應(yīng)用熒光探針活性氧檢測(cè)技術(shù)對(duì)細(xì)胞光生物學(xué)效應(yīng)的初步研究?jī)?yōu)秀畢業(yè)論文.pdf

中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院 中國人民解放軍總醫(yī)院 碩士學(xué)位論文 應(yīng)用熒光探針活性氧檢測(cè)技術(shù)對(duì)細(xì)胞光生物學(xué)效應(yīng)的初步研究 姓名 李曉松 申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別 碩士 專業(yè) 激光醫(yī)學(xué) 指導(dǎo)教師 劉凡光 顧瑛 20040501 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文 縮略詞表 英文縮寫 c c d d c f d m e m d m s o e s r h d c f 縮略詞表 英文全名中文譯名 c h a r g e c o u p l e dd e v i c e電荷耦合器件 d i c l l l o r o n u o r e s c e i l l雙氟熒光素 c c o n e a 咄s m e a i 岫霉黑慧的 d i n l e m y ls u l f o x i d e二甲基亞砜 e l e c 拓o ns p hr e s o n a n c e 電子自旋共振法 2 7 d i c h l o r o d i h y d r o n u o r e s c e i n雙氯雙氫熒光素 h 2 d c f 樅2 d i 洲o r o d m y d r o n u o r e s c 豳 d l a c e t i t e h n 眥 h o h 2 0 2 h p d l s c m 雙氯雙氫熒光素 雙乙酸鹽 h e m a t o p o q 岫m o n o m e n l y l e i h e r 血卟啉單甲醚 h y d r o 珂l r a d i c a l羥自由基 h y d r o g e np e r o x i d e過氧化氫 h e m a t o p o q h 砬l d e r i v a t i v e 血卟啉衍生物 l a s e r s c a n n n g c n r o c d s c 卵e 羹囊袈釜微鏡 一1 一 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文 縮略詞表 英文縮寫 l l i t m 佃 n a d h 0 2 一 1 0 2 p b s p m t p d t r o s 英文全名中文譯名 l o wl e v e ll a s e r t h e r a p y弱激光療法 m i t o c h o n d r i a lm e l b r a n e p e m e a b i l 時(shí)線粒體膜通透性 r e d u c e df o n no f n i c o t i n a m i d e a d e n i r l ed i n u c l e o t i i i e 還原型煙酰胺 腺嘌呤二核苷酸 s u p e r o x i d e a i l i o nr a d i c a l超氧陰離子 s i l l g l e to x y g e n 單線態(tài)氧 p h o s p h a t eb u 船r e d s a l i i l e 磷酸鹽緩沖液 p h o t o 舢l t i p l i e rt u b e光電倍增管 p h o t o d y n a m i ct h e f a p y光動(dòng)力療法 r e a c t i v eo x y g e n s p e i c e s活性氧 一2 一 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文 中文摘要 應(yīng)用熒光探針活性氧檢測(cè)技術(shù)對(duì)細(xì)胞 光生物學(xué)效應(yīng)的初步研究 摘要 目的 應(yīng)用熒光探針活性氧檢測(cè)技術(shù)對(duì)單純光照過程以及血卟啉單甲醚 介導(dǎo)的光動(dòng)力反應(yīng) h m m e p d t 過程中人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株e c v3 0 4 細(xì)胞內(nèi)的活性氧產(chǎn)生情況進(jìn)行檢測(cè) 方法 1 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的建立 分別利用激光掃描共聚焦顯微鏡和c c d 熒 光顯微鏡采集e c v3 0 4 細(xì)胞的d c f 熒光圖像 并比較兩者的成像質(zhì)量 實(shí)驗(yàn) 可操作性等技術(shù)指標(biāo) 主要測(cè)量輸出功率 功率穩(wěn)定性以及光斑直徑這三個(gè)指 標(biāo) 考察熒光顯微鏡的高壓汞燈作為本研究中照射光源的可行性 比較并選擇 合適的熒光圖像的分析與處理方法 2 單純光照時(shí)e c v3 0 4 細(xì)胞內(nèi)活性氧 產(chǎn)生位置的確定 將細(xì)胞接種于3 5 m m 培養(yǎng)皿中 孵育2 4 h 孵育結(jié)束前3 0 m i n 加入h 2 d c f d a 孵育濃度為1 0 鄴n d 兒 同時(shí)加入線粒體標(biāo)記探針m i t o f l u o r r e d5 8 9 孵育濃度1 0 0 衄o l l 利用熒光顯微鏡的激發(fā)光源作為照射光源 分別采集同一細(xì)胞的d c f 的熒光圖和m i t o f l u o rr e d5 8 9 的熒光圖 通過比較 各細(xì)胞分區(qū)內(nèi)d c f 熒光的平均強(qiáng)度 i j 與細(xì)胞內(nèi)d c f 熒光的平均強(qiáng)度 1 2 之比來確定d c f 分布位置 3 塒m d e p d t 和單純光照時(shí)e c v3 0 4 細(xì)胞內(nèi) 活性氧產(chǎn)量的監(jiān)測(cè) 在孵育結(jié)束前4h 前加入h m m e 孵育濃度為l on m 1 不加入探針m i t o f l u o rr e d5 8 9 其他實(shí)驗(yàn)步驟與上部分研究相同 在光照的同 時(shí)連續(xù)采集兩組細(xì)胞的d c f 熒光圖 采用圖像分析和處理技術(shù) 求得兩組細(xì) 胞內(nèi)不同照射時(shí)間點(diǎn)d c f 平均熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化情況 據(jù)此繪制熒光強(qiáng) 度 時(shí)間曲線 結(jié)果 1 c c d 熒光顯微鏡采集到的d c f 熒光圖像的質(zhì)量?jī)?yōu)于共聚焦 顯微鏡 同時(shí)綜合考慮包括采圖質(zhì)量 光照射劑量的可控性 實(shí)驗(yàn)成本和操作 簡(jiǎn)便性等諸多因素 最終確定了c c d 熒光顯微鏡作為實(shí)驗(yàn)研究的工具 熒光 一3 一 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文中文摘要 顯微鏡的汞燈輸出功率穩(wěn)定 光斑均勻 經(jīng)本實(shí)驗(yàn)所選取的光路系統(tǒng)后輸出波 長(zhǎng)范圍為4 6 0 4 9 0 姍 功率密度約為1 0 0m w c m 2 細(xì)胞器一細(xì)胞熒光強(qiáng)度比 值法對(duì)于熒光分布位置的確定優(yōu)于其他方法 2 單純光照時(shí)e c v3 0 4 細(xì)胞 內(nèi)d c f 熒光緩慢增強(qiáng) 經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析 參數(shù)m 取不同值時(shí)線粒體區(qū)內(nèi)i l 1 2 值均 明顯高于細(xì)胞核區(qū)和細(xì)胞質(zhì)非線粒體區(qū) m 2 0 時(shí)的線粒體區(qū) 細(xì)胞質(zhì)非線 粒體區(qū)內(nèi)i l 1 2 值與細(xì)胞核區(qū)內(nèi)i l m 值分別為1 9 4 9 士0 2 2 1 0 7 2 5 土0 0 8 3 1 11 3 土0 2 2 6 經(jīng)方差分析顯示三者之間的差異有顯著意義 3 h m m e p d t 組細(xì)胞內(nèi)d c f 熒光分布區(qū)域與單純光照組類似 盡管單純光照的因素參與其 中 但通過比較兩者的變化趨勢(shì) 發(fā)現(xiàn)此區(qū)域內(nèi)d c f 熒光變化的速度 h m h 伍一p d t 組較單純光照組快 前者在第2 8s 時(shí)即上升至第2s 時(shí)5 9 8 倍 且由于r o s 的大量產(chǎn)生 熒光淬滅迅速 而后者第6 0s 時(shí)上升至第2s 時(shí)的 4 6 9 倍 間接證明h m m e p d t 早期d c f 熒光的分布的主要位置是線粒體 結(jié)論 利用熒光探針活性氧檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的活性氧 方法簡(jiǎn)便可 靠 單純光照可致e c v3 0 4 細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生 且主要位于線粒體內(nèi) 這可 能與線粒體內(nèi)源性光敏物質(zhì)豐富有關(guān) 內(nèi)源性光敏物質(zhì)在光照激發(fā)時(shí)所產(chǎn)生的 活性氧可能是引起弱激光生物學(xué)效應(yīng)的重要物質(zhì) m 訂m e p d t 時(shí)細(xì)胞線粒體 內(nèi)活性氧產(chǎn)量明顯高于其他區(qū)域 線粒體微環(huán)境可能影響了光化學(xué)反應(yīng)的速 率 線粒體是h m m e 介導(dǎo)的光動(dòng)力反應(yīng)早期損傷的靶位點(diǎn) 關(guān)鍵詞活性氧 h 2 d c f d a 光動(dòng)力療法 弱激光治療 線粒體 熒光顯徼鏡 4 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文英文摘要 p r e l i m i n a r ys t u d y o nc e l l u l a r p h o t o b i o l o g i c a l e f f b c t b y r e a c t i v eo x y g e n s p e c i e s d e t e c t i o n t h r o u g h f l u o r e s c e n t p r o b e t e c h n i q u e a b s t r a c t d 巧p c 咖p t ol e mt h eg e n e r a t i o no fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s r o s d u r i n g l 遠(yuǎn)h t o n l y i r r a d i a t i o na n d d l l r i i l gp h o t o d y n a m i c r e a c t i o ni n d u c e d b y h e m a t o p o i p l l y r i nm o n o m e 吐1 y le m e r i m p d t w i t l ln u o r e s c e m m i c r o s c o p e a i l dh 2 d c f d a 肘a 咖d d 譬 1 t h e d e v i c ef o r s t u d y w a sd e t e m i n e db y c o m p a r i n gm e f l u o r e s c e n ti m a g e so b t a i n e db yl a s e rs c a l l l l i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p ea n dc c d f l u o r e s c e mm i c r o s c o p er e s p e c t i v e l y t h em e f c u r y a r cl a m po ff l u o r e s c e n t m i c r o s c 叩ew a ss t u d i e dt ov a l u ei t sp o s s i b i l i t t ob eu s e da s 也ei r r a d i a t i o n l i g h t s o l l r c e l r i o u s i i l l a g ea n a l y z i n g a i l d p r o c e s s 訕g m e t l l o d sw e r e c o m p a r e d t od c t e m i n ew h i c ho n ew a st l l eb e s tt ob ea p p l i e di i lm i s s t u d y 2 e c v 3 0 4c e l l sw e r es u b c u l t u r e df b r2 4h h 2 d c f d aw a sa d d e di n t oi t f o r3 0m i i lw i t l lm ef i n a lc o n c e r l 仃a t i o no f1 0 阻n o l l a n d 吐1 eo t h e rp r o b e m o f l u o rr e d5 8 9 w h i c hd i s 廿i b u t e s 協(xié)m n o c h o n d r i as p e c i f i c a l l y w a s a d d e ds 曲u l t a l l e o u s l y w i t l lt 1 1 e 丘n a lc o n c e n a t i o no f1 0 0 n m o l l t h e p r o c e d u r e o f l i g h ti r r a d i a t i o nw a s c a r r i e do u td l l r i n gc 0 1 l e c t i n gm ef l u o r e s c e n t i m a g eo f d c f t h en u o r e s c e n ti m a g e sw e r ec o l l e c t e db yc c df l u o r e s c e n t m i c m s c o p e t h ed i s t r i b u t e ds i t eo f d c fw a sd e t e 衄i n e db yc o m p a r i n gm e n u o r e s c e n c ei m a g e so fm i t o f l u o rr e d58 9a n dd c fo ft t l es 鋤ec e l l t h e v a l u eo f l l 1 2r 印r e s e n t e dm e 啪o u n to f d c fi nd i 行e r e mc e l l u l a rr e g i o n s 一5 一 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文英文摘要 3 h m n 皿w a s a d d e di n t oi tf o r4hw i 也m ef i n a lc o n c e n 廿a t i o no f l o 斗 m 1 m i t o f l u o rr e d5 8 9w a su n n e c e s s a r yi nm i sp a n a 1 1 do m e rp r o c e d u r ea i l d 0 p e r a t i o nw e r es i m i l a rt om ef 確e rp a n t h em e a n n u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f d c fi l lc e i l sa n di t sv a r i e t yw i t l lt i m ew e r ec a i c u i a t e db yi m a g ea n a i y z i n g a n d p r o c e s s i n gt e c h n i q u e r 甜h 凰 1 c c dn u o r e s c e n tm i c r o s c o p ew a ss u p e r i o r t o1 a s e r s c a j l n i n g c o n f o c a lm i c r o s c o p ei n c o l l e c t i n g m en u o r e s c e n t i m a g e o fd c f c c d n u o r e s c e n tm i c m s c o p ew 鵲c h o s e nt ob et h es y s t e ma p p l i e di nt h i sr e s e a r c h w i m 廿l ec o n s i d e r a t i o no f o p e r a t i o n c o s ta n de ta 1 t h em e r c u r y a r cl 鋤po f n u o r e s c e n t m i c r o s c o p e w 船f i tf o rm er e q u i r e m e mo fo u r s t u d y t h e w a v e l e n g mr a n g eo f m e l i g h to u t p u tw a s4 6 0 4 9 0n m a n dm e p o w e rd e n s i 夠 w a sa b o u t1 0 0 m w c m 2 i nm ec o n d i t i o no fo u r s t t l d y o 曜a n e l l e c e l l n u o r c s c e n c ei m e n s i t ym t i o a 1 1 a l y s i sw 韶m o s u i t a b l e t 1 1 a no n l e rm e t l l o d s 2 t h en u o r e s c e n c eo f d c fi ne c v3 0 4c e ni n c r e a s e ds l o w l yd l l r i n gt l l e e a r l ys t a g eo fl i 曲t o n l yi r r a d i a t i o na n dd i s t r i b u t e dm a i n l yi nm i t o c h o n d r i a t h ev a l u eo fi l 1 2i nm i t o c h o n d r i ar e g i o nw 船m u c hh i 曲c rt l l a nm a ti n n u c l e u sr e g i o na i l dn o n m i t o c h o n d r i ac y t o s o lr c g i o n a i l dm ev a l u eo fe a c h w e r e1 9 4 9 士o 2 2 l 1 1 1 3 士o 2 2 6 0 7 2 5 士o 0 8 3r e s p e c t i v e l y w h e np a 鋤e t e r mw a s2 0 3 t h es i t eo f d c fi ne c v3 0 4c e l ld u r i n g 也ee a r l ys t a g eo f h m a 伍 p d ts e e m e dt ob em es 鋤ew i t l lm a to fd c fd l l r i n g l i g h t o n l y i r r a d i a t i o n a i l dm en u o r e s c e n c ei n t c n s i t r o fm ef o m e ri n c r c a s e dm o r e r a p i d l ym a n 血e 1 眥e r t h ef l u o r e s c e n c em e n s i 哆o f l ef o n n e ra t2 8 ms e c o n d w a s5 9 8t i m e so f 也a ta tm e2 ds e c o n d b u tn u o r e s c e n c ei n t e n s i 哆o ft h e l a t t e ra t6 0 也s e c o n dw a s4 6 9t i m e so f m a t a tm e2 n ds e c o n d c b 刀d l 心如一si nm i ss t l l d yw es e tu pas e r i e so fm e t h o dt o d e t e c tm e i 1 1 t r a c e l l u l a r r e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s w i mn u o r e s c e n t m i c r o s c o p e a i l d h 2 d c f d a w h i c h i ss i m p i ea i l dr e i i a b l e t h ei i g h ti r r a d i a t i o nc a ni n d u c et 1 1 e 6 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文 英文摘要 g e n e r a t i o no fr o s a 1 1 d t i l eg e n e r a t e ds i t ew a s m a m l y i nm i t o c h o n d r i a w h i c h m a yb ea s s o c i a t e dw i t hi t sa b u n d a n te n d o g e n e s i sp h o t o s e n s i t i z e lt h er o s g e n e r a t e dd u r i l l g t 1 1 e p h o t o d y n a m i c r e a c t i o nm d u c e d b ye n d o g e n e s i s p h o t o s e n s i t i z e rm a yb et h em a t t e rm a tc a u s e st 量l eb i o l o g i c a le f r e c to f1 0 w l e v e l1 a s e r m e r a p y t h eg e n e r a t i o n o fr o si nm i t o c h o n d r i a d u r i n g h m n m p d tw a sm u c hh i 曲e rm a nt h a ti no 也e rc e l l u l a r r e g i o n s t h e 口h e n o m e n ai n d i c a t e dt h ee f r e c to fm i t o c h o n ai n n e re n v i r o m e n to nt l l e v e l o c i t o fp h o t o d y n 咖i cr e a c t i o n m i t o c h o n d r i aa r e 也em a i ns i t ef o rm e e a d ys t a g eo f 心伍 p d t 丘砂 d 凼 h 2 d c f d a r e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s p h o t o d y n a n l i c m e r a p y l o w 1 e v e l l a s e r m e r 印y m i t o c h o r l d r i a f l u o r e s c e n tm i c r o s c o p e 叮 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文 月u舌 刖菁 1 活性氧及其在激光醫(yī)學(xué)中的重要意義 活性氧是指氧的某些代謝產(chǎn)物和一些反應(yīng)的含氧產(chǎn)物 包括1 0 2 0 2 一 h o h 2 0 2 等 r o s 對(duì)于維持細(xì)胞正常的生理功能和代謝具有極其重要的作 用 目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為光動(dòng)力治療的機(jī)制是由于光敏劑被細(xì)胞或組織吸收 后在特定波長(zhǎng)激光的照射下產(chǎn)生r o s 后者具有細(xì)胞毒作用 它們可進(jìn)一步與 細(xì)胞內(nèi)成分反應(yīng) 從而引起細(xì)胞損傷 r o s 是細(xì)胞殺傷的主要介質(zhì) 這一點(diǎn)已 經(jīng)十分的明確 了解光動(dòng)力反應(yīng)過程中r o s 的產(chǎn)生情況 也就了解了光動(dòng)力 損傷的情況 但是由于r o s 自身性質(zhì)活躍 目前對(duì)于其產(chǎn)生情況尚缺乏足夠 的認(rèn)識(shí) 可對(duì)光動(dòng)力反應(yīng)過程中的r o s 產(chǎn)生情況進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的 單細(xì)胞水 平檢測(cè) 有助于深入理解光動(dòng)力反應(yīng)的損傷效應(yīng) 弱激光治療的應(yīng)用和探索一直是激光醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一 國內(nèi)外相關(guān)的 激光醫(yī)學(xué)科研機(jī)構(gòu)投入了大量的人力 物力和財(cái)力 得到了有一定科學(xué)價(jià)值的 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 但是目前對(duì)于其效應(yīng)機(jī)制尚不明確 許多的假說缺乏實(shí)驗(yàn)依據(jù) 在 總結(jié)了大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上 國外學(xué)者對(duì)于光子對(duì)細(xì)胞非損傷作用的初始 過程形成了一定的共識(shí) 細(xì)胞有兩類光子受體 類是細(xì)胞色素 一類是含有 生色團(tuán)的分子 它們接受光子的能量 并在弱激光生物學(xué)效應(yīng)方面發(fā)揮重要作 用 聯(lián)系到光化學(xué)反應(yīng)的普遍性 以及光動(dòng)力治療與弱激光治療在細(xì)胞生物學(xué) 效應(yīng)上的許多相似性 我們提出r o s 是否是弱激光生物學(xué)效應(yīng)的主要介質(zhì) 發(fā)揮重要作用 這須通過對(duì)單純光照過程中細(xì)胞內(nèi)的r o s 產(chǎn)生情況進(jìn)行檢測(cè) 來驗(yàn)證 深入了解光動(dòng)力反應(yīng)以及g b 激光照射過程中的r o s 產(chǎn)生情況 對(duì)r o s 進(jìn) 行檢測(cè) 對(duì)于理解光動(dòng)力治療和弱激光治療的效應(yīng)機(jī)制均具有積極的意義 2 r o s 的常規(guī)檢測(cè)方法 一8 一 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分 第一部分熒光探針活性氧檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于 細(xì)胞光生物學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的建立 一 熒光圖像采集系統(tǒng) 與實(shí)驗(yàn)光照系統(tǒng)的建立與評(píng)價(jià) 引言 隨著自由基研究的迅速發(fā)展 活性氧作為十分重要的自由基i 在激光醫(yī) 學(xué)相關(guān)研究中的作用日益凸顯出來 然而常規(guī)的r o s 檢測(cè)方法的缺陷限制了 我們對(duì)r o s 進(jìn)一步的深入研究1 2 熒光探針的使用歷史迄今已有一百余年 出現(xiàn)了近千種不同功用的熒光探針 4 在熒光圖像采集技術(shù)上 共聚焦顯微成 像技術(shù)和c c d 顯微圖像技術(shù)作為目前比較成熟的技術(shù) 已得到廣泛的應(yīng)用 6 7 本部分?jǐn)M針對(duì)激光醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的特殊性并結(jié)合本研究的特點(diǎn) 選擇合 適的熒光圖像采集設(shè)備和實(shí)驗(yàn)照射光源 實(shí)驗(yàn)材料 1 細(xì)胞株 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株e c v3 0 4 由本室保存 2 實(shí)驗(yàn)試劑 二甲基亞砜 d m s o 北京石鷹化工廠產(chǎn)品 d m e m 培養(yǎng)基 美國g i b c o 公司產(chǎn)品 胎牛血清 美國g i b c o 公司產(chǎn)品 p b s 液 北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品 胰蛋白酶 美國g i b c o 公司產(chǎn)品 一l l 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分 2 汞燈作為照射光源的可行性 2 1 汞燈輸出功率的測(cè)試 以o l y m p u si x 7 1 型生物熒光顯微鏡為研究對(duì)象 使用激光功率計(jì)測(cè)量汞 燈經(jīng)顯微鏡光路系統(tǒng) 不同衰減片 不同物鏡 并透過3 5m m 培養(yǎng)皿后的最 終輸出功率 2 2 汞燈輸出功率穩(wěn)定性與光斑直徑的測(cè)試 在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過程中不同的時(shí)間點(diǎn) 0 m i n 1 0 m i l l 2 0 r a i n 3 0r a i n 4 0 m i n 5 0m i n 6 0m i n 使用功率計(jì)測(cè)量的輸出功率 共計(jì)測(cè)量3 次 取平均值 以 考察汞燈輸出功率穩(wěn)定性 并使用直尺測(cè)量3 5m m 培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞可實(shí)際接受 照射的光斑直徑 測(cè)量3 次取平均值 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1 兩套系統(tǒng)采集熒光圖像的比較 利用l s c m 和c c d 熒光顯微鏡兩套系統(tǒng)采集得到的熒光圖像見圖1 3 通過對(duì)圖1 3 中的a 與b 的比較 顯示兩者采集的熒光圖像強(qiáng)度適中 均 清晰的呈現(xiàn)了d c f 熒光的分布位置 c c d 熒光顯微鏡在對(duì)于d c f 熒光的成像 質(zhì)量上優(yōu)于l s c m 但是由于l s c m 采集熒光圖像所需的時(shí)間較長(zhǎng) 激光照射 的強(qiáng)度高 此時(shí)的熒光圖像為光照2 0 余秒后的情況 無法抓取早期變化 在 熒光圖像上表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)整體的d c f 熒光強(qiáng)度增高 圖像對(duì)比度稍差 而c c d 熒光顯微鏡采集熒光圖像的時(shí)間短 成像質(zhì)量較高 在作連續(xù)快速的采集時(shí) 仍能清晰的呈現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)節(jié)信息 一1 4 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文第一部分 圖1 1c c d 熒光顯微鏡實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)照片 1 電源2 c c d3 o l y m p u si x7 1 型熒光顯微鏡4 計(jì)算機(jī)5 激光功率計(jì) 圖1 2 激光掃描共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)照片 1 電源2 n i k o nt e 3 0 0 型熒光顯微鏡3 馓光光源4 計(jì)算機(jī) 圖l 3 共聚焦顯徽鏡和c c d 熒光顯微鏡采集的d c f 熒光圖的比較 a 共聚焦顯微鏡成像圖 1 0 0 油鏡 b c c d 熒光顯微鏡成像圖 6 0 熒光物鏡 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分 2 汞燈作為照射光源的可行性評(píng)估 2 1 汞燈輸出功率的測(cè)試 汞燈經(jīng)顯微鏡光路系統(tǒng) 不同衰減片 不同物鏡 并透過3 5m m 培養(yǎng)皿 后的最終輸出功率列子表1 1 表1 1 不同物鏡不同激發(fā)模塊輸出功率 r o w 2 2 汞燈輸出功率穩(wěn)定性與光斑直徑的測(cè)試 因?yàn)樵诓杉痙 c f 熒光中所使用的激發(fā)光源為藍(lán)色 觀察細(xì)胞時(shí)采用的是 6 0 熒光物鏡 所以此條件下 抽取了7 個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量此時(shí)的輸出功率 三次的平均值列于表1 2 表1 2 不同時(shí)間點(diǎn)汞燈藍(lán)色激發(fā)模塊輸出功率 m w 6 0 熒光物鏡 強(qiáng)衰減片 經(jīng)測(cè)量x 6 0 熒光物鏡時(shí) 藍(lán)色激發(fā)模塊輸出時(shí) 3 5i i l i r l 細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)受到 光照的直徑約為1m m 計(jì)算培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞所實(shí)際接受的光照功率密度約為1 0 0 m w e m 2 經(jīng)過上述粗略的測(cè)量 證明熒光顯微鏡的汞燈輸出功率穩(wěn)定 光斑 均勻 x 6 0 熒光物鏡時(shí) 藍(lán)色激發(fā)模塊輸出的功率密度完全符合實(shí)驗(yàn)中作為照 射光源的要求 一1 6 一 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分 討論 l s c m 系統(tǒng)與c c d 熒光顯微鏡系統(tǒng)相比 優(yōu)點(diǎn)在于縱向空間分辨率及對(duì) 激發(fā)波長(zhǎng)與熒光探測(cè)波長(zhǎng)的精確選擇上 l s c m 對(duì)細(xì)胞內(nèi)單一薄層切面的亞細(xì) 胞結(jié)構(gòu)聚焦成像 也即實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的光學(xué)斷層成像 而熒光顯微鏡則不可避免 地存在物鏡焦面前后多層切面干擾光的混疊誤差 在對(duì)多種熒光信號(hào)的選擇激 發(fā) 光譜分離與選擇探測(cè)方面 l s c m 采用單一波長(zhǎng)的激光器光源與窄通帶的 帶通型濾光片 而此系統(tǒng)采用帶通型激發(fā)濾色鏡選擇汞燈的激發(fā)波長(zhǎng) 熒光信 號(hào)的選擇探測(cè)依靠長(zhǎng)波通型吸收濾色鏡外加c c d 面陣前的r g b 三通道選擇 相比之下 l s c m 系統(tǒng)既能更好地避免對(duì)熒光物質(zhì)的交叉激發(fā) 又能對(duì)激發(fā)出 的熒光信號(hào)在進(jìn)入探測(cè)器前進(jìn)行更加精細(xì)的光譜選擇與分離 更有利于徹底消 除多種熒光間的光譜串色干擾 但l s c m 的參數(shù)較多 包括c o r 怕c a l 共聚焦 p i n h o l c 針孔 d e t e c t o r 檢測(cè)器 p m t 光電倍增管 s t e ps i z e 掃描步長(zhǎng) 等十余個(gè) 這些參數(shù) 的選擇或設(shè)置 彼此之間有著非常密切的關(guān)系 因而 對(duì)各個(gè)參數(shù)的選擇應(yīng)當(dāng) 綜合考慮 而且除了要考慮各個(gè)參數(shù)之間的關(guān)系外 還要考慮所要觀察的細(xì)胞 類型及大小 熒光染料種類及濃度 是做形態(tài)學(xué)觀察還是做細(xì)胞的生理 生化 指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化觀測(cè)等諸多因烈 參數(shù)選擇的好壞最終決定了采集到的熒光 圖像的質(zhì)量 c c d 熒光顯微鏡在對(duì)于d c f 熒光的成像質(zhì)量上優(yōu)于l s c m 究其原因可 能是由于本研究中d c f 熒光強(qiáng)度變化相對(duì)較快 l s c m 在成像時(shí) 由于p m t 點(diǎn)掃描時(shí)間較長(zhǎng) 激光照射強(qiáng)度高 很難抓取d c f 熒光的早期變化 在進(jìn)行 連續(xù)動(dòng)態(tài)采集時(shí) 使用l s c m 成像 由于縮短了掃描時(shí)間 其采集的圖像只能 用于圖像分析時(shí)使用 而無法分辨細(xì)胞內(nèi)的細(xì)節(jié) 而c c d 熒光顯微鏡由于其 c c d 的面陣大 使其成像視野大 成像時(shí)間大大縮短 細(xì)節(jié)呈現(xiàn)效果較好 2 另外考慮到設(shè)備普及率 操作使用的便捷性 實(shí)驗(yàn)費(fèi)用成本 以及采圖時(shí)間等 方面比較 c c d 熒光顯微鏡均較l s c m 具有明顯優(yōu)勢(shì) 一1 7 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分 綜合考慮已上種種因素 我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)研究中選擇了c c d 熒光顯微鏡作 為主要的研究工具 激光作為特殊的光源 具有單色性好 方向性好 相干性好 偏振性好 亮度高等特點(diǎn)口 狹義的激光醫(yī)學(xué)中所應(yīng)用到的光源指的激光光源 不過這對(duì) 于實(shí)驗(yàn)條件的要求高 一個(gè)實(shí)驗(yàn)室很難具備所有應(yīng)用于激光醫(yī)學(xué)研究中所需的 不同波長(zhǎng)的光源 而且涉及到光源照射系統(tǒng)與顯微鏡的吻合問題等諸多問題 實(shí)際上 只要光強(qiáng)度足夠 包括激光 脈沖或連續(xù) 氙燈 汞燈在內(nèi)的 許多光源均可激發(fā)光敏劑而產(chǎn)生活性氧 我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中擬將熒光顯微鏡的熒光 采集激發(fā)光作為照射光源 這里即對(duì)熒光顯微鏡的汞燈經(jīng)其光路和物鏡系統(tǒng)后 的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè) 以衡量其作為光源照射的可行性 測(cè)量激光功率的方 法最常用的是光熱法和光電法 但是兩者所使用的激光功率計(jì)都有一定的響應(yīng) 波長(zhǎng)范圍 4 由于受到實(shí)驗(yàn)儀器的限制 我們選用了l l m 3 型激光功率計(jì) 5 3 2 n m 時(shí)的校正系數(shù)為2 0 3 對(duì)其進(jìn)行了粗略的測(cè)試 在激光醫(yī)學(xué)的實(shí)驗(yàn)中 光源的照射劑量是十分重要的 可是在應(yīng)用熒光探 針技術(shù)時(shí) 無論是c c d 熒光顯微鏡還是激光掃描共聚焦顯微鏡 在采集熒光 圖像的時(shí)候都需要激發(fā)光的參與 而且為了保證采集到的熒光圖像的質(zhì)量 激 發(fā)光的強(qiáng)度往往很高 這對(duì)于準(zhǔn)確計(jì)量光照射劑量是不利的 所以在本研究中 光源照射的時(shí)機(jī)最好選在熒光圖像采集的同時(shí) 兩者同步進(jìn)行 如果將熒光顯 微鏡用于熒光采集時(shí)的激發(fā)光源作為照射光源 對(duì)受試細(xì)胞進(jìn)行照射 同時(shí)采 集d c f 的熒光圖像 這種方法使得實(shí)驗(yàn)過程更為簡(jiǎn)單 光照射劑量容易準(zhǔn)確 控制 實(shí)驗(yàn)的精確性高 并可對(duì)照光過程中的d c f 熒光產(chǎn)生情況進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng) 態(tài)觀察 生物熒光顯微鏡除了具有一般光學(xué)顯微鏡的機(jī)械結(jié)構(gòu)外 它具有激發(fā)光 源 濾片系統(tǒng)和特殊的光學(xué)鏡頭 熒光顯微鏡在裝置上的重要部件就是要有能 提供充分的特定波長(zhǎng)的光源裝置 使受照射的物體得到理想的激發(fā)而發(fā)出強(qiáng)的 熒光 為達(dá)到這一要求 需借助濾光片把激發(fā)光的光譜限定在這一特定的波長(zhǎng) 區(qū)域內(nèi) 而把伴隨發(fā)出的可見光全部吸收或反射掉 熒光顯微鏡的激發(fā)光源常 選用大功率超高壓汞燈 它是用石英玻璃制作 中間呈球形 內(nèi)充一定數(shù)量的 一1 8 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分 汞 工作時(shí)由兩個(gè)電極間放電 引起水銀蒸發(fā) 球內(nèi)氣壓迅速升高 當(dāng)水銀完 全蒸發(fā)時(shí) 可達(dá)5 0 7 0 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力 這一過程一般約需5 1 5m i n 超高 壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的 結(jié)果 它發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光 足以激發(fā)各類熒光物質(zhì) 因此 為熒光顯 微鏡普遍采用 大功率超高壓汞燈的光源中波長(zhǎng)3 8 0i l n l 4 4 9n m 5 5 0m 6 0 0r l m 的譜 線為主 還含有少量的紅外線 詳見圖1 4 圖l 5 4 0 05 0 06 0 07 0 08 0 0 九 n m 圖1 4 高壓汞燈的發(fā)光波長(zhǎng)曲線 引自 舍英 伊立齊 呼和巴特爾主編 摹 一 筒 沁a么l 3 0 0 3 5 04 0 04 5 05 0 0 5 s o6 0 0 6 5 07 0 0 九 n m 圖1 5 高壓汞燈光源的相對(duì)能量分布曲線 現(xiàn)代光學(xué)顯微鏡 北京 科學(xué)出版社 1 9 9 6 從某種意義上看 光動(dòng)力學(xué)反應(yīng)與熒光探針技術(shù)有很大的相似性 兩者都 需要光源輻照來提供能量 吸收一定能量的光敏劑和熒光探針都從基態(tài)躍遷到 激發(fā)態(tài) 不同的是最終能量的轉(zhuǎn)化方式 激發(fā)態(tài)光敏劑可經(jīng)過氫原子或電子轉(zhuǎn) 移 直接同底物或溶劑反應(yīng) 或者將能量傳遞給分子氧 分別發(fā)生i 型 i i 型 光敏反應(yīng) 5 1 而激發(fā)態(tài)熒光探針發(fā)生無輻射躍遷 發(fā)射出比激發(fā)光波長(zhǎng)長(zhǎng)的熒 光 實(shí)際上發(fā)生無輻射躍遷和輻射躍遷是相互競(jìng)爭(zhēng) 又同時(shí)出現(xiàn)的 光敏劑在 較高的濃度時(shí)可以發(fā)射肉眼可見的熒光 而熒光探針在一定的條件下 也可以 發(fā)生光敏化反應(yīng) 在光動(dòng)力學(xué)研究中 這種相似性可以使我們更好地理解熒光 探針技術(shù) 然而 同時(shí)也為我們制造了種種麻煩和限制 兩者摻雜在一起 有 一1 9 一 帥伯 蚰 m o 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文第一部分 二 熒光圖像分析與處理技術(shù) 引言 對(duì)于d c f 熒光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的研究可通過對(duì)原始圖像的計(jì)算獲得各時(shí) 間點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)d c f 的平均熒光強(qiáng)度 方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確 但是為確定d c f 熒光在 細(xì)胞內(nèi)的分布位置 須對(duì)同一細(xì)胞內(nèi)d c f 熒光分布圖像與細(xì)胞器探針熒光分 布圖像進(jìn)行分析與處理 目前對(duì)于熒光圖像的分析與處理方法有多種方法 本 部分研究分別對(duì)其作一簡(jiǎn)單介紹 比較各種方法之間的優(yōu)缺點(diǎn) 并根據(jù)本實(shí)驗(yàn) 采集到的熒光圖像的特點(diǎn) 應(yīng)用m a t l a b6 1 編寫程序 2 0 2 l 創(chuàng)建了細(xì)胞器 細(xì)胞熒光強(qiáng)度比值法 實(shí)現(xiàn)d c f 熒光亞細(xì)胞定位研究的定量分析處理 1 熒光圖像的預(yù)處理 首先需對(duì)采集到的熒光圖像進(jìn)行預(yù)處理 2 3 2 4 2 5 目的是提高圖像顯示質(zhì) 量 突出有用圖像信息 1 1 熒光圖像輸出類型與格式 熒光顯微成像系統(tǒng)輸出的結(jié)果圖像文件為t i f 格式 c c d 熒光顯微鏡系 統(tǒng)的輸出結(jié)果為1 6 位灰度圖像 灰度范圍0 6 5 5 3 5 而l s c m 系統(tǒng)的輸出結(jié) 果為8 位灰度圖像 灰度范圍0 2 5 5 1 2 熒光圖像裁剪 c c d 熒光顯微鏡系統(tǒng)與l s c m 系統(tǒng)的視野范圍很大 一幅原始結(jié)果圖像往往 包含眾多細(xì)胞 為方便快捷地顯示與處理單細(xì)胞圖像 以及去除多余背景而節(jié) 省存儲(chǔ)空間 通過圖像裁剪分割出各個(gè)單細(xì)胞圖像 1 3 熒光圖像濾波去噪 應(yīng)用中值濾波等圖像濾波方法 可有效去除細(xì)胞熒光圖像中的噪聲 1 4 熒光圖像增強(qiáng) 細(xì)胞熒光圖像固有的特點(diǎn)為灰度水平較低 對(duì)比度較差 應(yīng)用灰度變換等 一2 l 一 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文第一部分 圖像增強(qiáng)手段 可有效改善圖像對(duì)比度 突出圖像中的有用信息 獲得便于人 眼觀察的視覺效果 1 5 偽彩色顯示 人眼對(duì)彩色的分辨能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)灰度級(jí)的分辨能力 選用適合人眼視覺 特性的偽彩色調(diào)色板 對(duì)單細(xì)胞熒光圖像進(jìn)行偽彩色顯示 可更有效地強(qiáng)化對(duì) 圖像細(xì)節(jié)部分的表達(dá) 為適應(yīng)對(duì)熒光物質(zhì)的觀察習(xí)慣 還采用紅 綠兩種調(diào)色板 對(duì)熒光圖像進(jìn) 行符合其熒光發(fā)射波長(zhǎng)的偽彩色顯示 以達(dá)到與顯微鏡下直接目視觀察相同的 視覺效果 在本研究中 綠色調(diào)色板用于顯示發(fā)射綠色熒光的d c f 的熒光圖 像 紅色調(diào)色板用于顯示發(fā)射紅色熒光的線粒體探針的熒光圖像 此種偽彩色 顯示方法是下文所述偽彩色融合定性分析方法的基礎(chǔ) 圖1 6 即是按照上述方法在實(shí)驗(yàn)中對(duì)采集到的原始圖像進(jìn)行熒光圖像預(yù)處 理的示例 圖1 6 圖像預(yù)處理的示例 圖a 原始圖像 b a 中箭頭所指細(xì)胞經(jīng)處理后的圖像 2 熒光分布定位技術(shù) 對(duì)于一種熒光在細(xì)胞內(nèi)分布位置進(jìn)行定位 需要通過和另一種己知分布位 最的探針的熒光進(jìn)行比較 包括定性方法和定位方法 一2 2 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分 2 1 定性方法 截止目前 國外大多數(shù)同類研究對(duì)熒光圖像的分析與處理均采用定性分析 方法 2 6 0 主要方法包括有以下三種 2 1 1 直接觀察比較法 即對(duì)同一單細(xì)胞的兩幅熒光圖像進(jìn)行直接目視觀察 比較細(xì)胞內(nèi)光敏劑的 空間分布與細(xì)胞器位點(diǎn)空間分布的相似性 2 1 2 偽彩色融合法 將同一單細(xì)胞的兩幅熒光圖像融合為一幅r g b 格式的真彩色圖像 一般 將其中一幅熒光圖像數(shù)據(jù)送入r g b 圖像的r 通道 將另一幅熒光圖像數(shù)據(jù)送 入r g b 圖像的g 通道 紅色的高灰度區(qū)域和綠色的高灰度區(qū)域分別表示兩種 熒光探針的分布區(qū)域 融合后的r g b 圖像中 紅色亮區(qū)域與綠色亮區(qū)域重疊 的區(qū)域經(jīng)過紅綠互相混色而顯示為黃色亮區(qū)域 即明顯標(biāo)示出兩種熒光探針細(xì) 胞內(nèi)位置分布的空間重疊區(qū)域 2 1 3 改進(jìn)型偽彩色融合法 上述偽彩色融合方法中 由于兩幅圖像的灰度水平 灰度分布直方圖存在 差異 可能導(dǎo)致以下兩種情況 一方面 某區(qū)域在一幅圖像中屬高灰度區(qū)域 而在另一幅圖像中屬低灰度 區(qū)域 或在兩幅圖像中均屬低灰度區(qū)域 說明此區(qū)域本不屬于兩種熒光物質(zhì)分 布的重疊區(qū)域 但兩幅圖像在此區(qū)域的灰度水平卻相同或相近 使得融合圖像 在此區(qū)域也顯示出表示重疊區(qū)域的黃色 另一方面 某區(qū)域在兩幅圖像中均屬高灰度區(qū)域 說明此區(qū)域本來屬于兩 幅圖像熒光分布的重疊區(qū)域 融合圖像中本應(yīng)在此區(qū)域出現(xiàn)表示熏疊區(qū)域的正 黃色 但兩幅圖像在此區(qū)域的灰度水平卻有一定差異甚至相差很大 使得融合 圖像中此區(qū)域無法醒目地顯示出正黃色 而是明顯地偏紅色或偏綠色 與周圍 其它區(qū)域混雜在一切不容易分辨 以上兩種情況均會(huì)嚴(yán)重干擾對(duì)融合圖像中重疊區(qū)域的視覺觀察與判斷 導(dǎo) 致錯(cuò)誤的分析結(jié)果 為此 將此方法做如下改進(jìn) 設(shè)a b 兩種探針的熒光圖像分別為a 和b 某區(qū)域在圖像a 中灰度為 一2 3 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一部分 i a 在圖像b 中灰度為i b 在融合圖像中r g b 三通道的灰度分別為r g b 其中b 0 設(shè)定閩值m 劃分出兩幅圖像中的高灰度區(qū)域 也即 1 將圖a 中細(xì)胞輪廓內(nèi)所有像素按灰度高低排序 以灰度最高的前m 像素為高 灰度區(qū)域a 1 即探針a 有分布區(qū)域 其余像素為低灰度區(qū)域 a 1 即探針a 無 分布區(qū)域 2 將圖b 中細(xì)胞輪廓內(nèi)所有像素按灰度高低排序 以灰度晟高的前m o o f t r 素為高 灰度區(qū)域b 1 即探針b 有分布區(qū)域 其余像素為低灰度區(qū)域胡1 即探針b 無 分布區(qū)域 據(jù)此可將細(xì)胞區(qū)域內(nèi)部劃分為四種子區(qū)域 并在融合圖像中根據(jù)四種子區(qū) 域的不同意義 分別施以不同的融合方法 即 1 a 1 與b 1 的交集區(qū)域a i o b l 即為探針a 與b 的分布重疊區(qū)域 融合圖像中 此區(qū)域灰度值不再簡(jiǎn)單取做 r i a g i b 而是改為 r g i a i b 2 如此 可保證此區(qū)域以正黃色顯示 而不會(huì)偏紅色或偏綠色 2 a l 與b l 的交集區(qū)域 a 1 n b l 即為探針a 無分布而探針b 有分布區(qū)域 融 合圖像中此區(qū)域灰度值取做 r 0 g i b 3 a 1 與 b l 的交集區(qū)域a i a b i 即為探針a 有分布而探針b 無分布區(qū)域 融 合圖像中此區(qū)域灰度值取做 r i a g 0 4 a 1 與 b i 的交集區(qū)域 a l n b 1 即為探針a 與b 均無分布區(qū)域 融合圖像 中此區(qū)域灰度值取做 r 0 g 0 上述方法中 通過適當(dāng)調(diào)節(jié)閾值1 3 3 的大小 可獲得最滿意的融合效果 一般m 取值在1 0 一2 0 左右 通過編程對(duì)細(xì)胞輪廓內(nèi)圖像的灰度分布直方圖進(jìn)行 計(jì)算 可簡(jiǎn)便快捷地確定細(xì)胞輪廓內(nèi)熒光灰度最高的m 像素 此前只須用鼠 標(biāo)在細(xì)胞熒光圖像上勾勒出細(xì)胞輪廓即可 偽彩色融合方法經(jīng)過以上改進(jìn) 融合圖像中將只顯示出探針a 有分布區(qū)域 和探針b 有分布區(qū)域 且只有在兩區(qū)域重疊處才顯示黃色 從而有效避免了干 擾信息對(duì)正確觀察判斷的影響 2 4 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文第一部分 2 1 4 波形比較法 另一種簡(jiǎn)便易行的定性方法是 在細(xì)胞內(nèi)部感興趣區(qū)域畫一條直線路徑 畫出這條路徑上所有像素在兩幅圖像中的灰度值相對(duì)空間坐標(biāo)的變化起伏曲 線 觀察比較兩條曲線之間的相似程度和相關(guān)性 2 2 定量方法 定性分析方法主觀性強(qiáng) 缺少精確量化結(jié)果 信息特征不夠鮮明 推斷結(jié) 果困難 而定量分析方法可有效彌補(bǔ)定性方法的上述缺陷 深入挖掘圖像中蘊(yùn) 含的有用信息特征和動(dòng)態(tài)變化 尤其對(duì)于某些具有熒光分布位置彌散的圖像 超過人眼分辨力 單純的定性觀察方法往往不易或無法捕捉到具有重要意義的 信息 定量方法的優(yōu)勢(shì)就更能體現(xiàn) 截止目前 已經(jīng)報(bào)道的此類研究的文獻(xiàn)中 僅有極少數(shù)采用了定量分析的方法 2 引 2 2 1 相關(guān)系數(shù)法 采用相關(guān)系數(shù)法 此方法計(jì)算同一單細(xì)胞內(nèi)兩幅熒光圖像a 與b 內(nèi)備像 素的熒光灰度值之間的相關(guān)系數(shù) 圖像a 與圖像b 的相關(guān)系數(shù)r 的計(jì)算公式 定義如下 一 一j 四 一百 二 爿 一j 2 一確 v卅h蜥 其中 不 m h e i 了z a 百 l z z 曰m 一 以此相關(guān)系數(shù)r 表征兩種熒光探針分布的線性相關(guān)性 相關(guān)系數(shù)越接近1 表示相關(guān)性越強(qiáng) 兩種熒光探針分布的重疊程度就越大 2 2 2 細(xì)胞器 細(xì)胞熒光強(qiáng)度比值法 本課題組提出的細(xì)胞器 細(xì)胞熒光強(qiáng)度比值法已成功應(yīng)用于光敏劑弧細(xì)胞 內(nèi)分布定位的研究 2 9 3 0 3 1 l 通過定量計(jì)算細(xì)胞器探針高熒光區(qū)域的d c f