儲炬---氮源在工業(yè)發(fā)酵中的重要調控作用

儲 炬華東理工大學國家生化工程技術研究中心(上海）2016.4.17， 湖北宜昌,氮源在工業(yè)發(fā)酵中的重要調控作用,2016年工業(yè)生物過程優(yōu)化與控制研討會,Outline,工業(yè)發(fā)酵的重要性N源在工業(yè)發(fā)酵中的調控作用基于碳氮磷利用速率動態(tài)調控的紅霉素基因工程菌發(fā)酵過程優(yōu)化基于N源調控的其他發(fā)酵產(chǎn)品案例用于考察N源的專用設備及多尺度參數(shù)分析結論與展望,一、工業(yè)發(fā)酵在國民經(jīng)濟中的重要地位,工業(yè)生物技術在國民經(jīng)濟發(fā)展中的作用,發(fā)酵工程,醫(yī)藥、輕工食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、能源、,社會可持續(xù)發(fā)展生物技術發(fā)展,需求,醫(yī)藥、食品領域的重要工作內容和關鍵技術,新型食品添加劑、防腐劑、功能食品,食品,微生物藥物,新藥、抗體疫苗、酶,生物能源,纖維素乙醇、生物柴油,環(huán)境保護,生物治理、生物預報,農(nóng)業(yè),農(nóng)產(chǎn)品深加工、生物農(nóng)藥與肥料,數(shù)千年歷史技術持續(xù)發(fā)展,工業(yè)生物技術基礎 社會經(jīng)濟發(fā)展必須,動物細胞大規(guī)模培養(yǎng),抗生素、維生素、基因產(chǎn)品,生物基化學品,可降解塑料、生物乙烯、1、3丙二醇,以多參數(shù)檢測相關性分析為基礎的生物過程控制優(yōu)化理念,二 、N源在工業(yè)發(fā)酵中的調控作用,氮是活細胞生存所必須的營養(yǎng)大分子， 氮的吸收是微生物代謝的關鍵步驟。為了滿足生物對氮的需求，即使在氮限制的情況下，仍能確保充足的氮供應，因為微生物已經(jīng)進化了針對不同氮源復雜的攝取和吸收機理。,培養(yǎng)基成分,培養(yǎng)基成分,水,培養(yǎng)基成分氮源,N源主要用于構建菌體細胞物質（氨基酸、蛋白質和核酸等）和含氮代謝物，主要可分為有機氮源和無機氮源常用的有機氮源有花生餅粉、黃豆餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、酵母膏、魚粉、尿素等 在蛋白酶作用下，水解為氨基酸被吸收分解代謝 含有豐富的蛋白質、多肽和游離氨基酸外，還含有少量糖類、脂肪、無機鹽、維生素及某些生長因素，因此微生物在此環(huán)境下能夠生長旺盛，菌濃增長迅速,源在工業(yè)發(fā)酵調控中的作用,促進生長，調節(jié)初級代謝及次級代謝的通量控制合適水平，啟動次級代謝產(chǎn)物形成控制生長速率，影響菌型形成，從而影響發(fā)酵液流變特性影響供氧水平，增加功率消耗,氮源在發(fā)酵過程中的作用,菌體生長,產(chǎn)物代謝產(chǎn)物、生物轉化、酶、生物量,氮源,碳源：CO2,無機氮源：硫酸銨、硝酸銨、氨水、,有機碳源：玉米漿、黃豆餅粉、尿素、酵母粉、,促進生長，調節(jié)初級代謝及次級代謝的通量,N源的選擇與篩選,不同菌種對不同N源的利用度、利用速率不同黃豆餅粉：紅霉素 酵母粉： 阿維菌素、肌苷/鳥苷、基因工程菌魚粉：螺旋霉素 玉米漿：青霉素無機氮源與有機氮源的組合不同有機氮源的組合、搭配碳、氮源的搭配,在線監(jiān)控考察N源的質量、可利用度和替代效果,背景,N源調控分子機制的理解，有助于發(fā)酵過程工藝的改進,Maltose,優(yōu)先利用,受抑制,S.erythraea,Carbon Catabolite Repression(CCR):菌體優(yōu)先利用PTS轉運的碳源，ABC系統(tǒng)轉運的碳源利用受抑制,發(fā)酵過程中增加ABC轉運系統(tǒng)碳源能有效降低發(fā)酵成本。,培養(yǎng)基糖成本不斷上升,背景,N源調控分子機制的理解，有助于發(fā)酵過程工藝的改進,研究發(fā)現(xiàn)，N源全局調控子GlnR能夠激活ABC型轉運基因，促進麥芽糖、甘露糖等CCR碳源的利用,降低發(fā)酵成本,Proc Natl Acad Sci, 2015,10.1073; Biochem Biophys Res Commun.2016.02.044,背景,N源調控分子機制的理解，有助于發(fā)酵過程工藝的改進,N源全局調控子GlnR和P源代謝雙組分系統(tǒng)PhoP存在相互調控關系，并使N調控和P調控存在交叉。,培養(yǎng)基豆餅粉過多，使發(fā)酵后期N、P源釋放增多，PhoP會促進GlnR表達，抑制紅霉素合成,eryAI,解釋發(fā)酵現(xiàn)象,培養(yǎng)基優(yōu)化,Appl Environ Microbiol, 82(1), 409-420于曉光，儲炬. 磷氮調控對紅霉素重組工程菌ZL1004發(fā)酵過程的影響,三、基于碳氮磷利用速率動態(tài)調控的紅霉素基因工程菌發(fā)酵過程優(yōu)化,問題：玉米漿質量不穩(wěn)定引起紅霉素產(chǎn)量波動大,1 紅霉素基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基氮源優(yōu)化與中試放大,解決方案：采用質量穩(wěn)定的酵母浸粉和酵母粉作為速效有機 氮源,黃豆餅粉33g/L、面包酵母浸粉6.0g/L， 發(fā)酵水平比對照提高了6.3%。,黃豆餅粉33g/L、啤酒酵母浸粉6.0g/L， 發(fā)酵水平比對照提高了20.6%。,黃豆餅粉33g/L、酵母粉10g/L， 發(fā)酵水平略高于對照。,面包酵母浸粉啤酒酵母浸粉,對照培養(yǎng)基1培養(yǎng)基2培養(yǎng)基3培養(yǎng)基4培養(yǎng)基5,酵母粉培養(yǎng)基1酵母粉培養(yǎng)基2酵母粉培養(yǎng)基3,不同速效氮源下的淀粉酶和蛋白酶活比較,1 紅霉素基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基氮源優(yōu)化與中試放大,采用新型速效有機氮源后，胞外淀粉酶和蛋白酶活力大大提高，表明新型氮源下，菌體利用淀粉和黃豆餅粉的能力增強。,玉米漿面包酵母浸粉啤酒酵母浸粉,玉米漿面包酵母浸粉啤酒酵母浸粉,酵母粉培養(yǎng)基1酵母粉培養(yǎng)基2酵母粉培養(yǎng)基3,酵母粉培養(yǎng)基1酵母粉培養(yǎng)基2酵母粉培養(yǎng)基3,紅霉素效價提高15.9%,15L罐二級種子比較,50L罐發(fā)酵水平比較,玉米漿種子酵母粉種子,1 紅霉素基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基氮源優(yōu)化與中試放大,25m3罐發(fā)酵水平比較,酵母粉種子培養(yǎng)基優(yōu)化及25噸罐放大,采用酵母粉后的發(fā)酵水平比對照組提高了21.7%，紅霉素A提高了13.0%。,50L罐發(fā)酵水平比較,1 紅霉素基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基氮源優(yōu)化與中試放大,酵母粉替代玉米漿對工業(yè)生產(chǎn)菌發(fā)酵的影響,采用酵母粉后的發(fā)酵水平和A組分比對照組提高了分別提高了15.3%和14.4%。,工業(yè)生產(chǎn)菌,采用新型速效有機氮源替代工業(yè)培養(yǎng)基中的玉米漿成分，并對種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，成功實現(xiàn)了25噸罐規(guī)模下紅霉素產(chǎn)量的大幅提升（21.7%）。采用新型氮源速效有機氮源，實現(xiàn)了工業(yè)生產(chǎn)菌紅霉素效價的大幅提升（15.4%）。新型速效氮源解決了玉米漿質量不穩(wěn)定引起紅霉素產(chǎn)量波動大的問題,1 小結,問題：發(fā)酵液粘度過高,解決方案：調節(jié)培養(yǎng)基成份,Kanda M, Yamamoto E, Hayashi A, et al. Scale-up fermentation of echinocandin type antibiotic FR901379. Bioscience and Bioengineering. 2010,109(2): 138-144,采用無機銨鹽結合添加營養(yǎng)因子而非傳統(tǒng)有機氮源已經(jīng)成功地使棘白霉素類抗生素發(fā)酵液粘度降低了50%。,發(fā)酵液中殘留的黃豆餅粉是影響菌體分離提取過程的重要因素,Davies JL, Baganz F, Ison AP, et al. Studies on the interaction of fermentation and microfiltration operations: erythromycin recovery from Saccharopolyspora erythraea fermentation broths. Willey and Sons Inc. 2000,64(4): 429-439,指導思想：分析有機氮源、無機氮源對粘度的貢獻， 盡量降低黃豆餅粉的濃度,2.無機氮磷調控降低發(fā)酵液粘度和葡萄糖消耗,發(fā)酵液平均粘度降低18.6%。發(fā)酵過程補糖總量降低61.6%。紅霉素A產(chǎn)量為7926U/ml，相當于對照（8069U/ml）。,A.氮源與粘度關系考察及多尺度相關性分析,硫酸銨敏感參數(shù),培養(yǎng)基設計表,銨離子抑制蛋白酶活性，使菌體利用無機銨而非黃豆餅粉。銨離子的利用導致補糖速率降低。黃豆餅粉中有機磷的釋放限制了菌體OUR水平。磷限制了銨離子的利用，避免了高濃度銨離子的阻遏作用。,初始培養(yǎng)基高酵母粉培養(yǎng)基高硫酸銨培養(yǎng)基,初始培養(yǎng)基高酵母粉培養(yǎng)基高硫酸銨培養(yǎng)基,初始培養(yǎng)基高酵母粉培養(yǎng)基高硫酸銨培養(yǎng)基,初始培養(yǎng)基高酵母粉培養(yǎng)基高硫酸銨培養(yǎng)基,A.氮源與粘度關系考察及多參數(shù)相關性分析,高硫酸銨培養(yǎng)基,Strategy 1,Strategy 2,Strategy 3,添加0.2g/L磷酸二氫鉀,降低豆粉濃度30g/L20g/L,降低硫酸銨8g/L6g/L,降低粘度、降低糖耗,B.氮磷調節(jié)實現(xiàn)低粘度低糖耗的紅霉素發(fā)酵新工藝及代謝機理考察,論文發(fā)表：Chen Y. et al. Bioresource Technology (2013),紅霉素A:策略1提高5.9%，策略2提高10.6%,策略3提高9.6%。策略1、2、3下的葡萄糖消耗速率大幅降低。策略1的粘度略有增加，策略2粘度降低至2084cp，策略3下的粘度為1598cp。,培養(yǎng)基調整后的紅霉素A、葡萄糖消耗、粘度比較,B.氮磷調節(jié)實現(xiàn)低粘度低糖耗的紅霉素發(fā)酵新工藝及代謝機理考察,添加磷酸鹽后，氨基氮消耗速率增加，減豆粉后氨基氮消耗速率更低，表明磷酸鹽和減豆粉增加了銨離子的消耗。氨基氮與葡萄糖消耗速率間的關系表明，銨離子降至低水平時，由銨離子引起的pH降低的效果減弱，同時較多的黃豆餅粉被利用使pH升高。葡萄糖不是發(fā)酵液粘度高的直接原因。,高硫酸銨培養(yǎng)基策略1策略2策略3,B.氮磷調節(jié)實現(xiàn)低粘度低糖耗的紅霉素發(fā)酵新工藝及代謝機理考察,添加無機磷后增加了發(fā)酵后期黃豆餅粉的水解速率，特別是銨離子降低到較低水平階段。氨基酸脫氨基后生成紅霉素合成前體，因而氨基酸濃度影響紅霉素的合成。發(fā)酵后期充足的紅霉素前體氨基酸庫是紅霉素產(chǎn)量提高的重要因素,發(fā)酵液中氨基酸濃度表,氨基酸代謝與紅霉素合成,B.氮磷調節(jié)實現(xiàn)低粘度低糖耗的紅霉素發(fā)酵新工藝及代謝機理考察,丙酸濃度的增加可理解為較低補糖速率下正丙醇利用速率增加，正丙醇通過甲基丙二酰-CoA和琥珀酰-CoA生成了琥珀酸或通過甲基檸檬酸途徑生成琥珀酸。可以適當控制葡萄糖補加速率來降低乙酸的生成。,發(fā)酵液中有機酸濃度比較,丙酸、琥珀酸和乙酸的關系,B.氮磷調節(jié)實現(xiàn)低粘度低糖耗的紅霉素發(fā)酵新工藝及代謝機理考察,綜合調節(jié)無機銨鹽、無機磷、有機氮源的濃度，成功實現(xiàn)了降低發(fā)酵液粘度和葡萄糖消耗速率，同時提升了紅霉素A的水平。,葡萄糖不是紅霉素合成的直接限制因素。葡萄糖補加速率低的原因：銨離子抑制了黃豆餅粉的利用和銨離子消耗伴隨氫離子的生成。磷限制條件下，黃豆餅粉中有機磷的逐漸釋放使銨離子利用速率較低，避免硫酸銨阻遏作用。,發(fā)酵后期充足的前體氨基酸庫有利于維持較高的紅霉素合成速率。,2 小節(jié),問題：黃豆餅粉中有機磷的釋放使發(fā)酵后期溶磷較高，引起 粘度高,解決方案：尋找低磷含量有機氮源，替換高磷含量有機氮源， 控制發(fā)酵中后期的溶磷水平。 在發(fā)酵初期補加無機磷，增加發(fā)酵前期的菌體生長,關于磷酸鹽對紅霉素發(fā)酵的影響的報道多為化學合成培養(yǎng)基，且表明較高的無機磷阻遏紅霉素的合成。,L.M.Reeve, S.Baumberg. Physiological controls of erythromycin production by Saccharopolyspora erythraea are exerted at least in part at the level of transcriptionJ. Biotechnology Letters, 1998, 20(6):585-589.,由于工業(yè)復合培養(yǎng)基中，復合有機氮源中含有一定量的磷，所以很少有人研究有機氮源磷含量對發(fā)酵過程的影響。,指導思想：保證總氮大體不變的條件下，降低發(fā)酵后期溶 磷的釋放 通過流加無機磷，增加發(fā)酵初期磷的利用速率,3.不同磷含量氮源組合及無機磷補加調控發(fā)酵過程磷水平,玉米蛋白粉的磷含量為黃豆餅粉的53%酵母粉中的磷含量高達0.87%。有機氮源較高的磷含量使發(fā)酵后期的溶磷水平較高。,不同氮源的磷含量測定結果,A 不同氮源的磷含量測定結果,粘度降低、溶磷降低、效價相當。,采用玉米蛋白粉替代黃豆餅粉,B 降低有機氮源磷含量控制發(fā)酵后期溶磷水平,培養(yǎng)基調整后的發(fā)酵過程參數(shù)比較,對照培養(yǎng)基1培養(yǎng)基2,對照培養(yǎng)基1培養(yǎng)基2,對照培養(yǎng)基1培養(yǎng)基2,對照培養(yǎng)基1培養(yǎng)基2,采用玉米蛋白粉替代酵母粉,培養(yǎng)基2紅霉素效價11513 U/ml紅霉素、A組分為8697U/ml。,培養(yǎng)基調整后的發(fā)酵過程參數(shù)比較,降低有機氮源磷含量控制發(fā)酵后期溶磷水平,對照培養(yǎng)基紅霉素效價10974U/ml，A組分8312U/ml。,培養(yǎng)基1下的紅霉素效價為9691 U/ml、A組分為7676 U/ml。,無機磷替代速效氮源酵母粉,6g/L酵母粉時，流加磷酸鹽紅霉素效價高達13273 U/ml，比初始對照提高了20.9%,B. 降低速效氮源酵母粉結合無機磷流加,培養(yǎng)基調整后的發(fā)酵過程參數(shù)比較,采用玉米蛋白粉和黃豆餅粉組合后，粘度峰降低、溶氧增加，轉速由630r/min降至498r/min。紅霉素效價A組分提高9.4%，雜質組分降低。降低原因為傳質的改善。,C. 低磷含量有機氮源在生產(chǎn)菌發(fā)酵的應用,發(fā)酵液中紅霉素組份濃度比較,采用高、低磷含量氮源組合及流加無機磷的策略，提升了紅霉素的產(chǎn)量，降低了發(fā)酵液的粘度。,采用高、低磷含量氮源組合降低了生產(chǎn)菌發(fā)酵液的粘度，同時維持與對照相當?shù)募t霉素效價。,紅霉素產(chǎn)量高達13273 U/ml，比未補加磷酸鹽時的效價提高了20.9%。并在500L規(guī)模罐成功放大。,揭示了無機磷和有機氮源中的磷在紅霉素發(fā)酵過程的重要作用。,3. 小節(jié),總結,采用多尺度多參數(shù)相關性分析獲得的碳氮磷利用規(guī)律為進一步紅霉素工藝改進提供指導作用，同時為其它相關抗生素發(fā)酵提供參考。這些實驗結果為進一步在分子、酶學等水平深入研究代謝機理提供了新的切入點。,輔酶Q10氮源限制與合成代謝之間關系上的應用,基于N源調控的其他發(fā)酵產(chǎn)品案例,氮源-代謝,不同稀釋倍數(shù)氮源濃度對發(fā)酵影響,輔酶Q10氮源限制與合成代謝之間關系上的應用,調整氮源補加量,輔酶Q10氮源限制與合成代謝之間關系上的應用,不同氮源的合理搭配利用速效氮源：氨基態(tài)氮和玉米漿，促進菌體生長，但對部分產(chǎn)物，特別是次級產(chǎn)物合成有抑制作用。緩慢氮源：延長產(chǎn)物合成期。,工業(yè)糖化酶發(fā)酵補料培養(yǎng)基優(yōu)化,棉籽蛋白和糖蜜對酶活差值的交互作用的響應面圖和等高線圖,工業(yè)糖化酶發(fā)酵補料培養(yǎng)基優(yōu)化,糖蜜和硫酸銅對酶活差值的交互作用的響應面圖和等高線圖,工業(yè)糖化酶發(fā)酵補料培養(yǎng)基優(yōu)化,棉籽蛋白和硫酸銅對酶活差值的交互作用的響應面圖和等高線圖,工業(yè)糖化酶發(fā)酵補料培養(yǎng)基優(yōu)化,優(yōu)化后的補料培養(yǎng)基配方：新型有機氮源4.19g/L，糖蜜9.01g/L，硫酸銅0.015g/L。最終，優(yōu)化補料罐的酶活達到18327.5 AGI/mL，比對照罐（16460 AGI/mL）增加了11.35 %。,氮源利用與產(chǎn)品質量控制,1. 大腸桿菌表達海藻糖合成酶,表1. 培養(yǎng)基組成,對照組為OXOID 氮源，實驗組為安琪酵母浸粉（FM405、FM802、FM803、FM808、FM888、FM906，共六種）和蛋白胨（FP103、FP318、FP803，共3種），進行完全替代,不同氮源情況下的菌濃,不同氮源情況下的酶轉化率,2. 莫西菌素發(fā)酵,表1. 氮源等量替換,不同氮源情況下的總效價和PMV,表2. 氮源含量（LM902）優(yōu)化實驗,不同LM902含量下的的總效價和PMV,表3. 安琪酵母膏與國藥酵母膏成本分析（單罐）,3. 頭孢菌素C發(fā)酵,不同氮源對頭C發(fā)酵的影響,4. 土霉素發(fā)酵,不同氮源對土霉素發(fā)酵的影響,土霉素發(fā)酵前期補2-3次酵母粉，放罐單位比對照高1500u/ml。青霉素發(fā)酵47小時開始加尿素，每6小時補加一次，結合補加乳糖，發(fā)酵單位可達40000u/ml以上。赤霉素生產(chǎn)補加的氮源是花生粉，配16的花生粉液體，當菌生長到粘度大于15秒時，說明氮源被消耗很多，就開始補加花生粉。對于含氮產(chǎn)物的生產(chǎn)特別需要補氮。,四、用于考察N源的專用設備及應用,用于考察N源的專用設備及應用,Scale up,Scale down,微型化,高通量,標準化,多尺度菌種表型研究,在線顯微儀研制,申請PCT專利（美國PCT/CN2008/071348 ）,HEK293細胞,微載體細胞,用于考察N源的專用設備及應用,在線顯微鏡在放線菌和酵母培養(yǎng)過程中形態(tài)變化的采集,活細胞傳感器與在線參數(shù)采集整合,活細胞傳感儀測定分析,總體目標,利用高通量技術培養(yǎng)，建立紅曲霉的微型化培養(yǎng)及批量檢測方法,高通量培養(yǎng)和篩選技術,改良菌種,改善發(fā)酵條件,液態(tài)發(fā)酵,用于考察N源的專用設備及應用,高通量培養(yǎng)技術,裝液量：500 2000 ul,24孔,48孔,96孔,固體培養(yǎng)和菌種保藏,用于考察N源的專用設備及應用,可滅菌、重復使用壽命長、成本低、易清洗、能統(tǒng)一標準、防交叉污染、透氣性好、防止水分蒸發(fā),孔板蓋,用于考察N源的專用設備及應用,微孔板固定架,板數(shù)：882128,孔數(shù)：128243072 128486144 1289612288,用于考察N源的專用設備及應用,84h,50 L,Shake flaskfor 48h,Experimental design,Oxygen supply,Shear force,Preliminary exploration in shake flask,用于平行研究用的八聯(lián)罐系統(tǒng),Shear force,400rpm,500rpm,600rpm,700rpm,26,27,29,30,Primary cultivation in 50L bioreactor for 80h,Transfer,Continued cultivation in 8 joint fermenters fo