【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）雞馬立克氏病病毒細(xì)菌人工染色體的構(gòu)建預(yù)防獸醫(yī)學(xué)碩士論文

雞馬立克氏病病毒細(xì)菌人工染色體的構(gòu)建 s 14 as an s 14 as an 摘 要 雞馬立克氏?。?s 危害養(yǎng)雞業(yè)的主要傳染病之一。該病以 T 淋巴細(xì)胞增生 性腫瘤 、高度接觸性傳染以及造成雞的嚴(yán)重免疫抑制為特征，其病原為雞馬立克氏病病毒（ s 該病毒屬皰疹病毒科 毒，基因組大約 180據(jù)抗原性不同，馬立克氏病病毒（ 分為 3 種血清型，血清 1 型包括所有致瘤的馬立克氏病病毒，含強(qiáng)毒及其致弱的變異毒株；而血清 2 型包括所有不致瘤的馬立克氏病病毒；血清 3 型包括所有的火雞皰疹病毒（ of 其變異毒株。 由于 嚴(yán)格的細(xì)胞結(jié)合病毒， 對 因組進(jìn)行基因操作和研究十分困難，近幾年細(xì)菌人工染色體技術(shù)的出現(xiàn)解決了這一難題，首先構(gòu)建 菌人工染色體（ 然后利用分子克隆化病毒 粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，啟動病毒感染，產(chǎn)生純系重組病毒。 子克隆化病毒服從大腸桿菌基因操作技術(shù)，在大腸桿菌中可以對其進(jìn)行 方便的基因操作和研究。尤其是利用近幾年來發(fā)展起來的現(xiàn)代 隆技術(shù) T 技術(shù)，它可以在細(xì)菌中對病毒基因組實(shí)施快速有效的各種修飾（刪除、插入和點(diǎn)突變），甚至對病毒基因組的必需基因進(jìn)行有效的突變。 本研究的目的是構(gòu)建雞馬立克氏病病毒 814株 全基因組感染性分子克隆化病毒 細(xì)菌人工染色體，建立雞馬立克氏病病毒的反向遺傳操作技術(shù)平臺。首先利用自主構(gòu)建的表達(dá) 哺乳動物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移遺傳選擇標(biāo)記（ 帶有細(xì)菌人工染色體（ 本基因功能序列（ 功構(gòu)建了雞馬立克氏病病毒重組病毒轉(zhuǎn)移載體 用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將轉(zhuǎn)移載體與馬立克氏病病毒感染胞的總 轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞， 啟動病毒感染后， 在選擇培養(yǎng)基的遺傳選擇加壓條件下，經(jīng)八輪篩選、富集并完全純化了重組病毒；適時提取環(huán)化重組病毒感染 胞的總 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 取陽性克隆經(jīng)酶切圖譜、凝膠電泳和 定 子克隆化病毒，經(jīng)鑒定獲得了 38 個 子克隆化病毒，并且用編號為 克隆提取純化的染次代 胞，再次啟動了病毒感染，產(chǎn)生了 異性病毒蝕斑，拯救出了重組病毒；進(jìn)一步研究表明重組病毒 生病毒 拯救的重組病毒種病毒在體外雞胚成纖維細(xì)胞上的生物學(xué)特性相似；進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)研究表明 14、 14、 菌 疫雞部分能夠抵抗 強(qiáng)毒的攻擊 ，表明 苗具有作為預(yù)防 雞馬立克氏病新型疫苗進(jìn)行開發(fā)的潛力。本研究為進(jìn)一步研究雞馬立克氏病病毒的致瘤機(jī)制、潛伏機(jī)制和基因功能提供了很好遺傳操作技術(shù)平臺，同時也為以馬立克氏病病毒毒細(xì)菌人工染色體為基礎(chǔ)的新型基因工程疫苗的開發(fā)和應(yīng)用提供了強(qiáng)大的技術(shù)平臺。 關(guān)鍵詞： 馬立克氏病病毒；細(xì)菌人工染色體；分子克隆化病毒；感染性分子克隆 s is a of of is a in of D. It is DV is a a of is on of as a is as a be by . is T of of of of of to s (814 as an In AC a 000, in to It to of in an s s in -1 NA to D. in a of in be In it be to a s 目 錄 第一章 緒論 . 1 究簡述 . 1 . 1 分類 . 2 病原學(xué)特征 . 3 基因和蛋 白 . 5 增殖與感染 . 7 疫苗防控策略 . 8 菌人工染色體技術(shù)研究進(jìn)展 . 9 體系統(tǒng)簡述 . 9 子克隆化病毒 . 10 細(xì)菌人工染色體的修飾技術(shù) . 11 研究的目的和意義 . 14 第二章 細(xì)菌人工染色體重組病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 . 15 料 . 15 質(zhì)粒、菌種、病毒與試劑 . 15 主要儀器 . 15 法 . 16 細(xì)菌人工染色體重組病毒轉(zhuǎn)移載體的設(shè)計及技術(shù)路線 . 16 體基本功能基因序列制備 . 18 表達(dá) 正選擇標(biāo)記基因的構(gòu)建 . 20 轉(zhuǎn)移載體 構(gòu)建 . 20 果 . 21 體基本功能基因序列制備 . 21 表達(dá) 正選擇標(biāo)記基因的鑒定 . 24 組病毒轉(zhuǎn)移載體 鑒定 . 25 論 . 26 制備 體基本功能基因序列 . 26 表達(dá) 正選擇標(biāo)記基因 . 27 細(xì)菌人工染色體重組病毒轉(zhuǎn)移載體的核心序列 . 28 第三章 細(xì)菌人工染色體重組馬立克氏病病毒的構(gòu)建 . 30 料 . 30 菌種、細(xì)胞、病毒與試劑 . 30 主要儀器 . 30 法 . 31 電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒 宿主菌 . 31 轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的提取和純化 . 32 轉(zhuǎn)染用 染細(xì)胞總 制備 . 32 轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒與 共轉(zhuǎn)染 . 32 重組病毒 初步篩選和富集 . 33 重組病毒 純化 . 34 重組病毒 鑒定 . 34 果 . 35 轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化、保種、純化及純度測定 . 35 轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒與 共轉(zhuǎn)染啟動病毒感染 . 35 重組病毒 篩選和純化 . 36 重組病毒 鑒定結(jié)果 . 37 論 . 38 第四章 感染性 子克隆化病毒的篩選 . 41 料 . 41 菌種、細(xì)胞、病毒與試劑 . 41 主要儀器 . 41 法 . 42 構(gòu)建感染性 子克隆化病毒的技術(shù)路線 . 42 電轉(zhuǎn)化分子克隆化病毒感受態(tài)細(xì)菌 制備 . 43 環(huán)化重組病毒細(xì)胞總 提取 . 43 電轉(zhuǎn)化篩選 化子 . 43 化子的初步鑒定 . 44 子克隆化病毒克隆質(zhì)粒的提取和純化 . 44 限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析 . 44 子克隆化病毒的外源目的插入片段的 定 . 45 子克隆化病毒中病毒基因組的 定 . 45 染用 提取和純化 . 47 體總 制備 . 48 染 . 48 重組病毒 . 48 救 重組病毒 鑒定 . 49 組病毒、野生病毒與拯救的重組病毒在體外生長特性的比較 . 49 果 . 49 電轉(zhuǎn)化篩選 化子 . 49 限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析結(jié)果 . 50 子克隆化病毒的外源目的插入片段的 定結(jié)果 . 51 子克隆化病毒的病毒基因組的 定結(jié)果 . 51 濃度和純度 . 52 拯救的重組病毒 . 53 重組病毒 生病毒 拯救的重組病毒 病毒蝕斑的形態(tài)比較 . 53 重組病毒 生病毒 拯救的重組病 毒 病毒生長曲線的比較 . 54 論 . 54 第五章 疫效力初步試驗(yàn) . 58 料 . 58 病毒、菌種與試劑 . 58 主要儀器 . 58 法 . 58 動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計 . 58 毒株的復(fù)壯 . 60 各種 疫制劑的制備 . 60 驗(yàn)結(jié)果 . 61 各實(shí)驗(yàn)組雞只存活率及攻毒死亡變化 . 61 各實(shí)驗(yàn)組雞 只 病情況 . 62 論 . 63 第六章 全文結(jié)論 . 65 參考文獻(xiàn) . 66 致 謝 . 錯誤 !未定義書簽。 作者簡歷 . 錯誤 !未定義書簽。 圖表清單 圖 1因組結(jié)構(gòu)簡圖 . 1基因組線性物理圖譜 . 1T 同源重組的應(yīng)用 . 1感染性雞馬立克氏病病毒的細(xì)菌人工染色體的構(gòu)建與修飾 . 2. 2 案 示意圖 . 2 線 示意圖 . 2. 2. 2質(zhì)粒 凝膠電泳分析 . 2列的物理圖譜 . 2質(zhì)粒 物理圖譜 . 2質(zhì)粒 . 2粒 定圖 . 2粒 . 2粒 . 2粒 定圖 . 2 . 3通過轉(zhuǎn)移載體將細(xì)菌人工染色體核心序列重組到 毒基因組示意圖 . 3轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒與 . 3重組病毒 . 3重組病毒 . 4子克隆化 病毒 的構(gòu)建 技術(shù) 路線 示意圖 42 圖 4通凝膠電泳分析 . 4部分限制性內(nèi)切酶 酶切圖譜分析 . 4. 4. 414, 14 和 14 體外病變蝕斑形態(tài)的比較 . 4野生病毒、重組病毒和拯救重組病毒省長曲線的比較 . 5動物實(shí)驗(yàn)方案以及動物實(shí)驗(yàn)的過程 5各實(shí)驗(yàn)組雞只存活情況 . 61 圖 5各實(shí)驗(yàn)組雞只攻毒死亡變化曲線 5各實(shí)驗(yàn)組雞只 病情況 5動物實(shí)驗(yàn)中 . 1真核基因組克隆載體及其特點(diǎn)