高致病性禽流感血凝(HA).ppt

高致病性禽流感血凝 HA 和血凝抑制試驗(yàn) HI 慶城縣疫病預(yù)防控制中心 簡(jiǎn)介 禽流感 AD 是有正黏病毒科A型禽流感病毒中有致病性的任何一型毒株引起以禽類為主的烈性傳染病 我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病 流感病毒顆粒表面的血凝素 HA 蛋白 可以識(shí)別并吸附于紅細(xì)胞表面受體的結(jié)構(gòu) 出現(xiàn)血凝現(xiàn)象 但是當(dāng)病毒懸液中加入特異性抗體 且該抗體的量足以抑制病毒顆?；蚱溲嘏c紅細(xì)胞表面受體相結(jié)合 則紅細(xì)胞表面的受體就不能與病毒顆粒或其血凝素直接接觸 這時(shí)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象就被抑制 稱為血凝凝集抑制 HI 反應(yīng) 簡(jiǎn)介 血凝實(shí)驗(yàn) HA 血凝抑制 HI 實(shí)驗(yàn)是目前WHO進(jìn)行全球流感監(jiān)測(cè)所普遍采用的實(shí)驗(yàn)方法 可用于鑒定所有的流感病毒分離株可用來檢測(cè)家禽血清中的感染或免疫抗體本實(shí)驗(yàn)室常采用HA HI實(shí)驗(yàn)檢測(cè)禽血清中的免疫抗體 實(shí)驗(yàn)的原理 用途 用已知抗原測(cè)抗體 抗體可以抑制抗原凝集紅細(xì)胞 用來檢測(cè)禽流感疫苗免疫水平 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作 試驗(yàn)用溶液的配制1 雞紅細(xì)胞保存液 阿氏Alsevers液 配制阿氏液 Alsever sSolution 是一種紅細(xì)胞保存液 含有抗凝劑檸檬酸鈉和細(xì)胞需要的養(yǎng)分葡萄糖 葡萄糖 2 05克檸檬酸鈉 0 8克檸檬酸 0 055克氯化鈉 0 42克加蒸餾水至100毫升 加熱溶解后將pH值調(diào)到6 1 經(jīng)過69千帕 15分鐘的高壓滅菌 放置在4 的環(huán)境內(nèi) 保存?zhèn)溆?阿氏液主要用于保存紅細(xì)胞 在4 的環(huán)境下 紅細(xì)胞可以保存2周而不改變活性和特性 因此阿氏液用于采血 保存和運(yùn)送紅細(xì)胞進(jìn)行化驗(yàn) 2 1 雞紅細(xì)胞懸液制備采血用注射器吸取阿氏液1ml 取至少3只SPF公雞或無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞的血液3 4ml 與等量的阿氏液混勻 裝入離心管中備用 洗滌紅細(xì)胞將離心管中的血液經(jīng)過1500 1800r min離心8分鐘 棄去上清液 在沉淀物中加入本實(shí)驗(yàn)要求的PBS液 輕輕混勻 以均勻沉淀的紅細(xì)胞 在經(jīng)過1500 1800r min離心8分鐘 用吸管移去上清液及沉淀的紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜 再重復(fù)2次以上過程后 4 保存?zhèn)溆?1 雞紅細(xì)胞懸液制備用微量移液器取洗滌后的紅細(xì)胞沉淀泥0 1ml 加入到9 9ml本實(shí)驗(yàn)要求的PBS液 輕輕混勻 制成1 雞紅細(xì)胞懸液 備用 3 pH7 2 0 01mol LPBS的配制a 配制25 PB 稱量2 74g磷酸氫二鈉 Na2HPO412H2O 和0 79g磷酸二氫鈉 NaH2PO42H2O 加蒸餾水至100mL b 配制1 PBS 量取40ml25 PB 加入8 5g氯化鈉 加蒸餾水至1000mL c 用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH至7 2 d 滅菌或過濾 e PBS一經(jīng)使用 于4 保存不超過3周 PBS對(duì)其它酸堿物質(zhì)具有一定的緩沖能力 維持反應(yīng)所需的pH 因而比使用生理鹽水的效果好 儀器及診斷液等的準(zhǔn)備96孔V型微量血凝集反應(yīng)板 微量吸液器 混合振蕩器 恒溫培養(yǎng)箱 待檢血清 雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清 pH7 2 0 01mol LPBS 1 雞紅細(xì)胞懸液 稀釋禽流感病毒H5亞型抗原 用注射器吸取本抗原規(guī)定劑量加入PBS液稀釋好備用 稀釋禽流感H5亞型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清 用注射器吸取本血清規(guī)定劑量加入PBS液稀釋好備用 待檢血清要新鮮 無雜質(zhì) 無紅細(xì)胞 不腐敗 盛血清的容器要清潔 注意 所有試劑及待檢血清在試驗(yàn)前必須恢復(fù)室溫 且室內(nèi)溫度保持在 20 25 血凝 HA 試驗(yàn) 抗原效價(jià)的測(cè)定在微量反應(yīng)板的1孔 12孔均加入25ulPBS液 換滴頭 吸取稀釋禽流感病毒H5亞型試驗(yàn)抗原25ul加入第1孔 吹吸取10 15次混勻 從第1孔吸取25ul病毒抗原液加入到第2孔 吹吸同樣次數(shù)混勻后吸取25ul加入第3孔 如此進(jìn)行對(duì)倍稀釋至第11孔 從第11孔吸取25ul棄之 換滴頭 每孔再加入25ulPBS 每孔均加入25ul1 RBC液 振蕩混勻 在室溫 20 25 靜置40min后觀察結(jié)果 結(jié)果判定 將板傾斜 觀察紅細(xì)胞有無呈淚珠狀流淌 完全血凝 不流淌 的抗原最高稀釋倍數(shù)代表一個(gè)血凝單位 血凝試驗(yàn) 抗原效價(jià)的測(cè)定 操作表 抗原效價(jià)的測(cè)定結(jié)果判定 1 紅細(xì)胞100 凝集的抗原最高稀釋度為血凝價(jià) 2 為100 凝集 為不完全凝集 為不凝集3 上表例抗原血凝為2564 對(duì)照孔的紅細(xì)胞將成明顯的紐扣狀沉到孔底 抗原回歸試驗(yàn) 1 4 單位抗原配制血凝價(jià)數(shù)除以4 如表一256 4 64 即1毫升 抗原 63毫升 PBS 即成 2 4 單位抗原驗(yàn)證配制好后和每天應(yīng)用前都必須對(duì)4 單位抗原進(jìn)行測(cè)試驗(yàn)證 操作按表二進(jìn)行 3 作兩排孔第1 5孔加PBS液25ul4 第1孔加4 單位抗原液25ul 吹吸10 15次混勻吸取第2孔用同樣次數(shù)吹吸混勻吸取25ul加入到第3孔 如此進(jìn)行到第5孔棄去25ul 換滴頭 5 每孔再加入25ulPBS 6 每孔均加入25ul1 RBC液 7 振蕩混勻 在室溫 20 25 靜置40min后觀察結(jié)果 血凝試驗(yàn) 抗原效價(jià)的測(cè)定 操作表 1 單位抗原孔的紅血球必須達(dá)到100 凝集 同時(shí)0 5 孔紅血球達(dá)到50 凝集 50 下沉孔底才符合要求 否則重新調(diào)配 4 單位抗原驗(yàn)證結(jié)果判定 血凝抑制試驗(yàn) 加PBS液在微量反應(yīng)板上的1孔 11孔加入25ulPBS 第12孔加入50ulPBS 加被檢血清吸取25ul被檢血清加入第1孔吹吸吹吸取10 15次混勻 從第1孔吸取25ul血清稀釋液加入到第2孔 吹吸同樣次數(shù)混勻后吸取25ul加入第3孔 如此進(jìn)行對(duì)倍稀釋至第10孔 從第10孔吸取25ul棄之 換滴頭 1 11孔均加入含4 單位抗原液25ul 室溫下靜置30min 每孔均加入25ul1 RBC液 振蕩混勻 在室溫 20 25 靜置40min后觀察結(jié)果 對(duì)照孔紅細(xì)胞將呈紐扣狀沉于孔底 結(jié)果判定 以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為H