【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）犬細(xì)小病毒VP2基因的克隆、表達(dá)及在診斷應(yīng)用上的研究預(yù)防獸醫(yī)學(xué)碩士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 犬細(xì)小病毒 因的克隆、表達(dá)及在診斷應(yīng)用上的研究 P2 P2 I 摘要 犬細(xì)小病毒病（ 是由犬細(xì)小病毒 (起犬的一種急性傳染病。本病在世界各地均有發(fā)生，各種年齡、品種的犬易感，尤其是斷奶后幼犬的發(fā)病率和死亡率均很高。 隨著養(yǎng)犬業(yè)的發(fā)展，對犬病的防控日趨 重要。因此，制定積極有效的預(yù)防措施，獲得及時(shí)準(zhǔn)確的診斷信息至關(guān)重要。 本試驗(yàn)通過設(shè)計(jì)合成特異性引物，擴(kuò)增 因并進(jìn)行了原核表達(dá)，純化后獲得 組蛋白，以其為包被抗原建立敏感、特異、檢出率高的間接 法；同時(shí)用此方法對抗 異性單抗進(jìn)行篩選，以獲得了抗 異性單抗。 根據(jù) 布的 因序列 ， 設(shè)計(jì)并合成一對特異性引物 ， 以 增出 因片斷，將其 克隆到 體中 。經(jīng)過測 序后，將 因亞克隆至原核 表達(dá)載體 ，然后 轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌 ， 表達(dá)了目的蛋白， 表達(dá)量為 29%， 分子量約為 67通過 明該重組蛋白具有抗原性 。 組蛋白 經(jīng) 鎳離子親和樹脂 純化，純度達(dá)到 用 組蛋白作為包被抗原， 確定了最佳優(yōu)化條件和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。通過特異性試驗(yàn)證明包被的抗原僅與 準(zhǔn)陽性血清發(fā)生反應(yīng)，不與犬瘟熱、犬腺病毒、犬副粘病毒、波特氏桿菌等疫病的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)；與進(jìn)口 劑盒進(jìn)行比對，對血清樣品 92 份的檢測結(jié)果表明符合率為 對相同的血清樣品 48 份進(jìn)行了 4 次重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)小于 16%。因此本試驗(yàn)成功的 建立了檢測 清抗體的間接 法。應(yīng)用該方法對國內(nèi)部分地區(qū)采集的血清樣品 227 份進(jìn)行檢測，其中 164 份為陽性，陽性率為 以純化的 免疫 c 小鼠，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)，采用已建立的間接 株，分別命名為 類鑒定結(jié)果表明 它為 鏈均為 k 型。果表明均與 組蛋白和 生反應(yīng)，證明這些單抗具有良好的特異性。 關(guān)鍵詞 犬細(xì)小病毒， 組蛋白，間接 克隆抗體，應(yīng)用 is an of by be in of by in of of it is to In of be to P2 P2 is in P2 by of P2 by A of is to P2 is 9% of a of 7a ml is by P2 as be PV is 2 of 8 of of is 6%. is on in of we 27 64 of is to c of c 4 P2 by of P2 P2 錄 前言 . 1 1 犬細(xì)小病毒病概述 . 1 原 . 1 態(tài)特點(diǎn)和理化性質(zhì) . 1 凝特性 . 1 養(yǎng)特性 . 2 基因組結(jié)構(gòu) . 2 碼的蛋白及功能 . 2 病機(jī)理 . 4 細(xì)小病毒病的流行病學(xué) . 4 起源和的進(jìn)化 . 4 的抗原型 貓中的出現(xiàn) . 5 原流行情況 . 6 床特征和病理變化 . 6 細(xì)小病毒診斷方法 . 6 凝和血凝抑制試驗(yàn) . 7 毒分離 . 7 鏡與免疫電鏡 . 8 疫色譜法 . 8 聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) . 8 合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) . 9 克隆抗體技術(shù) . 9 2 研究目的和意義 . 10 實(shí)驗(yàn)報(bào)告一 因的克隆及其在大腸桿菌中 的表達(dá) . 11 1 材料與方法 . 11 料 . 11 毒 . 11 體與菌株 . 11 化試劑及試劑盒 . 11 要儀器設(shè)備 . 12 法 . 12 毒 提取 . 12 因的克隆與鑒定 . 12 組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 . 15 組蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) . 16 組蛋白的可溶性分析 . 16 達(dá)產(chǎn)物的純化 . 17 達(dá)蛋白的 定 . 17 2 結(jié)果 . 17 增 . 17 組克隆載體酶切鑒定 . 17 2.3 苷酸序列測定結(jié)果 . 18 V 組表達(dá)載體酶切鑒定 . 18 組蛋白 表達(dá)與純化 . 19 組蛋白 表達(dá) . 19 組蛋白的純化及 果 . 19 3 討論 . 20 組蛋白原核表達(dá) . 20 達(dá)載體的選擇 . 20 核表達(dá)條件的優(yōu)化 . 21 涵體蛋白的純化 . 21 目的蛋白的選擇及應(yīng) 用 . 22 實(shí)驗(yàn)報(bào)告二 接 斷方法的建立 . 23 1 材料與方法 . 23 料 . 23 驗(yàn)用血清 . 23 要的儀器設(shè)備 . 23 接 作程序 . 24 接 斷方法的建立 . 24 原最適包被量與血清最適稀釋度的確定試驗(yàn) . 24 標(biāo)抗體最適稀釋倍數(shù)與最適作用時(shí)間確定試驗(yàn) . 24 作條件的優(yōu)化 . 25 定標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn) . 25 法性能評價(jià) . 26 異性試驗(yàn) . 26 感性試驗(yàn) . 26 內(nèi)重復(fù)試驗(yàn) . 26 全病毒 測試劑盒檢測結(jié)果比較試驗(yàn) . 26 接 斷方法的應(yīng)用 . 27 2 結(jié)果 . 27 接 斷方法的建立 . 27 原最適包被量與血清最適稀釋度的確定 . 27 標(biāo)抗體最適稀釋倍數(shù)與最適作用時(shí)間確定 . 28 作條件的優(yōu)化 . 28 定標(biāo)準(zhǔn) . 29 法性能評價(jià) . 30 異性試驗(yàn) . 30 感性試驗(yàn) . 31 內(nèi)重復(fù)試驗(yàn) . 31 全病毒 測試劑盒檢測結(jié)果比較試驗(yàn) . 32 用建立的診斷方法檢測國內(nèi)部分地區(qū)樣品的結(jié)果 . 32 3 討論 . 32 接 法的條件優(yōu)化 . 32 接 斷方法的判定標(biāo)準(zhǔn)及應(yīng)用 . 33 實(shí)驗(yàn)報(bào)告三 抗 克隆抗體的制備與鑒定 . 35 1 材料與方法 . 35 料 . 35 胞、毒株與實(shí)驗(yàn)動物 . 35 主要試劑 . 35 要儀器 . 35 法 . 36 原制備及純化 . 36 物免疫 . 36 細(xì)胞準(zhǔn)備 . 36 飼養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備 . 36 疫脾細(xì)胞的制備 . 37 胞融合及選擇性培養(yǎng) . 37 性克隆的篩選 . 37 染和控制 . 38 胞的凍存 . 38 鼠腹水的制備 . 38 克隆抗體特性鑒定 . 38 2 結(jié)果 . 40 交瘤細(xì)胞的篩選 . 40 克隆抗體的腹水效價(jià)的測定 . 40 克隆抗體亞類鑒定 . 40 原識別位點(diǎn)分析 . 40 定 . 41 3 討論 . 41 性克隆篩選的要點(diǎn) . 41 克隆抗體的 應(yīng)用 . 42 結(jié) 論 . 43 參考文獻(xiàn) . 44 附 錄 . 49 致 謝 . 52 作者簡介 . 53 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 前 言 1 前言 1 犬細(xì)小病毒病概述 犬細(xì)小病毒病（ 是由犬細(xì)小病毒 (起犬的一種急性傳染病，各種年齡的犬都能感染（ V, et 。 斷奶后的幼齡犬最為易感，傳播速度快，發(fā)病率和死亡率高達(dá) 70 以上 （ P M,et 。隨著年齡的增長， 成年犬一般只出現(xiàn)感染后的免疫反應(yīng)，無明顯的臨床癥狀。 自 1983 年，徐漢坤等 （ 徐漢坤， 1983）正式報(bào)道犬細(xì)小病毒病在我國流行以來，該病對我國養(yǎng)犬業(yè)造成了極大的危害。 原 態(tài)特點(diǎn)和理化性質(zhì) 細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒亞科，牛犬細(xì)小病毒屬 的成員（ 方忠意， 2005） ， 具有細(xì)小病毒屬的典型形態(tài)和結(jié)構(gòu)。病 毒粒子為等軸對稱的二十面體，無囊膜。在電鏡下觀察，病毒顆粒的外觀呈圓形或六邊形，直徑約 261993） 。核酸由單股 成， 占整個(gè)病毒粒子重量的 25 34 ， 分子量為 06 06，沉淀系數(shù)為 23 S 27 S。在 度梯度離心沉淀時(shí)，大部分感染性病毒粒子存在于 g/度節(jié)，小部分感染性病毒粒子存在于 g/衣殼和含有不完整 因組的病毒粒子分別存在于 g/g/殷震，1997） 。 外界各種理化因素有較強(qiáng)抵抗力。 耐受 65 30不喪失感染性，低溫長期存放對其感染性無明顯影響，室溫下可存活 90 天，在糞便中可存活數(shù)月和數(shù)年。對乙醚、醇類、氯仿、去氧膽酸鹽有抵抗力，而福爾馬林， 氯酸鈉、氨水、氧化劑和紫外線能使其滅活。 凝特性 凝特性較強(qiáng)，在 4 或 25 條件下不僅能凝集豬的紅細(xì)胞，而且能凝集恒河猴的紅細(xì)胞，這一特性可作為病毒鑒定的 參考指標(biāo)（ 殷震， 1997） 。經(jīng)福爾馬林滅火后，多學(xué)者研究證實(shí)， 間有共同的抗原組成，能發(fā)生血清學(xué)交叉反應(yīng)，但又有各自的抗原成分。 據(jù)報(bào)道，在同樣的條件 (紅細(xì)胞、溫度、下， 血凝 (度至少比 8 倍。 間也有某些共同的抗原組成， 兩者之間能出現(xiàn)免疫熒光和血凝抑制交叉現(xiàn)象 。 能凝集馬、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 前 言 2 貓和倉鼠的紅細(xì)胞 (徐漢坤 ， 1983； ， 1988) (， 1988)報(bào)道，應(yīng)用硼酸緩沖鹽溶液和病毒調(diào)節(jié)稀釋劑 (凝集犬和綿羊的紅細(xì)胞，但不能凝集牛、山羊、兔、豚鼠、大鼠、小鼠、地鼠、雞、鵝和人的 O 型紅細(xì)胞。 養(yǎng)特性 細(xì)小病毒的 制發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，其復(fù)制過程出現(xiàn)于細(xì)胞周期的 S 期。這是因?yàn)榧?xì)小病毒 制完全依賴于宿主 合酶及其復(fù)制體系。利用 合酶抑制劑處理宿主細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)小病毒 宿主細(xì)胞內(nèi)不能進(jìn)行復(fù)制，現(xiàn)在已經(jīng)證實(shí)細(xì)小病毒 制既可利用宿主 合酶，也可使用宿主 宿主 合酶的作用下，病毒 滾發(fā)夾模式進(jìn)行復(fù)制，它通過自身 端回文序列所形成的反轉(zhuǎn)回折 3 端作為引物，起始 成。 在多種不同類型的細(xì)胞內(nèi)增殖，近年常用 傳代細(xì)胞分離培養(yǎng)病毒。犬細(xì)小病毒的基因組是在感染細(xì)胞的染色體復(fù)制開始以后才在細(xì)胞核內(nèi)合成的，說明犬細(xì)小病毒的復(fù)制能力有缺陷 (殷震， 1997)， 當(dāng)體外進(jìn)行病毒培養(yǎng)傳代時(shí)，不能象一般常規(guī)那樣，等到細(xì)胞形成單層后才接種病毒，而必須在細(xì)胞培養(yǎng)的同 時(shí)或最遲在 24 樣才能達(dá)到使病毒增殖的目的。 殖后可引起 胞脫落、崩解和破碎等明顯的細(xì)胞病變，病毒雖能在 胞內(nèi)良好增殖，但無明顯細(xì)胞病變，有時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞圓縮，并常形成核內(nèi)包涵體。 基因組結(jié)構(gòu) 一種自主復(fù)制的細(xì)小病毒，基因組是負(fù)股、單鏈、線形 因組含有 5 323個(gè)核苷酸 (2000)，是 毒中最小的。基因組含有兩個(gè)開放閱讀框架 ( 第一個(gè) 基因組左半部分 5 42成， 編碼非結(jié) 構(gòu)蛋白 第二個(gè) 于基因組的右半部分，即 45 90編碼結(jié)構(gòu)蛋白 個(gè) 別有自己的啟動子，非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白的 止于共同的 ) 末端，且可通過 可變剪接形成不同的翻譯模板。 顯著的特點(diǎn)是基因組結(jié)構(gòu)末端有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)對病毒復(fù)制十分有效。位于 3 端的回文序列大約 115種 段自身能夠反折以形成一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)較自身互補(bǔ)鏈間的氫鍵穩(wěn)定； 5 端也是回文結(jié)構(gòu)，并且能形成發(fā)夾 (2000)，這一結(jié)構(gòu)對 復(fù)制是十分重要的，由于病毒復(fù)制能力有缺陷，其基因組需在感染細(xì)胞的染色體復(fù)制開始后在細(xì)胞核內(nèi)合成。 碼的蛋白及功能 因組主要編碼四種蛋白， 由早期轉(zhuǎn)錄物翻譯的非結(jié)構(gòu)蛋白 期轉(zhuǎn)錄物翻譯的結(jié)構(gòu)蛋白 病毒粒子中含有 3 種多肽 3 7和 5在空衣殼蛋白中只含有 種蛋白質(zhì)。 子表面由 60 個(gè)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 前 言 3 結(jié)構(gòu)亞單位裝配而成， 90 ，而 占 10 ，因此 構(gòu)成衣殼蛋白的主要成分。 存在于完整的病毒粒子衣殼蛋白中，是 基端水解掉 15 20 個(gè)氨基酸形成的，它只在衣殼裝配和病毒基因組包裝后出現(xiàn)，其相對量隨著感染進(jìn)程和發(fā)展而增加。 初合成的病毒蛋白是非結(jié)構(gòu)蛋白，這是因?yàn)榉墙Y(jié)構(gòu)蛋白的轉(zhuǎn)錄本要比結(jié)構(gòu)蛋白的轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)的早，而且一個(gè)或兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白負(fù)責(zé)對細(xì)小病毒的基因表達(dá)行使調(diào)控作用。有一些研究表明，細(xì)小病毒基因組編碼合成的 病毒基因表達(dá)具有反式激活功能（徐耀先， 2001）。 翻譯合成后，均產(chǎn)生磷酸化，而衣殼蛋白則在 N 端形成乙?；?，但 翻譯后還可進(jìn)行磷酸化，當(dāng)這些衣殼蛋白在昆蟲細(xì)胞中合成時(shí)，它們能夠自我組裝形成病毒粒子。 高分辨率的 射線分析 衣殼，由 8 組反向平行的 折疊和 4 個(gè)鑲嵌于 折疊的大環(huán)組成。環(huán) 3 和環(huán) 4 通常組成長的 ，環(huán) 1、 3、 4 來自三個(gè)不同 子彼此緊密靠近、延長、相互作用于三倍體亞單位。這些亞單位高度纏繞在三倍體軸處形成一個(gè) 的突起，在這些突起上含有大部分與病毒的抗原物質(zhì)相關(guān) 的殘基（ 994）。四個(gè)環(huán)構(gòu)成病毒衣殼表面的大部分，并且包括從 構(gòu)的 547 個(gè)殘基裂解下來的 364 個(gè)殘基。相反， 端的 37 個(gè)殘基很少見到，推測可能是由于 規(guī)則的自然結(jié)構(gòu)。有結(jié)論報(bào)道，氨基端大部分離開五倍體軸而位于衣殼外表面，另一個(gè)重要的抗原位點(diǎn)已證明位于這些氨基端（ 1995； 1994； 1993； 1991）。 環(huán)的結(jié)構(gòu)決定了病毒的許多性質(zhì)，從抗原角度來看，兩個(gè)重要的 中和位點(diǎn)由這些環(huán)決定（ A， 1991） 。位點(diǎn) A 來自同一 環(huán) 1 和環(huán) 2 以及三倍體分子環(huán) 4。環(huán) 2 在形成這個(gè)抗原位點(diǎn)時(shí)的作用表現(xiàn)在 222、 224 位點(diǎn)變異的結(jié)果。位點(diǎn) A 涉及的抗原漂移還通過環(huán) 4 上的 426 殘基，使 成 2a 型和 2b 型。位點(diǎn) B 位于環(huán) 3 的延長部分三倍體突起的肩部，包括 299、 300、 302 殘基。實(shí)際上， 300 位點(diǎn)殘基是最易突變的殘基。單克隆抗體識別這兩個(gè)決定簇影響血凝抑制（ 1994）。然而，這些改變不影響體內(nèi)交叉保護(hù)。 白在病毒感染過程中起著極為重要的作用。缺失 白的突變體均喪失了對宿主細(xì)胞的再感染性。對 構(gòu)蛋白的分析及編碼基因突變的研究發(fā)現(xiàn)， 殼蛋白某些區(qū)域，甚至幾個(gè)殘基對 染細(xì)胞有重要影響，如蛋白 93 位殘基以及鄰近 300 位區(qū)域?qū)?應(yīng)細(xì)胞有重要影響。 病機(jī)理 犬?dāng)?shù)種淋巴組織和腸粘膜細(xì)胞中復(fù)制，病毒引入途徑和起始復(fù)制位點(diǎn)在鼻口咽部位，包括扁桃體和其它淋巴組織（ 1987） 。動物可經(jīng)非腸道的實(shí)驗(yàn)方式感染，然而口腔是最主要的自然感染方式。病毒以病毒血癥的方式擴(kuò)散， 1 3 天后可出現(xiàn)在扁桃體、咽淋巴結(jié)、胸腺和胸淋巴結(jié)。感染 3 天后。腸相關(guān)淋巴結(jié)組織也有病毒出現(xiàn)。因?yàn)椴《居谀c粘膜上皮細(xì)胞的吸收作用無關(guān)，且腸粘膜上皮細(xì)胞感染發(fā)生在病毒血癥后，這中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 前 言 4 時(shí)才意識到病毒感染的重要性。因此，中和抗體進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)能減小感染的腸粘膜范圍，但抗體水平不是很高時(shí)不能阻止感染。這一現(xiàn)象與疫苗作用相關(guān)，滅火的疫苗可在數(shù)個(gè)月內(nèi)阻止疾病發(fā)生，但不能抗拒嚴(yán)重感染。細(xì)胞 因子在 染中可能發(fā)揮重要作用，但目前沒有相關(guān)報(bào)道。 細(xì)小病毒病的 流行病學(xué) 起源和 進(jìn)化 不斷出現(xiàn)的新病毒潛在致病性給人類和動物不斷的威脅。貓細(xì)小病毒（ 導(dǎo)致的疾病主要集中在貓和浣熊上。直到二十世紀(jì)四十年代中期，當(dāng)一種小病毒在水貂上導(dǎo)致高致死率而被發(fā)現(xiàn)后，病毒的發(fā)現(xiàn)者，將其命名為水貂腸炎病毒（ 用 常規(guī)方法難以區(qū)分 克隆抗體將 成三種抗原類型， 1983； 1984）。在七十年代末，在犬中出現(xiàn)另一種病毒，這種新病毒叫犬細(xì)小病毒 （命名為 這種細(xì)小病毒在全世界范圍迅速傳播，并且引起成千上萬只犬的死亡 (1995)。 出現(xiàn)之后，通過單克隆抗體又鑒別到兩株新的變異株，命名為 兩種新型病毒不斷在世界范圍內(nèi)出現(xiàn)，幾乎代替了 。 2000 年 報(bào)道在貓?bào)w內(nèi)出現(xiàn)和流行一種 新的細(xì)小病毒抗原型 種變異已被證實(shí)能減少病毒感染犬細(xì)胞的能力，并且增加病毒在環(huán)境中的穩(wěn)定性。 盡管準(zhǔn)確的進(jìn)化機(jī)制不清楚，這些新出現(xiàn)的 原型，能夠歸因于是 抗原病毒在犬體的適應(yīng)。有趣的是，每一個(gè)新的抗原型具有至少一個(gè)與以前血清型相同的中和表位（ 1994）。 進(jìn)化過程成為病毒進(jìn)化的典型模型。 初是在 1978 年分離到（ 1979）。 血清學(xué)回顧溯源試驗(yàn)顯示， 1976 年收集的血清中存在有陽性樣品。綜合各種對 子進(jìn)化 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒的出現(xiàn)至少要提前 10年（ 2005）。 認(rèn)為是一種來源于 宿主變異病毒。人們提出了各種關(guān)于病毒來源的猜測， 最為接受的有兩種觀點(diǎn)一：認(rèn)為 源于 變異株（ 1995， 1998； 1999， 2006） ；觀點(diǎn)二：認(rèn)為是 經(jīng)由非馴養(yǎng)的食肉目動物演變?yōu)檫m應(yīng)新宿主犬，比如 貂 、狐貍。由于動物在田間被圈養(yǎng)在高密度下，大部分研究者更傾向于后者 （ ， 1998； ， 1998） 。 一些有趣的發(fā)現(xiàn)支持 后一觀點(diǎn)：通過分析 因序列， 緣關(guān)系較 （ ， 1998； ， 2000）。更重要的是， 1983 年從芬蘭北極狐貍分離出的病毒株藍(lán)狐細(xì)小病毒（ 表現(xiàn)出 間的特征。在 列中， 三個(gè)同義的核苷酸改變，這三個(gè)載 特殊的。并且依據(jù)抗原性，狐貍的細(xì)小病毒劃分為 。這些發(fā)現(xiàn)表明，在犬科動物的家族中，一些動物如貂和狐貍 ，易于感染 病毒的這些動物有可能作為 先的貯存體。最近， 道從德國紅狐貍體內(nèi)分離到一類似 間體細(xì)小病毒的中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 前 言 5 序列，具有一個(gè) 殊的非同義置換。盡管這種紅狐貍細(xì)小病毒有可能來源于傳統(tǒng)的 一位點(diǎn)的天然突變，這表明德國的紅狐貍可能是 直接祖先。 緣關(guān)系很近，分別是各自宿主犬貓重要的病原。 染犬和犬科動物如狼、北美山狗、南美山狗、亞洲浣熊，但不感染貓。 病毒能感染各種貓以及水貂、浣熊 也可能感染狐貍，但不感染犬。然而僅能感染貓的病毒（ 僅感染犬的病毒（ 間的界限不能像原先的犬病毒那樣確定。 于急性型，在自然中被新抗原型的 代，感染或在犬貓中復(fù)制，或是在兩者間轉(zhuǎn)移。毒表面蛋白的氨基酸序列是決定細(xì)小病毒宿主范圍的基本因素 , 僅