【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）地衣芽孢桿菌來源β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆、改造及其表達(dá)微生物學(xué)碩士論文

密級 ： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 地衣芽孢桿菌來源 克隆、改造及其表達(dá) F I 摘 要 被廣泛應(yīng)用到釀酒和飼料工業(yè)中。 國內(nèi)對天然菌株的產(chǎn)酶量及酶的性能滿足不了實(shí)際應(yīng)用。然 而，分子生物學(xué)、基因工 程方法的應(yīng)用為其提供了契機(jī)。 現(xiàn)在 國內(nèi)外對 本研究的主要目的就是通過基因工程及分子生物學(xué)方法來提高 善其酶學(xué)特性 ，為目前生產(chǎn)中的問題提供有效的解決途徑。主要研究內(nèi)容及相應(yīng)結(jié)果如下： 1. 天然菌株產(chǎn)酶研究 在基礎(chǔ)產(chǎn)酶研究的基礎(chǔ)上對培養(yǎng)基碳氮源及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明， 4復(fù)合碳源燕麥粉、麩皮等比單一成分葡萄糖、蔗糖效果好， 1天然氮源蛋白胨同樣優(yōu)于無機(jī)、有機(jī)氮源。利用優(yōu)化的營養(yǎng)成分組成 培養(yǎng)基， 150 的情況下天然菌株發(fā)酵 48 h 得到最高的產(chǎn)酶量。 2. 表達(dá) 以 B. 因組 模板擴(kuò)增獲得了編碼 它克隆到表達(dá)載體 )，然后轉(zhuǎn)化 E. 重組菌經(jīng) 導(dǎo)表達(dá)的重組酶 N 末端帶有 6 個 簽，分子量達(dá) 28達(dá)量占總蛋白的 占細(xì)胞 可溶性蛋白的 重組酶活力分別為 1286(1%大麥 和 986(1地衣多糖為底物 )U 活分別為 2479(1%大麥 和 1906(1地衣多糖為底物 )U 利用子親和層析柱純化目的蛋白 ， 重組酶最適 溫度分別為 40 。 3. 表達(dá) 對以 B. 因組 模板進(jìn)行 增獲得的編碼 因進(jìn)行密碼子優(yōu)化改造，共改變 102個堿基， 量從 降到 將優(yōu)化基因 ，重組載體 酶切線性化后電轉(zhuǎn)化 P. 過篩選得到陽性重組子。重組 酶 在 P. 實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)，搖瓶水平上 %大麥 和 地衣多糖為底物 ) U 未進(jìn)行優(yōu)化的 (4U 高了約 15 倍； 7L 發(fā)酵罐水平上蛋白分泌量達(dá) 250 活力達(dá)到 %大麥 和 地衣多糖為底物 ) U 活為 %大麥 和 地衣多糖為底物 ) U 最高產(chǎn)酶水平比未優(yōu)化基因高 50 多 倍。 重組酶由于發(fā)生糖基化作用分子量高達(dá) 34總分泌蛋白的 最適 最適反應(yīng)溫度分別為 45； 酶有激活作用， 對酶有抑制作用；且重組酶表現(xiàn)了嚴(yán)格的底物特異性，作用于大麥 物對乳酸菌等益生菌的生長有顯著促進(jìn)作用。 根據(jù) 泳和酶的功能性分析證明，優(yōu)化的重組蛋白已在 P. 實(shí)現(xiàn)表達(dá)，且 熱穩(wěn)定性有所提高。 關(guān)鍵詞： 地衣芽孢桿菌， 斯德畢赤酵母，基因改造 , 表達(dá) as an in is in of of a to At in or on of is to of it be an in 635) in as 1. of on - . of of it % as as % is 150 48 h. 2. is CR of NA . it 48 ), is . W of is 8 at of is of of in in ,286 86 U %(w/v) %(w/v) ,479 ,906 U is of .6 0 , 3. is CR of NA . In a 02 +C is is is . is on is . At 7.9 %(w/v)%(w/v)as it is by 5 U L is 50 33.7 %(w/v)%(w/v)as ,334.8 , is 0 W of is 4 it is of of .0 5 of as . 錄 第一章 引言 . 1 . 1 . 1 . 1 . 2 . 4 . 4 原核表達(dá)系統(tǒng) 統(tǒng) . 6 統(tǒng)概述 . 6 體 . 6 主菌 . 7 巴斯德畢赤酵母 寫 P. 達(dá)系統(tǒng) . 7 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu) 勢特點(diǎn) . 7 表達(dá)載體 . 8 翻譯后修飾及加工 . 11 P. 酵條件研究 . 12 P. 酵策略研究 . 13 外源基因自身 的改造方法 . 14 存在問題及實(shí)驗(yàn)方案 . 15 本研究目的及意義 . 17 第二章 天然菌株 地衣芽孢桿菌 酶研究 . 18 材料 . 18 方法 . 18 產(chǎn)酶培養(yǎng)基的優(yōu)化 . 18 發(fā)酵條件的優(yōu)化 . 18 酶活測定 . 19 果與分析 . 19 不同碳氮源的影響 . 19 發(fā)酵條件的優(yōu)化 . 20 討論 . 21 第三章 原核表達(dá)：地衣芽孢桿菌 源 34. 表達(dá) . 22 料 . 22 法 . 24 重組載體的構(gòu)建 . 24 重組大腸桿菌的構(gòu)建 . 27 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)與 . 28 V 重組酶的純化 . 28 重組酶的酶學(xué)性質(zhì) . 29 果與分析 . 29 . 29 . 30 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 . 33 重組酶的 . 36 重組酶的純化 . 36 重組酶 的 酶學(xué)性質(zhì) . 37 論 . 40 達(dá)水平研究 . 40 達(dá)系統(tǒng)研究 . 40 學(xué)性質(zhì)研究 . 41 第四章 真核表達(dá)： . . 42 料 . 42 法 . 43 B. 源 . 43 重組載體的構(gòu)建 . 44 重組酵母的構(gòu)建 . 45 重組酵母的產(chǎn)酶發(fā)酵 . 46 發(fā)酵參數(shù)的檢測 . 47 重組酶的酶學(xué)性質(zhì) . 48 酶解產(chǎn)物分析 . 48 結(jié)果與分析 . 49 密碼子優(yōu)化 . 49 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證 . 50 重組酵母的構(gòu)建 . 52 重組酵母的產(chǎn)酶發(fā)酵 . 53 重組酶的酶學(xué)性質(zhì) . 58 討論 . 62 密碼子優(yōu)化 . 62 表達(dá)載體、宿主菌株的優(yōu)化選擇 . 63 重組酵母發(fā)酵罐水平上的條件優(yōu)化 . 63 P. 密度發(fā)酵的優(yōu)勢 . 64 基因重組與表達(dá)策略研究 . 64 提高表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性的研究 . 66 第五章 結(jié)論與展望 . 67 參考文獻(xiàn) . 69 致謝 . 75 作者簡歷 . 76 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 1 第一章 引言 富含在大麥、 黑麥、高粱、稻和小麥等作物的胚乳細(xì)胞壁中，不同物種其含量、比例也不相同（表 1早期研究認(rèn)為大麥 鍵；但越來越多的試驗(yàn)證明，大麥 鍵，且 鍵和 鍵的分布不是隨機(jī)的。不同來源 鍵和 鍵所占的比例也不盡相同，其中 鍵占 25%30%。 表 1 in 源 g 麥粒比例 大麥 33 麥 5 黑麥 12 麥 7 為水溶性和水不溶性兩種。水溶性 與蛋白質(zhì)結(jié)合的 中 鍵的含量和糖的聚合度是影響水溶性的主要因素。 濃度愈高 ， 粘度愈大。高濃度 夠吸收其周圍的水分子 ， 從而降低周圍環(huán)境的物理 特性。 在溶液中極易與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合。此外 ， 、鈉等金屬離子以及有機(jī)質(zhì)。 制造麥芽汁過程中，由于大量高分子 使麥芽汁粘度增大，過濾困難；在發(fā)酵過程中過量的 酵母早期沉淀。在動物飼養(yǎng)中，存在于飼料中的 粘性、高親水性、高吸水活性及吸附性等）影響營養(yǎng)物質(zhì)在動物體內(nèi)的代謝，從而降低動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率。 在于植物和微生物中，人和動物體內(nèi)是缺乏的。目前，在桿菌 (, et 2005)、 梭菌 (, et 1991)、纖維菌 ( N, et 2005)、真菌 ( A, et 2002)、高等植物 ( J, et 2001)中都發(fā)現(xiàn)了 表1。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 2 表 1 源菌株 分子量 （ 文獻(xiàn) M. S, 1997 et 2005 J Y, 2003 文平等 . 2004 M, et 2005 宇等 . 2004 T, et 2005 , et 2003 衛(wèi)芬等 . 2004 L, et 2001 N, et 2005 A, et 2002 構(gòu)特征 200 多個 鍵和 鍵按 1:比例連接而成的鏈狀高分子化合物。將大麥中分離出的水溶性 凝膠過濾層析和甲基化方法確定結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，近 90%的多糖是由 鍵所分隔的纖維三糖和纖維四糖單元組成， 5連續(xù)的 糖苷鍵相連的寡糖單元也占有較高的比例 （ 1997） 。 來源于桿狀細(xì)菌的 6 家族，均具有一個相似的氨基酸序列，含保守序列 中的兩個谷氨酸殘基具有水解催化能力）。 非芽孢桿菌屬來源 它們還經(jīng)常帶有一個附加區(qū)，如 源 09 個氨基酸的功能區(qū)，其中包含一個 30 個蘇氨酸序列。 通過 研究來源 B. B. 交獲得的 它同樣屬于糖苷水解酶 16 家族，也得到了 第一 個 芽孢桿菌產(chǎn) 是反向平行 折疊體系 (圖 1蛋白核心通過兩個 折疊互相堆積形成一個三明治結(jié)構(gòu)，由七個反平行鏈組成，每條鏈?zhǔn)菑澢?，朝外的一面?gòu) 成一個凹穴，便于基質(zhì)的結(jié)合。 折疊環(huán)大部分是由 轉(zhuǎn)角建立的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，只發(fā)現(xiàn)一個具有 螺旋的轉(zhuǎn)角。主環(huán)表面覆蓋了部分由 折疊形成的基質(zhì)結(jié)合區(qū)， 間的二硫鍵將主環(huán)和蛋白核心形成的 折疊連接起來。在分子凸面遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)處是鈣離子結(jié)合區(qū)域，起到穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的作用 （ 2000） 。 分子的凹面區(qū)域認(rèn)為是底物結(jié)合位點(diǎn)，可被外圍的芳香族殘基和底部的酸式殘基線性化，催化殘基位于具有嚴(yán)格極性和非極性鏈轉(zhuǎn)換的 折疊上，該鏈的第一個催化殘基朝向蛋白表面，能夠與基質(zhì)相互作用，其后的則朝向疏水的內(nèi)部 （ A. C, 1995） 。這種結(jié)構(gòu)類型在 16中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 3