圖t l g l 。 s e i s e n b e r g e r 等人【2 l 】用單分子追蹤技術(shù)研究了單個病毒對細胞的感染過 程。他們在腺體聯(lián)合病毒上只標記了一個熒光分子c y 5 ，發(fā)現(xiàn)病毒運動到細胞膜 表面的過程為自由擴散，對細胞膜撞擊幾次后，有大約1 5 的病毒分子進入細胞， 進入細胞的過程在6 0m s 內(nèi)完成，比預(yù)想的要快通過對細胞內(nèi)單分子運動軌 跡的觀測以及擴散系數(shù)的計算，他們發(fā)現(xiàn)有的病毒在細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)運動較 慢，這可能是因為它們包含在內(nèi)涵體中；有的病毒作自由擴散，運動較快；還有 大約1 0 的病毒是通過馬達蛋白或管狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)作定向運動。單病毒追蹤技術(shù)對 于人們認識病毒對細胞的感染過程有很大的作用。l a k a d a m y a l l 等人 2 2 1 用熒 光顯微鏡研究了單個流感病毒對細胞的感染以及與內(nèi)涵體融合的過程，實驗發(fā) 現(xiàn)，流感病毒的運動明顯分為三個階段：首先是在細胞外周由肌動蛋白介導(dǎo)的運 動，其次是動力蛋白控制的快速運動到達細胞核周圍，最后是在細胞核周圍區(qū)域 在微管上的運動。這個發(fā)現(xiàn)證實了以前病毒內(nèi)吞過程的假設(shè)，說明內(nèi)涵體的成熟、 酸化主要是在細胞核周圍進行的。 1 2 2 分子構(gòu)象動力學(xué) 分子的性質(zhì)和構(gòu)象是密切相關(guān)的研究分子的構(gòu)象對了解它的功能至關(guān)重 要。分子的構(gòu)象變化主要包括分子折疊和分子旋轉(zhuǎn)。 分子的折疊分子的折疊指的是分子的一部分相對于另一部分的距離發(fā)生變 化。迄今為止，測蛋白質(zhì)總體折疊展開的實驗已經(jīng)進行了許多，但是由于分子的 山東太學(xué)碩十學(xué)位論文 折覆反應(yīng)是不同步的因此，這些實驗不能得到詳細的動力學(xué)信息。只有在單分 子水平上對分子的構(gòu)象變化進行檢測，才能檢測到分子構(gòu)象變化的中自j 狀態(tài)，并 檢測到分子構(gòu)象變化的不同途徑。熒光共振能量轉(zhuǎn)移( f r e t ) 是一種非常有效 的測定距離的方工。它一般用來測量2 - 8n m 的距離，因為它可提供分子兩點之 間距離變化的信息，因此成為研究分子折疊的主要方法【2 3 】。在這種方法中， 在分子的兩個特定位置分別標記上熒光共振能量轉(zhuǎn)移的供體( d ) 和受體( a ) ( 圖1 3 ) ，當(dāng)分子處于折疊狀態(tài)，供體和受體之間距離近，能量轉(zhuǎn)移效率大， 供體的熒光強度小，而受體的熒光強度大。分子處于展丌狀態(tài)時，供體和受體間 距離變大，能量轉(zhuǎn)移效率低，供體的熒光強度大，而受體的熒光強度小。能量轉(zhuǎn) 移效率e = i i + ( r + r o ) 6 ，r 為供體和受體分子之間的距離，r o 為能量轉(zhuǎn)移5 0 時供體和受體分子之日j 的距離，它與熒光染料分子的性質(zhì)有關(guān)。因此。我們可以 根據(jù)供體和受體熒光強度的變化和能量轉(zhuǎn)移效率的變化束推斷分子折疊狀態(tài)的 變化 圈= 函 v h 咄n 口m 鏨 v v d n h w n 圖l - 3利用f r e t 檢測分子構(gòu)象變化示意圖。 利用f r e t 檢測分子折疊，一般使用激光共聚焦掃描顯微鏡，用兩個a p d 傲檢測器它們在兩個通道上分別檢測供體和受體分子的光子爆發(fā)。檢測溶液中 的單分子和檢測表面固定的單分子的方法并不完全相同。通過吸附或共價結(jié)合將 分子固定在玻片表面，然后用激光共聚焦掃描顯微鏡或全內(nèi)反射熒光顯微鏡對分 子進行長時間的檢測，檢測時間長度取決于分子的光漂白，一般有幾秒的時間。 這種方法的優(yōu)點是能得到分子性質(zhì)的時間軌跡曲線( 圖l - 4 上圖) ，但分子的表 抑_竽。芒 gpi_k 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 面圓定容易對分子的性質(zhì)形成干擾。對溶液中的單分子進行檢測時，激光激發(fā)溶 液內(nèi)部一個區(qū)域，激光激發(fā)的體積很小( 凡) ，當(dāng)溶液濃度足夠稀時( n m o l j l ) ， 可保證激發(fā)區(qū)域只有一個分子，在大多數(shù)時間內(nèi)，激發(fā)區(qū)域內(nèi)沒有分子。因此檢 測不到信號，當(dāng)有分子通過激發(fā)區(qū)域時，會檢測到光子，這種現(xiàn)象叫做光子爆發(fā)， 通過對光子爆發(fā)的強度、持續(xù)時間等進行檢測，就可以分析分子性質(zhì)。這種方法 的優(yōu)點是不會因為分子與玻片的接觸而影響分子性質(zhì)，但因為分子通過激光激發(fā) 區(qū)域的時間很短( j 】s ) ，不能得到分子的時間軌跡曲線，只能得到分子的性質(zhì)分 布( 圖l - 4 下圖) 【2 】。 2 5 0 2 5 0 1 o 0 o o0 2 5o 5 0o 7 5 鏈丁a r 鼬m o 圖t 一4 檢測不同位置分子構(gòu)象示意圖。上圖為檢測固定的分子，可得到熒光強度的時間 軌跡。下圖為檢測溶液中作擴散運動的分子，可得到能量轉(zhuǎn)移效率的分布 j i a 等1 2 4 用s p f r e t 研究了酵母轉(zhuǎn)錄因子( g c n 4 ) 的折疊和展開他們 將g c n 4 分子固定在玻璃片表面上，因為尿素能使蛋白酵母轉(zhuǎn)錄因子變性，他們 觀察了在不同濃度尿素的作用下，單個分子折疊與展開的反應(yīng)。這個實驗說明了 可以使用f r e t 在單分子水平上研究蛋白分子的折疊j i a 等人【2 5 】使用f r e t 進一步研究了g c n 4 的分子折疊，他們得到了單個分子在不同濃度的尿素溶液 暑i s 委衛(wèi)u i - 芒蹙函 山東大學(xué)確l 學(xué)位論文 中。供體和受體分子的熒光強度時間軌跡曲線，通過對供體和受體分子信號進行 相關(guān)分析，揭示了蛋白分子在1 - 1 0 0n m 的時間范圍內(nèi)性質(zhì)的波動，并說明性質(zhì) 波動是由于結(jié)構(gòu)的波動造成的為了避免表面固定給分子折疊性質(zhì)造成干擾， d e n i z 等【2 6 】研究了溶液中自由擴散的單個胰蛋白酶抑制劑分子2 ( c 1 2 ) 的折 疊反應(yīng)。在緩沖溶液中。加了不同濃度的氯化胍，使蛋白質(zhì)變性，然后比較了它 們的折疊反應(yīng)。通過鑒別不同氯化胍濃度下能量轉(zhuǎn)移效率的柱狀圖，就可直接觀 察折疊狀態(tài)和交性狀態(tài)的亞分布。因為每個分子在激發(fā)光柱內(nèi)停留時間很短( 大 約為1 微秒) ，所以不能得到分子的時間軌跡曲線。s c h u l e r 等人 2 7 1 也使用 f r e t 研究了在不同濃度的變性溶液中，自由擴散的蛋白分予的折疊反應(yīng)，通過 對能量轉(zhuǎn)移效率柱狀圖的分析，得出了蛋白分子在折疊過程中要經(jīng)過一個能壘， 能壘包括活化能，這與蛋白折疊的理論統(tǒng)計結(jié)果是一致的。最近b o u k o b z a 等人 【2 8 ，2 9 】將單個腺苷酸激酶的分子放入表面固定的脂質(zhì)小泡中，小泡體積足夠大， 可使蛋白質(zhì)分子在其內(nèi)部自由擴散，避免了表面固定給分子性質(zhì)造成的干擾，麗 小泡又固定在玻璃表面上( 圖1 5 ) ，所以蛋白質(zhì)分子在激發(fā)光柱內(nèi)停留較長時 間，有利于長時間地觀察它的折疊反應(yīng)。他們得到了各種條件下能量轉(zhuǎn)移效率的 分布圖，也得到了單個分子時間軌跡曲線。 - m - _ 圖1 s 脂泡與蓋玻片連接示意圖【2 8 】 利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移對分子折疊的研究除應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子外，還可應(yīng)用 于r n a 分子。h a 等人【3 0 】用這種方法研究了r n a 分子在結(jié)合核糖體蛋白s 1 5 山東大學(xué)碩士擎位論文 和m 9 2 + 以后的構(gòu)象變化，在實驗中觀察到r n a 的構(gòu)象分布很寬，說明不同的 r n a 分子的折疊能力是不一樣的。在改變m 礦+ 濃度時，得到的熒光共振能量轉(zhuǎn) 移效率分布也隨m f + 的濃度改變而改變，因此可用單個r n a 分子在2 0r l l s 的時 間分辨上檢測瞬時的m 9 2 + 濃度。z h u a n g 等人【3 1 】用這種方法研究了單個四膜 蟲核糖酶分子的構(gòu)象動力學(xué)，核糖酶是一種含有約4 0 0 個核苷、具有催化作用的 r n a ，它的催化活性受構(gòu)象狀態(tài)的影響他們在核糖酶分子的特定部位上標記上 熒光供體和受體分子，進行表面固定，然后觀測了f r e t 的時間軌跡f r e t 時 間軌跡很清楚地顯示出這種r n a 分子的折疊動力學(xué)在折疊的起始階段，熒光 共振能量轉(zhuǎn)移效率逐漸增加，在達到折疊狀態(tài)的水平之前，在一個中間水平上停 留短暫的時間，這說明存在一個中間折疊狀態(tài)。由多次熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率的 時間軌跡統(tǒng)計，得出兩個不同的折疊速率常數(shù)，其中快的折疊方式，在以前的研 究中沒有發(fā)現(xiàn)，說明發(fā)現(xiàn)了r n a 分子有一種新的折疊途徑b a r t l c y 等人 3 2 】 進一步研究了單個四膜蟲核糖酶分子的折疊動力學(xué)，他們發(fā)現(xiàn)折疊有幾個途徑， 不同途徑之間的轉(zhuǎn)換須克服能量，這樣就阻止了不同途徑之間的轉(zhuǎn)換。z h u a n g 1 3 3 】還利用這種方法研究了另外一種r n a 酶，發(fā)夾核糖酶的折疊動力學(xué)和功能 之間的關(guān)系。他們發(fā)現(xiàn)配合物分子有四種不同的折疊狀態(tài)，這四種折疊狀態(tài)的穩(wěn) 定性各不相同，而核酸酶分子具有記憶功能，每個分子在展開后，趨向子再折疊 回原來的狀態(tài)。 對單分子折疊構(gòu)象的研究，除了利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法外，還可以利用 熒光的自猝滅，電子轉(zhuǎn)移猝滅、熒光成像、熒光壽命等方法來研究蛋白質(zhì)的折疊 反應(yīng)。z h u a n g 等f 3 4 】利用熒光的自猝滅研究了單個t i t i n 分子的折疊反應(yīng)當(dāng) 兩個特定的熒光分子靠近時，由于分子間的相互反應(yīng)而使熒光猝滅，增加它們的 距離，就會減弱它們的反應(yīng)，使熒光強度增加將兩個熒光分子標記在同一個分 子的不同的兩個部位，就可以觀測它們的構(gòu)象變化。由于在自猝滅實驗中，只需 要一種熒光染料分子，熒光分子的標記過程要比f r e t 簡單。1 9 9 7 年，j i a 和合 作者【3 5 】將t r n a 進行熒光標記，通過觀測熒光的衰減來研究r n a 的構(gòu)象動 力學(xué)。他們在實驗中發(fā)現(xiàn)，熒光的衰減是非指數(shù)形式，這是因為r n a 分子的構(gòu) 象在兩種狀態(tài)之間波動，其中一種構(gòu)象狀態(tài)對熒光探針分子有猝滅作用。說明 t r n a 分子經(jīng)歷了兩個不同熒光壽命的構(gòu)象狀態(tài)。將電子轉(zhuǎn)移熒光猝滅應(yīng)用于研 9 山東大學(xué)碩七學(xué)位論文 究單分子d n a 的構(gòu)象實驗在1 9 9 6 年首次被報導(dǎo)。e d m a n 等【3 6 】在單分子水平 上將四甲基羅丹明( t m r ) 分子標記在d n a 分子上，利用共聚焦顯微鏡檢測到 有兩種不同熒光壽命的t m r 分子，說明有兩種不同構(gòu)象狀態(tài)的d n a 分子。1 9 9 8 年，e g g e l i n g 等【3 7 】利用電子轉(zhuǎn)移熒光猝滅研究了d n a 分子的構(gòu)象變化，他 們在d n a 分子的一條鏈的一端標記了熒光染料t m r ，當(dāng)d n a 分子處于折疊狀 態(tài)，熒光分子t m r 與d n a 鏈上的鳥苷酸靠近，發(fā)生從t m r 到鳥苷酸的電子轉(zhuǎn) 移，使t m r 的熒光被猝滅，這時熒光分子t m r 的熒光強度弱，熒光壽命短。 當(dāng)d n a 分子處于展開狀態(tài)時，熒光分子t m r 與d n a 鏈上的鳥苷酸分開，熒光 分子t m r 的熒光強度強，熒光壽命長。他們第一次在單分子水平上同時測得了 熒光強度和熒光壽命，檢測出了t m r 標記的d n a 分子有三種構(gòu)象狀態(tài)。( 圖 1 - 6 ) a 一 觚 囪一豳 + 圖l - 6 利用電子轉(zhuǎn)移猝滅檢測d n a 分子構(gòu)象示意圖【3 7 。 a 熒光壽命的分布圖；b 三種不同的熒光壽命所對應(yīng)的三種構(gòu)象。 b 分子的旋轉(zhuǎn)分子旋轉(zhuǎn)是指整個分子或分子的一部分相對于另一部分做旋 轉(zhuǎn)運動。對于獲得方向變化的動力學(xué)信息來說，單分子熒光偏振( s m f p a ) 是一 種很有效的方法由于單個熒光分子具有唯一的固有吸收和發(fā)射偶極距，可以通 1 0 譬_r-舌 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 過使用偏振激發(fā)光或通過測熒光的偏振或?qū)烧呦嘟Y(jié)合，來確定單個熒光分子的 空間取向。將熒光分子標記在生物大分子的某一特定部位，實時地分析單個熒光 分子的偏振狀態(tài)的變化，就可以了解生物大分子的構(gòu)象狀態(tài)及其變化的動力學(xué)過 程。在s m f p a 中，熒光分予的標記主要有兩種方式【3 8 】：一是將熒光分子緊密 的標定在生物大分子上。這種標記可通過使用蛋白質(zhì)內(nèi)的疏水囊、在核酸內(nèi)嵌入 染料分子、或同時在兩個部位用共價鍵連接來實現(xiàn)。由于熒光分子緊密的固定在 生物大分子上，它將隨生物分子的某一部位一起旋轉(zhuǎn)，因此通過測熒光偏振，就 可得出有關(guān)生物分子方向變化的信息。還有一種標記方式是“系留標記”，將熒 光分子“系”在生物分子上，這時候熒光分子旋轉(zhuǎn)運動的自由程度受周圍微環(huán)境 的影響，因此我們可以通過觀測熒光分子旋轉(zhuǎn)運動的自由程度的變化來研究生物 分子的性質(zhì)。 在這方面研究比較多的分子是肌動蛋白絲和a t p 酶。s a s e 等【3 9 】首次將 s m f p a 應(yīng)用于生物系統(tǒng)。他們研究了肌動球蛋白馬達分子中肌動蛋白分子沿著 固定予玻璃表面的肌球蛋白的軸向轉(zhuǎn)動。肌動蛋白用四甲基羅丹明熒光分子標 記，記錄垂直與水平偏振熒光的像來分析每個發(fā)光點的發(fā)射偏振。結(jié)果顯示肌動 蛋白的旋轉(zhuǎn)比它本身的螺旋要俠得多，因此說明肌球蛋白不是沿著肌動蛋白“走 動”而是“跳動”前進。很多人 4 0 , 4 1 用s m f p a 研究7a t p 水解酶的分子旋轉(zhuǎn) 運動。a d a c h i 等人t 4 2 1 用兩種方法檢測了a t p 水解酶的分子旋轉(zhuǎn)運動 a b 1 。， 一 。一 ，一， 二 j + ：一 ， ?1 f 2 一一 ，一、暑| 一 榔嬲蝴燃 = = = = ，篇噸陋咬建妻 一一j 一，帶“： ， ：j 哆一”二。”。一= “4 vjq暑o置量暑鼉葛，。 d l暑l 山東大學(xué)碗 學(xué)位論立 圈1 7a 旋轉(zhuǎn)分子熒光幽象的時間軌跡；b 標記在無活性的y 甄基上的分子熒光圈象 的時問軌跡；c 熒光強度的時問軌跡和計算出來的熒光分子的角度：d 分步旋轉(zhuǎn)的時問過程。 e 兩步間停留時間的分布圈 4 2 1 。 他們在a t p 合成酶的旋轉(zhuǎn)亞基( y 亞基) 上緊密地標記上一c y 3 熒光分子熒 光探針分子的旋轉(zhuǎn)代表著y 亞基的旋轉(zhuǎn)單個探針分子的旋轉(zhuǎn)，可使用兩個方法 測定：( 1 ) 基于吸光效率的偏振( 2 ) 基于發(fā)射熒光的偏振。在第一種方法中。 激發(fā)光偶極在樣品平面內(nèi)連續(xù)旋轉(zhuǎn)，熒光探針分子的發(fā)射偶極和激發(fā)偶極平行 對，分子發(fā)出熒光。從圖l - 7 a 可明顯地看到熒光分子的旋轉(zhuǎn)。根據(jù)圖1 - 7 a 計算 出熒光強度，分子角度隨時問的變化( 圖1 7 ) ，通過許多時間軌跡曲線，得出 兩步旋轉(zhuǎn)之間停留時間的柱狀圖。這些結(jié)果有力地說明了a t p 合成酶y 亞基旋 轉(zhuǎn)是1 2 0 一步的在第二種方法中，熒光被分解為垂直光( v ) 和水平光( h ) ， 并且同時測量。從圖4 a 可看出y 亞基的旋轉(zhuǎn)。根據(jù)熒光強度的記錄可計算出熒 光偏振( i v - h i i v + h i ) 。熒光偏振顯示三個水平a 、b 和c ( 圖l - 8 ) ，說明旋轉(zhuǎn) 方向被1 2 0 分開，再一次說明了r 亞基的旋轉(zhuǎn)是每一步旋轉(zhuǎn)1 2 0 一一 圖i - s a 熒光分子的熒光圈象；b 垂直偏振光和水平偏振光強度的時間曲線。c 總熒光 強度( v + h ) 和熒光偏振的時問曲線；d a 、b 和c 表示的方向示意圈【4 2 1 1 2 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 2 3 酶動力學(xué) 對于單個分子催化過程的研究被稱為單分子酶學(xué)。按熒光物質(zhì)的不同可將 單分子酶實驗分為四種方法【4 3 】： ( 1 ) 測底物的熒光。小的底物分子在溶液中擴散停留在激發(fā)光體積內(nèi)的時 間大約為1 0ns 1 m s 。如果具有熒光特性的底物分子能和酶結(jié)合較長時間，就能 被檢測。y a n a g i d a 小組【4 4 】用具有熒光特性的a t p 衍生物觀測了單個肌動蛋白 分子上的a t p 水解酶。這種方法的缺點是為抑制噪聲，必須保持較低的底物濃 度( 叫m ) ，這樣就限制了轉(zhuǎn)化率。 ( 2 ) 測產(chǎn)物熒光的組合。 x u e 和y e u n g 4 5 】研究了毛細管中的單個乳酸脫氫酶分子，乳酸脫氫酶是 一種能將肝臟和心臟內(nèi)的乳酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)楸猁}的酶，在這個催化過程中伴隨著 有從n a d + 到n a d h 的反應(yīng)，n a d h 是能發(fā)熒光的，這樣就可以很容易地檢測 它的形成。實驗發(fā)現(xiàn)不同的酶分子催化效率也不相同。c r a i g 等人 4 6 】用同樣 的方法檢測了堿性磷酸酶。他們將單個堿性磷酸酶分子置于毛細管中，毛細管中 充滿反應(yīng)底物，底物在酶的催化作用下生產(chǎn)能發(fā)熒光的產(chǎn)物，通過對產(chǎn)物熒光強 度的檢測，就能檢測出對應(yīng)的單個堿性磷酸酶分子的催化活性。實驗證明，在相 同的孵育溫度下，不同的酶分子活性是不同的，活性最強的分子是活性最弱分子 活性的1 0 倍。e d m a n 等 4 7 】通過測產(chǎn)物的熒光檢測了單個辣根過氧化物酶分 子。他們將單個辣根過氧化物酶分子固定在玻片表面，加入底物二氫羅丹明6 g ， 底物在辣根過氧化物酶的催化下，被氧化為羅丹明6 g ，然后使用c l s m 結(jié)合 a p d 檢測產(chǎn)物羅丹明6 ( 3 的熒光。實驗證明，在不同位置，羅丹明6 g 的熒光強 度是不同的，這說明不同的酶分子催化效率是不同的，這是因為它們的構(gòu)象不同 造成的。很多酶的反應(yīng)受產(chǎn)物釋放的限制，不能用這種方法來檢測。這種方法的 優(yōu)點是不須考慮光漂白，因為可以產(chǎn)生熒光的產(chǎn)物分子不斷生成，并且不斷擴散 到激發(fā)光體積以外。 ( 3 ) 測酶的熒光l u 等f 4 8 】在1 9 9 8 年第一次研究了酶自身的熒光，通過 檢測膽固醇氧化酶中發(fā)熒光的活性部位( f a d ) 發(fā)出熒光的變化，研究了酶的反 應(yīng)。膽固醇氧化酶( e ) 包括一個活性部位f a d ，f a d 在它的還原態(tài)不發(fā)熒光， 但在它的氧化態(tài)發(fā)熒光，在催化反應(yīng)中，f a d 首先被膽固醇還原為f a d h 2 ，然 “l(fā) 東人學(xué)耐| l 。擘付論殳 后又被0 2 氧化，產(chǎn)生h 2 0 2 通過實時檢測單個酶分子發(fā)出的熒光變化，就可監(jiān) 測酶的催化反應(yīng)速率( 圖1 9 ) 。實驗發(fā)現(xiàn)了酶分子的記憶現(xiàn)象，即酶分子的翻 轉(zhuǎn)與前一次的翻轉(zhuǎn)是有聯(lián)系的，這是因為蛋白分子構(gòu)象的緩慢波動造成的x i e 研究的為酶活性的動力學(xué)混亂提供了有力的證據(jù)。 圖l 母膽崩酵氧化酶催化反應(yīng)以及單個酶分子熒光強度隨時間的變化圖【4 8 1 。 ( 4 ) 因為生物分子一般不發(fā)熒光，所以在大多數(shù)酶的催化反應(yīng)中，底物分 子、酶分子和產(chǎn)物分子都是不發(fā)熒光的，以上方法受到很大限制。這就需要對生 物分子進行熒光標記。而分子間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移特別適合用來研究酶分子和 底物的結(jié)合和分離。和分子內(nèi)的f r e t 不同，分子蚓的f r e t 是將熒光共振能量 轉(zhuǎn)移對的供體和受體標記在兩個不同的分子上，當(dāng)兩個熒光標記的分子結(jié)合時， 供體和受體之問距離近，能量轉(zhuǎn)移效率大，供體熒光強度小，受體熒光強度大 當(dāng)兩個熒光標記的分子分離時，供體和受體之間距離變大，能量轉(zhuǎn)移效率小，供 體熒光強度大，而受體熒光強度小。因此，通過監(jiān)測供體和受體熒光強度的變化， 就可推知催化反應(yīng)的狀態(tài)及酶的催化機理。h a 等【4 9 用分子問