【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）麥長管蚜G蛋白β和γ亞基的基因克隆及其相互作用蛋白的篩選農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治論文

密級 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 學位論文 麥長管蚜 G 蛋白 和 亞基的基因克隆 及其相互作用蛋白的篩選 I 摘 要 G 蛋白偶聯(lián)信號傳導系統(tǒng)是生物體內(nèi)一類重要的細胞信號傳導途徑，其在高等動物、簡單真核生物、昆蟲及植物中普遍存在。 國際上，以果蠅為模式昆蟲，對 G 蛋白的結構與功能作了較多的研究，證實 G 蛋白參與 了昆蟲的嗅覺、視覺和內(nèi)分泌激素等多種信號的傳導過程。但是，目前對其它昆蟲 G 蛋白及其信號 傳導途徑的研究報道很少，針對一些重要害蟲的 研究更少。開展昆蟲G 蛋白偶聯(lián)信號傳導途徑研究，不僅可以明確昆蟲對信號分子的感受機理，還可以闡明影響 G 蛋白偶聯(lián)信號傳導途徑某個環(huán)節(jié)的阻礙機制 ， 為今后深入研究病蟲害信號 傳遞機制和調(diào)控機理奠定理論基礎。 本文選擇小麥上的重大害蟲麥長管蚜作為實驗材料， 利用 術及 法進行異源三聚體 G 蛋白 和 亞基的基因克隆，并利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究已克隆的麥長管蚜 和 亞基之間是否互作，并篩選與其相關的作用蛋白。本研究取得如下主要結果： (1) 從麥長管蚜中首次克隆了 G 蛋白 和 兩個亞基基因，已被 據(jù) 庫收錄，登錄號分別為 克隆的 亞基與岡比亞按蚊 ( 果蠅( G 蛋白 1 亞基 氨基酸序列同源性 達 90 %， 與哺乳動物 2 型亞基的同源性為 80， 具有一個由 7 個 40(色氨酸天冬氨酸， 復片斷組成的保守區(qū)； 克隆的 亞基與果蠅腦中表達的 1亞基氨基酸同源性為 60 %， 與哺乳動物 7亞型 的同源性為 38，具有 守區(qū)， 個氨基酸 守基序。根據(jù)氨基酸 序列 同源性比較 結果，初步推測 克隆的麥長管蚜 和 亞基與果蠅的 1 和 1亞型、哺乳動物的 2 和 7 亞型相似。 (2) 用半定量 法對麥長管蚜 G 蛋白 和 亞基基因進行了組織和蟲期的轉(zhuǎn)錄平 研究。結果表明，兩個亞基的基因在麥長管蚜各蟲期及頭、胸和腹部 都能 轉(zhuǎn)錄，且頭部的轉(zhuǎn)錄水平最高。麥長管蚜 G 蛋白 和 亞基的這種組織分布廣泛性，可能預示其參與細胞的 多種信號 傳導途徑。 (3) 通過 構建麥長管蚜的 庫，用克隆的 亞基做誘餌進行 酵母雙雜交篩選 ，得到與其 相互作用的蛋白。共鑒定了 120 多個陽性克隆，對 40 個具有代表性的克隆進行測序。通過詢和分析，發(fā)現(xiàn) 13 個克隆分別與 G 蛋白受體激酶 7( G 蛋白偶聯(lián)受體126(核糖體蛋白等基因序列部分同源，其它的克隆序列在 未查到相似基因，可能是一些尚未公布的新基因片斷。這些克隆的獲得，為進一步研究麥長管蚜 G 蛋白 亞基在信號傳導中的作用奠定了基礎。用克隆的 亞基做誘餌僅篩到了 7 個陽性克隆，在 沒有查到與之類似的基因，有待進一步鑒定。 (4) 用酵母 雙雜交系統(tǒng)研究克隆的麥長管蚜 G 蛋白 和 亞基之間是否存在互作。在生物體內(nèi)， G 蛋白 和 亞基只有結合成二聚體才具有信號傳導的功能。本試驗沒有 篩到相互作用的陽性克隆，可能是克隆的這兩個亞基之間不能結合或結合 力很弱， 推測 麥長管蚜中可能存在其它亞型的 和 亞基，有待進一步試驗證明。 (5) 克隆了麥長管蚜小 G 蛋白 族 基因， 在 的登錄號為 是一類 結合 具有 活性的信號傳導蛋白，它能通過調(diào)節(jié)細胞骨架肌動蛋白 聚合來控制昆蟲翅脈 (分化。通過半定量 法研究發(fā)現(xiàn)，麥長管蚜 一齡若蚜 就有較高 的轉(zhuǎn)錄水平， 且若蚜期高于成蚜期， 有翅蚜高于無翅蚜。這些結果表明， 因具有時空轉(zhuǎn)錄 的特異性，在翅脈的分化過程中起正調(diào)控作用，由此推測翅脈的分化可能從一齡若蚜期開始。 (6) 克隆了麥長管蚜肌動蛋白基因的部分 列。獲得了四個陽性克隆，通過序列比較分析，將核苷酸序列差異較大的克隆 登記，登錄號分別為 索結果發(fā)現(xiàn)，與所有已知的肌動蛋白氨基酸同源性都在 94%以上。該基因的分離為深入研究小 G 蛋白 何通過調(diào)節(jié)細胞骨架肌動蛋白的聚合來調(diào)控翅脈的分化奠定了基礎。 通過本文研究，首次從 麥長管蚜中分離和克隆了 G 蛋白及其與信號傳導途徑相關蛋白的基因5 個。通過轉(zhuǎn)錄水平的研究證實，克隆的 G 蛋白 和 亞基屬于廣泛組織分布型，可能參與細胞多種信號途徑的傳導。酵母雙雜交的研究表明， G 蛋白 亞基能與其偶聯(lián)受體激酶作用，使受體脫敏化而終止信號的傳導。半定量 昆蟲翅脈分化相關的小 有時空轉(zhuǎn)錄的 特異性，在翅脈的分化過程中起正調(diào)控作用。 以上對麥長管蚜 G 蛋白的研究結果，目前在國內(nèi)外均未見報道。 這些成果的取得，為進一步研究麥長管蚜 G 蛋白的功能及其信號傳導途徑奠定了基礎，對深入開展昆蟲與寄主植物互作 機理及植物抗蟲機制的研究，開辟防治新途徑具有極為重要的理論和實踐意義 。 關鍵詞 ： 麥長管蚜， G 蛋白 亞基 ， 基因克隆， 酵母雙雜交 ，信號傳導 in is of in as on in as is in in to in on of In an in as (1) 3/5) 0% 0% 0% 1 in 8% 7 in is of GL G in by an on of it 1 1 2 7 in (2) by in at in in in (3) as 20 0 to os ( 26 ( 28S 8S NA No IV be of in as no to (4) no of is or is no is to - it be (5) of ho by in at in in in in in it of of (6) By of 4% of on of In on in in by of V is no at It on of of 錄 第一章 引 言 . 1 蛋白的基本結構和種類 . 1 蛋白的調(diào)控循環(huán) . 2 蛋白 亞基 . 2 蛋白 亞基的種類及組織分布 . 2 蛋白和亞基的基本 結構特點 . 3 蛋白 和 亞基形成二聚體的能力 . 3 蛋白 亞基與 亞基、受體和效應器的結合 . 4 蛋白偶 聯(lián)的信號傳導系統(tǒng)及各組分的結構和功能 . 4 蛋白偶聯(lián)受體 (. 5 蛋白各亞基結構和功能關系 . 5 蛋白主要效應器 . 6 G 蛋白信號傳導途徑及網(wǎng)絡化 . 6 s 途徑 . 7 i 途徑 . 8 q 途徑 . 8 12 和 徑 . 8 G 蛋白超家族概述 . 8 蟲 G 蛋白信號途徑的研究進展 . 9 蛋白偶聯(lián)受體 . 9 蛋白及其下游效應器 . 10 蛋白在昆蟲信號傳導中的作用研究 . 10 母雙雜交系統(tǒng)研究蛋白與蛋白之間的相互作用 . 12 母雙雜交系統(tǒng)簡介 . 12 母雙雜交系統(tǒng)的應用 . 12 母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點 . 13 究的目的和意義 . 14 第二章 麥長管蚜 G 蛋白和亞基的基因克隆與組織分布 . 15 料與方法 . 15 試昆蟲 . 15 養(yǎng)基 . 15 要試劑 . 16 器設備 . 16 驗技術路線圖 . 17 提取 . 17 合成 . 18 物的設計 . 18 應 . 20 應 . 21 應 . 22 物的回收純化 . 23 接反應 . 24 腸桿菌感受態(tài)細胞的制備 . 24 化大腸桿菌 . 24 落 定陽性克隆 . 24 列測定 . 25 頭、胸 和腹部進行半定量 . 25 果與分析 . 27 亞基的基因克隆及序列分析 . 27 亞基在不同組織及各 蟲期的轉(zhuǎn)錄水平 . 35 亞基的基因克隆及序列分析 . 37 亞基在不同組織及各蟲期的轉(zhuǎn)錄水平 . 43 論 . 45 隆的麥長管蚜 和 亞基與其它物種的氨基酸同源性分析 . 45 和 亞基的結構與其功能關系 . 45 于半 定量 法的探討 . 45 第三章 雙雜交篩選與麥長管蚜 G 蛋白 和 亞基作用的蛋白 . 47 料與方法 . 47 料 . 47 劑： . 47 術路線圖 . 51 別用麥長管蚜 G 蛋白 和 亞基構建誘餌蛋白 . 52 建 庫 . 55 用構建好的誘餌蛋白篩選 庫 . 57 母共轉(zhuǎn)化法研究克隆的和亞基之間的互作 . 60 果與分析 . 61 餌蛋白的構建 . 61 . 63 麥長管蚜 . 64 麥長管蚜 亞基做誘餌篩選 . 84 母雙雜交研究克隆的 與 亞基 之間的互作關系 . 85 論 . 86 酵母雙雜交試驗結果的分析 . 86 于酵母雙雜交試驗常見問題的探討 . 87 一步工作設想 . 88 第四章 小 G 蛋白 肌動蛋白的基因克隆及序列分析 . 89 料與方法 . 89 料 . 89 法 . 89 果與分析 . 90 隆了小 G 蛋白 . 90 頭、胸和腹部的轉(zhuǎn)錄水平 . 91 不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平 . 91 蛋白 . 92 隆了麥長管蚜肌動蛋白基因的部分 . 97 論 . 101 第 五 章 結 論 . 102 參 考 文 獻 . 105 致 謝 . 112 作 者 簡 歷 . 113 中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第一章 引言 - 1 - 第一章 引 言 細胞信號傳導是所有生物體具有的一種十分重要的生理功能。早在 20世紀 80年代初， 發(fā)現(xiàn)跨膜信號傳導需要 存在；后來， 人發(fā)現(xiàn) 激型 G 蛋白 )激活腎上腺素依賴的腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)。這些工作闡明了胞外信號轉(zhuǎn)換為胞內(nèi)信號的機制，由于兩人在 G 蛋白發(fā)現(xiàn)過程中的重要貢獻而被