原位雜交手冊.doc

第1章 共用程序引 言： 本章介紹了本實(shí)驗(yàn)最基本的實(shí)驗(yàn)程序，包括中期染色體制片；質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與DNA的提取；探針標(biāo)記檢測以及基因組總DNA的提取第1節(jié) 原生質(zhì)體染色體制片試 劑：飽和a-溴萘、0.075MKCl、固定液（新鮮3：1甲醇冰乙酸）、酶解液（20%纖維+2%果膠酶）、IN HCl、95%酒精實(shí)驗(yàn)步驟：浸 種 室溫下浸種約一天（也可1-2h）發(fā) 芽 培養(yǎng)皿中墊濕濾紙三層，利子分散其上，間留間隔，勿堆積，種子上層覆蓋一層水浸濕的濾紙，25-30下發(fā)芽，每天水洗一兩次，約2-3天可取根。NOTE：換水是很重要的，水不能過多，以不留流動(dòng)水為好，水分過多易長芽而根長不好。預(yù)處理方法1：根長至1.5-2cm長時(shí)切取1.5mm 左右的根尖，飽和a-溴萘約25處理2-3小時(shí)，水稻一般不預(yù)處理。方法2：根長好后將種子置于4冰箱處理一個(gè)晚上，第二天在25下恢復(fù)2-3h，也可得到許多分裂相。NOTE：何進(jìn)取根尖最好具隨機(jī)性，與季節(jié)以及細(xì)胞分裂時(shí)期很有關(guān)系。（玉米8:00AM，水稻11:00-12:00AM）水 洗 反復(fù)幾次前低滲 ddH2O或0.075M KCl（0.6KCl溶于100ml ddH2O）低滲30min（室溫）。固 定 新鮮31甲醇冰乙酸固定2-3小時(shí)或4過夜。NOTE：一定要用新鮮固定液；如果用于石蠟切片組化顯色，甲醇固定的材料會(huì)導(dǎo)致很高背景，應(yīng)換用4%多聚甲醛。水 洗 反復(fù)幾次，洗凈。酶 解 2%纖維素酶+2%果膠酶混合（11），28下處理3小時(shí)左右。NOTE：酶解是最至關(guān)重要的一步，首先是酶的質(zhì)量，很多酶都可導(dǎo)致分裂相少，以SERVA公司的果膠酶為最好，根據(jù)材料不同，酶解時(shí)間會(huì)有所變化。洗載片 載片一定要干凈，以防材料脫落和保持清潔的背景。洗片步驟：1）IN HCl中3min以上2）自來水洗（每片單獨(dú)漂洗）接著用雙蒸水洗3）95%酒精浸泡30min以上（每片單獨(dú)放入）制 片 小心吸去酶液，水洗幾次，吸取1-2個(gè)根尖于干凈的干載玻片上，滴半滴固定液，用鑷子敲至漿狀，滴2-3滴固定液使材料分散，火烤至著火。NOTE：敲得越碎越好，敲至固定液干后，再滴固定液，迅速涂開，火焰干燥，干燥后肉眼觀察應(yīng)為規(guī)則干凈的小雨點(diǎn)狀，若小雨點(diǎn)上像有一層不透明的薄層，說明酶解時(shí)間不夠。鏡 檢 檢后將符合要求的制片儲存于-20下備用。NOTE：每張制片上至少應(yīng)有150個(gè)左右分散良好但背景干凈的分裂相方可用于雜交。REFERENCES第2節(jié) 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增若寄來的探針是插在質(zhì)粒中cDNA克隆或基因片段，首先要對其進(jìn)行轉(zhuǎn)化，一般利用E.Coli 作為載體，轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵在于如何制備感受態(tài)的 E.Coli細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)利用 CaCl2來制備感受態(tài)細(xì)胞，此方法簡便、快速。試 劑：LB培養(yǎng)基，0.1M Cacl2，70%甘油實(shí)驗(yàn)步驟：感受態(tài)E.Coli的制備從-20下取2-5l E.Coli，涂在平板上，37培養(yǎng)16-20h。挑取單個(gè)菌落于20ml已預(yù)熱至37的LB培養(yǎng)基(不含Amp)中，37，300rpm劇烈振搖約3h。培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至4支預(yù)冷的5ml Eppendorf管,冰上放10min，4000rpm離心 3-5min，回收細(xì)胞（4）； 倒出培養(yǎng)液，倒置lmin。以5ml預(yù)冷的0.1M Cacl2重懸每份沉淀，冰浴30min。4000rpm離心5min（4）；倒出培養(yǎng)液，倒置lmin。每管加預(yù)冷的0.1MCaCl2 0.25ml，重懸細(xì)胞，冰浴lh每管100l分裝,保存于-20下,長期保存轉(zhuǎn)化效率會(huì)有所下降。質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化取-20保存的感受態(tài)細(xì)胞二支，冰上溶解10min，一支加質(zhì)粒cDNA(10l，lkb的探針，建議采用切口平移法；隨機(jī)引物法標(biāo)記效率比切口平移高，更適合于100bp-lkb探針的標(biāo)記；而對于100bp的探針，則需要用末端標(biāo)記法；但如果你手頭的探針量很少（少至50ng），相應(yīng)引物的話，PCR是最佳選擇，簡便快速，可制備大至4kb的探針。實(shí)驗(yàn)步驟4.1 切口平移標(biāo)記法(Biotin)本實(shí)驗(yàn)室用于中期染色體原雜交的探針一般用生物標(biāo)記。依次加入下列試劑于1.5ml Eppendorf管中：探針數(shù)123終濃度(50ul中)dNTP10203030uM of each10Buff510151Bio-11-dUTP481230uMddH2O265278DNase(0.75ng/ul)2.557.51.88ngDNA Pol.12U(2.5ul)24U36U12U質(zhì)粒DNA(0.4ug/ul) 取上述混合液45ul，加相應(yīng)探針5ul1.52ug15下反應(yīng)2.5 h, 加5ul終止液(Stop solution)終止。NOTEDNA Pol.的量應(yīng)參照各廠家提供的濃度，以每50ul標(biāo)記液中含12U為準(zhǔn)。原位雜交探針的合適長度為300600bp，照此系統(tǒng)標(biāo)記中DNase用量，一般可達(dá)到這一目的；若為NT試劑盒，其提供的濃度應(yīng)已考慮這一參數(shù)，因此酶量應(yīng)已優(yōu)化?，F(xiàn)在標(biāo)記一般用華美公司試劑盒包括10Buffer、消毒三蒸水、dNTP、stop solution（0.5M EDTA）。4.2 純化已標(biāo)記的探針：制作柱子 在0.5ml微Eppendorf管底部用青霉素皮試探頭刺孔，將少量硅化玻璃絲加在底部，套入去底的1.5ml微Eppendorf管中，再置于15ml培養(yǎng)管中，加入750l Sepharose CL-6B于穿孔微Eppendorf管中，25,00rpm離心5mim。用另一新1.5ml微Eppcndorf管更換，貼上Prode標(biāo)簽。在作好的新鮮柱子上，立即加入已標(biāo)記的Probe（注意柱子一定要當(dāng)作當(dāng)用），25,00離心10mim。測定純化后Probe的體積，儲存于-20下備用。4.3其它探針標(biāo)記方法：用于多色FISH或Fiver-FISH，除用生物素標(biāo)記外，至少還要用到另一種標(biāo)記物，一般也為地高辛（Digoxigenin / Digoxin，DIG）；而用于Southern Blotting時(shí)，則一般用同位素（Isotope）標(biāo)記，也可用DIG標(biāo)記。介紹兩種試劑盒的標(biāo)記方法（試劑盒上有）DNase/ DNA Pol介導(dǎo)的切口平移標(biāo)記法(32P) (Nick Translation Labeling Kit，Promega) Klenow介導(dǎo)的隨機(jī)引物標(biāo)記法(DIG)(DIG Labeling and Detection Kit，B.M.) 反應(yīng)體系（50ul）反應(yīng)體系（50ul）dNTP（dATP,dTTP, dGTP）10Buff回收的Probe（不含載體）ddH2ODNase/ DNA Pol32P-dCTP（最后加）10ul5ul5ul（約1ug）21ul5ul4uldNTP（dATP,dTTP, dGTP）10Buff回收的Probe（不含載體）6mer Primers（0.09U/ul）ddH2ODNase/ DNA Pol32P-dCTP（最后加）10ul5ul5ul（約1ug） 3ul21ul5ul2ul（5U）15下反應(yīng)1.5 h, Stop solution終止37下反應(yīng)1.5 h, Stop solution終止NOTE 應(yīng)用于Southern Blotting的探針應(yīng)為不含質(zhì)粒載體的插入片段，因此應(yīng)先用相應(yīng)的限制性酶進(jìn)行酶切，而后用低熔點(diǎn)瓊脂糖對探針進(jìn)行回收。 相比之下，PCR標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是只須極少量（50ng）的插入片段（模板）便可擴(kuò)增出大量高效標(biāo)記的探針（Friedman, 1990），并且一般直接可用少量細(xì)菌裂解液做模板。缺點(diǎn)是必須要有目的插入片段的特異性引物和相應(yīng)的儀器設(shè)備，并且，人們總是發(fā)現(xiàn)一些克隆，它們不能用這種方法擴(kuò)增，原因不明。探針標(biāo)記用溶液配制20生物素稀釋液 10ml成 分用 量工作濃度1M Tris-7.50.5M EDTAddH2O1ml2ul9ml5mM5uM NOTE: 每管1ml分裝，-20保存。使用時(shí)稀釋20倍。 Bio-11-dUTP購進(jìn)時(shí)一般為儲存濃度10mM（如果為固體，則0.1mg溶于11.6ul稀釋液中）。分裝成1ul/管儲存，用時(shí)每管加入19ul稀釋液稀釋成工作濃度0.5mM。稀釋后的Bio-11-dUTP不適合長期保存，反復(fù)凍溶5次后將影響標(biāo)記效果。DNase稀釋液=10SA-HRP稀釋液DNase貯存液（1mg/ml） 10ml成 分用 量貯存液中濃度1M Tris-7.5甘油1M MgCl2ddH2ODNase200 ul5.0ml10ul4.8ml1.0mg20mM50%10mM1mg/ml NOTE：此貯存液要先用DNase稀釋液按以下方法稀釋。DNase稀釋貯存液（0.75ng/ul） 取1mg/ml DNase貯存液2ul，加入198ul ddH2O，振蕩混勻，取混勻后的液體3ul，加入7ul DNase稀釋液，振蕩混勻；再取混勻后的液體5ul，加入15ul DNase稀釋液，振蕩混勻，每管0.5ml分裝，-20保存。第5 節(jié) 點(diǎn)印漬檢測標(biāo)記效果（NBT/BCIP顯色程序）基本知識 檢測和定位抗原一般是通過抗原-抗體反應(yīng)完成。在通用的二級抗體上連接熒光分子或酶，便可進(jìn)行熒光裝置直接檢測或經(jīng)酶底物顯色后間接檢測。后者稱酶聯(lián)免疫顯色反應(yīng)（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA），在許多領(lǐng)域都占有重要應(yīng)用。常用的酶是辣根過氧化物酶horseradish peroxidase（HRP），常通過底物DAB來顯色；另一種是堿性磷酸酶alkaline phosphatase（AP），通過底物NBT/BCIP來顯色（Ruzen，1995）（如下圖）應(yīng) 用 檢測探針標(biāo)記效果；檢測ISH信號；基因表達(dá)原位分析（切片上的mRNA定位；蛋白質(zhì)定位）；檢測細(xì)胞凋亡中DNA特異片段化；DIG或Biotin標(biāo)記的Southern Blotting，Western Blotting；ELISA實(shí)驗(yàn)步驟：生物素標(biāo)記的探針DIG標(biāo)記的探針（詳見KIT，B.M.）點(diǎn)膜1ul Probe點(diǎn)于2cm3cm硝酸纖維上，同時(shí)點(diǎn)對照烤膜80下20min封阻55-60下在小培養(yǎng)皿Buffer中用搖床搖30min（60以上BSA會(huì)變性）洗膜Buffer洗膜2min（5ml Eppendorf管）偶聯(lián)偶聯(lián)SA-AP溶液5ml（SA-AP 2.5ul，Buf5ml ），37搖床，30min（黑色5ml dorf 管）0.05M Tris-7.5中以15000稀釋抗DIG-AP(B.M.),并以此代替SA-AP溶液。洗膜Buffer2min，Buffer 2min（5ml Eppendorf管）顯色加顯色液（NBT/BCIP），20（或37）下10min（黑色5ml dorf 管）烘膜80 10min，然后貼在記錄本上第6 節(jié) CTAB法提取植物總DNA第 2 章 中期染色體原位雜交引 言 通過原位雜交（in situ hybridization ISH）對特異DNA序列在植物染色體上進(jìn)行物理定位，現(xiàn)在在植物分子生物學(xué)的許多領(lǐng)域變得日益重要。ISH可以給人們提供基因或DNA序列在染色體上的真實(shí)物理位置和次序信息（Heslop-Harrison，1992；Leitch，1994； Bennett，1995）。有助于通過染色體步查分離目的基因的研究，也可使人們對物理圖譜和遺傳圖譜進(jìn)行比較（Gustafson，1990；Pedersen，1995），架起了兩者之間的一座橋梁（de Jong，1999）ISH在方法上也逐步形成了從繁瑣到簡單、從放射性標(biāo)記到非放射性標(biāo)記、從DAB檢測向熒光（FISH）再向多色熒光檢測、從常規(guī)雜交向原位PCR以及Fiber-FISH的發(fā)展格局，靈敏度和分辨率正在由Mb向kb、百分距離向堿基對、多拷貝向單拷貝、大片段向小片段再向BAC/YAC的方向邁進(jìn)。DNA原位雜交的載體有以下幾種：間期（interphase）染色質(zhì)；減數(shù)分裂粗線期（pachytene）染色體；中期（metaphase）染色體；DNA纖維（DNA Fiber）。應(yīng) 用 基因定位 分析DNA序列位置與基因組高級結(jié)構(gòu)、基因活性及遺傳重組之間的關(guān)系 轉(zhuǎn)基因植物的確定、鑒定基因插入位點(diǎn) 鑒定外源滲入染色體片段（GISH） 基因克隆（Fiber-FISH）物種間的親緣關(guān)系多倍體形成研究第1 節(jié) 原位雜交NOTES本章介紹的是生物素標(biāo)記探針的原位雜交程序整個(gè)操作中，除非特別指明，應(yīng)注意保持載玻片濕潤除非特別指明，均應(yīng)在20-25下操作。一、所需試劑及儀器：水浴鍋 、溫箱、烘箱；70、95、100 EtOH，去離子甲酰胺，2SSC，20SSC，RnaseA， SDS（10%），Probe。二、實(shí)驗(yàn)步驟：簡單描述為：制片 干燥 RNaseA處理 變性 脫水 探針變性 雜交1、設(shè)置37，70水浴鍋，37溫箱，60烘箱梯度乙醇脫水染缸（各50ml）：染缸1：70% EtOH 染缸2：95% EtOH （保存在-20下）染缸3：100% EtOH2、干 燥：在60烘箱中烤一小時(shí)或在室溫下干燥。前者有助于染色體在載玻片上固定，更難脫落。但就是在空氣中干燥，染色體一般也不會(huì)脫落。3、準(zhǔn)備變性染缸：染缸4：35ml 去離子甲酰胺（不滅菌） 在70水浴中保溫染缸5：15ml 2SSC，加蓋Note：此時(shí)不能把兩種溶液混在一起預(yù)熱，染色缸隨水浴鍋一起升溫，否則易引起染色缸破裂4、準(zhǔn)備RNaseA溶液（1g/ml）染缸：染缸6： 原液 5l（10mg/ml） 37水浴保溫 2SSC 50ml （滅菌）5、RNase A處理，37一小時(shí)。Note：也可直接吸取RNaseA溶液50l左右，用干凈蓋玻片蓋好，保溫皿內(nèi)37保溫1h。6、敲一盒冰，取出-20下配制雜交液的藥品，凍融后配制雜交液片子數(shù)（不同探針）1 2 3 4 5 6 終濃度FAD（Sigma）（100%）硫酸葡聚糖（50%）20SSCSDS（10%）sssDNA（華美，10mg/ml）25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.010.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.05.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.02.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.00.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 50% 10% 2SSC 0.5% 0.2%Probe每張片子取混勻溶液43l，加相應(yīng)probe 7l（30-40ng/l，計(jì)載體），混勻，短暫離心，置于冰上5 ng/l（不計(jì)載體）NOTES:所有藥品應(yīng)始終放在冰上配制好的雜交混和液可在-20下保存6個(gè)月SDS是一種濕潤劑，可幫助探針穿透進(jìn)入，使用濃度一般為0.051.07、配制70 FAD：在RnaseA處理完成前，將在70下的去離子甲酰胺加入熱的2SSC中繼續(xù)保溫。（70l FAD30l 2SSC/片，70烘箱）8、變性：RNase A處理完后，片子在70 70 FAD中處理3.5 min。9、脫水（-20）：取出后立即放入 -20 70乙醇 -20，95乙醇， -20，100乙醇，中，5 min 5 min 5 min10、制片