【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）骨代謝標(biāo)記物在實體瘤骨轉(zhuǎn)移診治中的意義

蘭州大學(xué)碩士畢業(yè)論文 骨代謝標(biāo)記物在實體瘤骨轉(zhuǎn)移診治中的意義 1 第一章 前言 宮頸癌 (最常見的女性生殖道惡性腫瘤，是發(fā)生在子宮頸陰道部及宮頸管的惡性腫瘤的總稱，發(fā)病率僅次于乳腺癌，嚴(yán)重威脅女性的身體健康。全球每年約有 20萬女性死于宮頸癌變，其中 80%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家。我國宮頸癌患病率和病死率均約占世界三分之一，是威脅我國婦女健康和生命的主要惡性腫瘤。目前，針對宮頸癌的疫苗尚未在人群中普遍應(yīng)用，世界范圍內(nèi)的宮頸癌的防治工作主要集中在宮頸癌的篩查，在美國等西歐發(fā)達(dá)國家，大約有一半的婦女至少 5年做一次巴氏涂片，因而其發(fā)病率在全球范圍內(nèi) 普遍呈下降趨勢。但對大多數(shù)發(fā)展中國家來說，幾乎 90%的婦女因為經(jīng)濟(jì)原因或者技術(shù)條件從未篩查過或者篩查不充分，有限的醫(yī)療資源主要用在了疾病的診治而不是預(yù)防。近年來，歐洲一些國家宮頸癌發(fā)病率有上升趨勢 1，全國各地也不斷報道其發(fā)病有上升且呈年輕化的發(fā)展趨勢。因我國的經(jīng)濟(jì)水平不一，篩查工作尚不完善，所以，有效的治療及預(yù)防對我們國家而言尤為重要。 宮頸癌的治療以手術(shù)為主，輔以化療、放療、生物治療等相結(jié)合的綜合治療。這些方法在臨床應(yīng)用中得到了極大的認(rèn)可和推崇，但仍有少數(shù)患者治療效果差及預(yù)后不良，尤其是臨床分 期較高及復(fù)發(fā)的患者，這就決定了宮頸癌相關(guān)研究的重要性。其中，與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因蛋白水平有及其重要的臨床意義，深入研究這些蛋白，可以闡明宮頸癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)測預(yù)后，更重要的是可以指導(dǎo)臨床治療，能為宮頸癌的治療提供新的研究靶點。 分子生物學(xué)研究表明，宮頸癌的發(fā)生與人乳頭瘤病毒 (別是高危型（如 染密切相關(guān)，大約有 宮頸癌及其前體病變（鱗狀上皮內(nèi)瘤變）中存在 著對 種組織惡性腫瘤的發(fā)生如乳腺癌、喉癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌、胃腸道鱗癌、骨髓癌患者均與其有關(guān) 2有研究報道， 對 18、 6、 11型的四價人乳頭瘤病毒基因重組疫苗 18二價人乳頭瘤病毒基因重組疫苗 宮頸癌預(yù)防方面已獲得良好的臨床效果，但直到目前還沒有證據(jù)表明一旦宮頸瘤變發(fā)生，疫苗可以逆轉(zhuǎn)子宮頸癌的形成，并且也不能確定疫苗是否終身有效，因此，也不應(yīng)該過分強(qiáng)調(diào)疫苗萬能 而讓人盲目樂觀。 的一個亞型。 化磷酸烯醇式丙酮酸（ 變?yōu)楸?，在三磷酸核苷的合成過程中起著決定性作用。哺乳類的 型）： 通常均蘭州大學(xué)碩士畢業(yè)論文 骨代謝標(biāo)記物在實體瘤骨轉(zhuǎn)移診治中的意義 2 以酶的活性四聚體形式存在。 要負(fù)責(zé)糖異生。 被 1， 6- 2磷酸果糖、 磷酸腺苷） 別構(gòu)激活?？杀?一磷酸腺苷）依賴的蛋白激酶磷酸化而失活， 糖飲食使其上調(diào)，饑餓使其下調(diào)。 動力學(xué)性質(zhì)和調(diào)節(jié)機(jī)制與兩個器官都需要高能量。 不受別構(gòu)、磷酸化調(diào)節(jié)，也較小受營養(yǎng)的影響。 肪、視網(wǎng)膜以及所有需要大量核苷酸合成的組織中。后者包正常的增殖細(xì)胞、 胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞、尤其是腫瘤細(xì)胞中，他們都是增殖旺盛的細(xì)胞。在組織分化的過程中， 高分化組織癌變的過程中， 7。 腫瘤具有六大顯著特征：凋亡抵抗、自我增殖能力、對抗生長信號的不敏感性、無限的復(fù)制潛能、持續(xù)的血管生成能力及組織侵襲轉(zhuǎn)移能力 8。目前有氧糖酵解在癌細(xì)胞中的作用成為研究的熱點，被稱為癌細(xì)胞的第七大特征 9。糖酵解上調(diào)導(dǎo)致微環(huán)境酸性毒性，所以對抗酸性細(xì)胞來說具有生長優(yōu)勢，能助其增殖和浸潤。但至今為止，有氧糖酵解發(fā)生的分子機(jī)制還未完全闡明。 的獨特作用也引起了人們的普遍關(guān)注。 底物磷酸烯醇式丙酮酸親和力強(qiáng)，而以二聚體形式存在時則與之相反。 致磷酸烯醇類物質(zhì)的堆積，這有利于腫瘤細(xì)胞不是糖酵解供能而轉(zhuǎn)向核酸合成的方向進(jìn)行，此相對于糖酵解過程，可稱之為谷氨酸酵解過程，以保證腫瘤細(xì)胞增殖過程中物質(zhì)的供給 10。 細(xì)胞增殖是一個耗能過程，若細(xì)胞無限增殖，細(xì)胞會因能量及物質(zhì)供應(yīng)不上而死亡。 磷酸腺苷 )或 磷酸鳥苷 )上，同時產(chǎn)生丙酮酸、 磷酸鳥苷 )，糖酵解過程中在 此丙酮酸激酶可調(diào)控苷酸激酶、磷酸果糖激酶的水平。、三磷酸鳥苷、三磷酸胞苷合成，從而抑制 11。另外有研究表明，磷脂 合成的多個環(huán)節(jié)是腫瘤形成所必需的，甚至能有效促進(jìn)腫瘤的形成，其一個有力證據(jù)即是脂肪酸合成酶在正常組織中呈低水平表達(dá)，但在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，而且有促進(jìn)腫瘤形成的作用 12。研究發(fā)現(xiàn)， 促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)化為磷脂，從而為腫瘤細(xì)胞的增殖提供蘭州大學(xué)碩士畢業(yè)論文 骨代謝標(biāo)記物在實體瘤骨轉(zhuǎn)移診治中的意義 3 物質(zhì)基礎(chǔ)，又進(jìn)一步拓展了生長因子信號通路與腫瘤代謝的聯(lián)系 13。 在腫瘤細(xì)胞中， 適應(yīng)腫瘤代謝的需要 7。研究表明，四聚體型與二聚體型1， 6果糖、絲氨酸以及不同的癌蛋白 (7)之間的相互作用來調(diào)控 14。 能的機(jī)制為 得 15。在有足夠氧氣供應(yīng)的實體瘤中，谷氨酸酵解提供大量的丙酮酸。這些谷氨酸酵解和糖酵解中產(chǎn)生的丙酮酸用來合成乳酸、谷氨酸和脂肪酸，從而釋放出糖酵解過程中甘油醛 3 保證腫瘤細(xì)胞中能量的供給?？梢姡?16,17。 在惡性腫瘤組織中，有較高濃度的 有部分進(jìn)入血液循環(huán)，故在外周血及體液中可能檢測到 國 發(fā)出一種用于檢測 前該試劑盒已廣泛用于基礎(chǔ)實驗研究中。早在 1993年， 關(guān)研究證實 ， 多種腫瘤病人外周血清中均存在 肺癌 18、胃癌 19、腎癌 20、結(jié)腸癌 21等等 ，有研究者建議把 22、睪丸癌 23及宮頸癌 2 4腫瘤標(biāo)記物。目前，研究者發(fā)現(xiàn) 瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤血管生成、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞耐藥等 25 早在 1978年，已有研究證實在宮頸癌中存在糖酵解關(guān)鍵酶之一 在宮頸正常組織中表達(dá)較低 28。 期宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變 、 ）、 中期宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變 ）、 期宮頸癌包括浸潤型鱗癌）中表達(dá)水平依次明顯升高 29。有研究檢測 50例宮頸癌組織、 10例宮頸良性腫瘤患者及 10例健康對照患者活組織和外周血清中 果顯示 感性為 82%、特異性為 60%。故研究者推測 24。 隨著 人們越來越多的開始關(guān)注其在腫瘤治療作用。維生素 5可以通過抑制 30。在裸鼠 鉑對癌細(xì)胞的抑制率 基因敲出 二者聯(lián)合可以明顯提高癌細(xì)胞的抑制率，而免疫組化顯示聯(lián)合用藥對裸鼠的心臟、肺、脾、及腎臟未見明 顯損害。該研究還顯示，基因敲出 骨代謝標(biāo)記物在實體瘤骨轉(zhuǎn)移診治中的意義 4 質(zhì)?？梢酝ㄟ^誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤作用 31。在小鼠移植瘤模型中，基因敲出 作用機(jī)制同前 32。 向 549荷瘤裸鼠的抗腫瘤效果要明顯優(yōu)于單獨用藥，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的凋亡是主要的作用機(jī)制 33，組織中5誘發(fā)細(xì)胞凋亡，當(dāng) 5%以上，細(xì)胞將全部走向死亡34,35,腫瘤細(xì)胞中 50%的 斷腫瘤新生血管生成，等于切斷了腫瘤細(xì)胞有氧呼吸途徑，抑制 此推測，抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解和抗腫瘤血管生成藥物聯(lián)合治療在臨床應(yīng)用的可能性。因腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成、耐藥及預(yù)后有關(guān)，通過 要大量的基礎(chǔ)及臨床實驗研究。 其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展作用機(jī)制的研究極少。抑制 未知曉。另有研究表明， 二者在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系仍未知。 本課題主要利用原核表達(dá)載體將 得高純度的重組 而為進(jìn)一步探討 蘭州大學(xué)碩士畢業(yè)論文 骨代謝標(biāo)記物在實體瘤骨轉(zhuǎn)移診治中的意義 5 第二章 實驗材料 要生化試劑 制性內(nèi)切酶 均購自 回收試劑盒 上海 ） 公司 ， E. E. 質(zhì)粒 )及 他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。 要儀器設(shè)備 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）； 海山富科學(xué)儀器有限公司）； 及型 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海齊欣科學(xué)儀器有限公司 )； 超低溫冰箱（ 電泳儀（北京市六一儀器廠）； 子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）； 雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）； 海嘉鵬科技有限公司）； 管架自動平衡離心機(jī)（長沙湘儀儀器有限公司）； 子工業(yè)部第四十八研究所）。 用實驗試劑和培養(yǎng)基 （ 1） 養(yǎng)基和抗生素 體培養(yǎng)基：蛋白胨 l0 g，酵母提取物 5 g， g，用蒸餾水定容至 1000 節(jié) 壓滅 菌。 脂培養(yǎng)基：按照上述配方配制液體培養(yǎng)基，高壓滅菌前加入瓊脂15 g(鋪制平板用 )。 卡那霉素：用蒸餾水 配制 為 50 mg/濃度，共 50 用 器過濾 除菌 ， 分裝為 1 ， 保存。 （ 2）蛋白 泳相關(guān)試劑 30%聚丙烯酰胺貯液：稱取 150 g 丙烯酰胺， 4 g N,N州大學(xué)碩士畢業(yè)論文 骨代謝標(biāo)記物在實體瘤骨轉(zhuǎn)移診治中的意義 6 加超純水溶解至 500 其完全溶解后用濾紙過濾，避光 4C 保存。 三羥甲基氨基甲烷 稱取 g 三羥甲基氨基甲烷加適量超純水溶解，用濃鹽酸調(diào) 至 超純水定容至 100 1 M 三羥甲基氨基甲烷 ：稱取 g 三羥甲基氨基甲烷加適量超純水溶解，用濃鹽酸調(diào) 至 超純水定容至100 10%十二烷基磺酸鈉 (稱取 1 g 十二烷基磺酸鈉（ 加超純水溶解至 100 溫保存。 1甘氨酸電泳緩沖液：稱取 3 g 三羥甲基氨基甲烷， 14.4 g 甘氨酸， 1 適量超純水溶解，用濃鹽酸調(diào) 超純水定容至 1 L。 2樣緩沖液，見表 2 表 22樣緩沖液配制方法 試劑 含量 2.0 0% .0 油 2.0 % 溴酚藍(lán) 純水 定容至 10 g(用時現(xiàn)加 ) 考馬斯亮藍(lán) 色液，見表 2避光室溫保存 。 表 2考馬斯亮藍(lán) 色液配制方法 試劑 濃度 含量 (w/v) 1.0 g 甲醇 40% (v/v) 400 醋酸 10% (v/v) 100 純水 定容至 1000 12%分離膠、 5%積層膠的制備 ,見表 24C 保存。 表 2 12%分離膠、 5%積層膠的制備方法 試劑 12%分離膠 (105%積層膠（ 4 蘭州大學(xué)碩士畢業(yè)論文 骨代謝標(biāo)記物在實體瘤骨轉(zhuǎn)移診治中的意義 7 超純水 3.3 .7 0%聚丙烯酰胺貯液 4 70 l 1.5 _ 500 l 10%00 l 40 l 10%00 l 40 l l 5 l 脫色液：冰乙酸、甲醇和超純水按 1:3:6 的比例配置。 （ 3）鎳柱純化用試劑 8 M 尿素洗脫緩沖液：稱取尿素（ 240 g，分別加入 5 5 油，定容至 500 溫儲存。 性結(jié)合緩沖液：稱取 g, g，加入 10 ,加入尿素 （ 480 g，用超純水定容至 1000 調(diào) 室溫儲存。 變性洗滌緩沖液：分別稱取 g、 g 加入 10 ，加入 5.0 g 脫氧膽酸鈉，加入尿素（ 480 g，用超純水定容至 1000 調(diào) 室溫儲存。 （ 4） 其他相關(guān)試劑 誘導(dǎo)劑 蒸餾水 配制 為 1 濃度，共 50 器過濾除菌，分裝為 1 ， 保存。 磷酸鹽緩沖液 （ ：分別稱取 g、 g、 2 g,用蒸餾水定容至 1 L，條件 4C 保存?zhèn)溆谩?蛋白透析純化試劑：稱取 1201.2 g 尿素及 g， 用超純水定容至5000 調(diào) 4C 保存。 考馬斯亮藍(lán)染色液： 稱 取 100 馬斯亮蘭 于 50 5%的乙醇后，再加入 100 5%的磷酸，用 超純水定容至 1000 蘭州大學(xué)碩士畢業(yè)論文 骨代謝標(biāo)記物在實體瘤骨轉(zhuǎn)移診治中的意義 8 第三章 實驗方法 基因組 取 （ 1）用物準(zhǔn)備 配 1 000 純水，攪拌 40 37 配 100 00 拌 40 37 用配好的 在飯盒中浸泡 1.5 、 、 10 心管、大中小 槍頭 ，務(wù)必使每個管中都充滿液體，上下層鋪紗布，完全浸潤，浸泡12 h。 用鑷子取物品出并將管中液體甩掉，浸泡過的物品放入飯盒高溫高壓滅菌。 配制 00 8 g 00 純水，溶解后用于浸泡電泳槽及膠床梳子，待用。同時細(xì)胞刮浸泡在 中至少 1 h。 氯仿（三氯甲烷）、異丙醇、 無水酒精放入 4C 冰箱預(yù)冷。 配制 脂糖凝膠 :配置 400 8 092 壓過的 15 0.3 g 瓊脂糖 ,微波爐加熱沸騰后，冷卻后，加 勻，制膠備用。 超凈臺用 75%酒精棉擦拭干凈，紫外線照射 30 風(fēng) 15 （ 2） 提取方法 細(xì)胞 處理： 將鋪滿 整瓶細(xì)胞約 1106 個，棄掉舊培養(yǎng)基，加 8 理的沖液沖洗舊培養(yǎng)基， 2 次，然后加 5 細(xì)胞刮刮下，移入10 中，再加入 5 續(xù)刮移入 10 ，混勻后 2500 心1 ，棄上清，用 1 解沉淀移入 2 個去 中。 加 110607 個細(xì)胞加 1 輕吹打混勻，置于冰盒上靜置 5 加入 0.2 仿 （為 1/5） ， 上下輕輕顛倒 5 ， 冰盒上 靜置5見分 層現(xiàn)象 。 4C、 10500 心 15 見分層 ，上層清亮，中層為白色，下層為紅色 。 小心吸取上清，估計約 0.5 加入 與上清等體積的 異丙醇 0.5 上下顛倒混勻 6，冰盒上 靜置 10 4C、 10500 心 10 上清 ，可見核酸沉淀 。 加入 1 與 量一致） 75% 乙醇 （ 750 水乙醇 +150 壓過的 ） ， 現(xiàn)配先用。輕輕吹打使沉淀溶解， 4C、 8500 心蘭州大學(xué)碩士畢業(yè)論文 骨代謝標(biāo)記物在實體瘤骨轉(zhuǎn)移診治中的意義 9 5棄上清。 超凈 臺下干燥 5入適量 溶解 沉淀。保存于 冰箱備用。 備（ （ 1）在冰盒上分別加入以下試劑： 模板 5 l 1 l （ 100 l 共 l （ 2）輕柔混勻， 465 次 4 （ 3）依次加入下列試劑后，輕微混勻， 4 5 4 l l 0mM 2 l 1 l 共 l （ 4） 420 （ 5） 700 保存。 融合蛋白 +） - 構(gòu)建 物設(shè)計 根據(jù) 基序列為 2516 序列 ,用 條引物，引物有上海生物工程有限公司合成，序列見表 3 表 3 引物序列 上游引物 5 ） 上游引物 5 ) 下游引物 5（ 蘭州大學(xué)碩士畢業(yè)論文 骨代謝標(biāo)記物在實體瘤骨轉(zhuǎn)移診治中的意義 10 增 因 考慮到融合蛋白的純化，所以在引物設(shè)計時分別把上游引物設(shè)計在組氨酸標(biāo)簽的兩端，這樣可以獲得含組 氨酸標(biāo)簽及不含組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白。以 5端引物 端引物 端引物 端引物 在下文中含有組氨酸標(biāo)簽的目的基因片段用含有組氨酸標(biāo)簽的目的基因片段用 無表明則兩者均可） （ 1） 系（單位 l）： 5 10 l 4 l 上游引物 1 l 下游引物 1 l NA l l 共 50 l （ 2） 96 980 s， 625 s， 720 s， 40個循環(huán)后 ， 720 40個循環(huán)。取 5 用 1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。因在小于 100 用 （ 3）取驗證后的 化 : 在 倍體積的 3 ，充分混勻。 8000 心 30 s。倒掉收集管中 液體。 加入 500 l 9000 0 s，倒掉收集管中液體，重復(fù)此步一次。 空柱于 9000 空吸附柱開蓋于超凈臺下吹風(fēng) 5 殘留乙醇揮發(fā) 將吸附柱放入一個干凈的 1.5 心管中，在吸附膜中央加入20溫靜置 1 12000 取 5 取 5 照觀察純化 率 ,2 量質(zhì)粒的濃度及純度 ） 。 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 收產(chǎn)物放 保存 。 建表達(dá)質(zhì)粒 +） - 1）大腸桿菌 取 凍存的大腸桿菌 37 骨代謝標(biāo)記物在實體瘤骨轉(zhuǎn)移診治中的意義 11 箱中培養(yǎng)過夜。 從平板上挑取單個菌落接種至 5 37C,180 2 h。 取過夜培養(yǎng)的菌液 100 l 接種于 100 37C 180 將菌液冰上靜置 10 后 4C， 5000 0 棄上清，加入 10 加樣器將菌體輕輕吹散，放置冰上 30 4C， 5000 0 上清，加入 2 1 加樣器輕輕混勻，每管 200 存于 4 （ 2）目的基因 +） 的分步雙酶切 按下列反應(yīng)體系依次加入試劑 (冰盒上操作 )： 10 0T 20 30 2o 130 共 190 00 650 酶滅活后 ， 加入 10 370 20用 法同前。 （ 3）用膠回收試劑盒純化雙酶切后的 質(zhì)粒 +） ： 取 2 錄，鋪放保鮮膜于桌面，準(zhǔn)備干凈濾紙， 從瓊脂糖凝膠中割下含目標(biāo)片段的膠塊，稱重，記錄 加入膠塊重量倍的 2 ， 50 加入 1/32體積的異丙醇。 將溶膠液移入吸附柱中， 8000 心 30 s。倒掉收集管中液體。 加入 500 l 9000 心 30 s，倒掉收集管中液體 ,重復(fù)此步一次。 空吸附柱于 1200 空吸附柱開蓋于超凈臺下吹風(fēng) 5 殘留乙醇揮發(fā) 將吸附柱放入一個干凈的 1.5 心管中，在吸附膜中央加入 30溫靜置 1 心 1 保存管中 （ 4）目的片段與表達(dá)載體的連接 根據(jù) 摩爾比為 3比 1進(jìn)行連接（反應(yīng)體系如下）。 +） 5 的基因片段 3 州大學(xué)碩士畢業(yè)論文 骨代謝標(biāo)記物在實體瘤骨轉(zhuǎn)移診治中的意義 12 10 2 4 1 2o 9 共 20 l 162 h。 （ 5）轉(zhuǎn)化 冰上溶解 上預(yù)冷連接產(chǎn)物。 每 200 l 感受態(tài)細(xì)胞中加入 10 l 連接產(chǎn)物，冰上靜置 30 420s，立即冰上放置 2-3 每管加入預(yù)溫至 3700 l ， 37C， 45 30蕩培養(yǎng)。 取適量培養(yǎng)的菌液均勻涂布于含 50 l /菌液吸收后，倒置于 37 （ 6）陽性克隆質(zhì)粒的篩選與鑒定 從過夜培養(yǎng)的含卡那霉素的 滑、邊緣整齊的菌落，接到 5 37C 12 h， 180 用上海生工質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。對質(zhì)粒 （ 7）克隆產(chǎn)物的序列分析 將初步鑒定為陽性克隆的菌株送 北京六合華大基因科技服務(wù)有限公司測序 。將測序結(jié)果與 組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌 測序準(zhǔn)確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 感受態(tài)細(xì)胞 制備、及轉(zhuǎn)化方法同 置 貯存?zhèn)?用。 組融合蛋白在大腸桿菌 誘導(dǎo)表達(dá) (1) 取凍存于 的菌種接種于含有相應(yīng)抗生素的 37C 12h， 180 蘇菌種。 (2) 按 1： 100接種于含有相應(yīng)抗生素的 37C 12 h， 180 (3) 加入 1.0 ， 37 h。 (4) 取 l 4C， 12000 l 別收集菌體和上清（上清備蘭州大學(xué)碩士畢業(yè)論文 骨代謝標(biāo)記物在實體瘤骨轉(zhuǎn)移診治中的意義 13 用 ）。 (5) 用 100 l 入等體積 2行 丙烯酰胺凝膠電泳（ （ 1）配置 12%分離膠和 5%濃縮膠，灌制凝膠， 將配制分離膠混勻灌入電泳槽中，加水覆蓋，室溫下靜止 20分離膠聚合后，倒出上面的水，再灌入配置好的濃縮膠，迅速插入樣品梳，室溫下靜止 20作過程中注意避免出現(xiàn)氣泡。 （ 2） 蛋白樣品處理：將蛋白樣品及分裝后的 2樣緩沖液按 1:1 的比例混合，沸水 水浴 10 蛋白變性。 （ 3）上樣：待積層膠聚合后，豎直拔出樣品梳，用 1極緩沖液灌滿電泳槽前后槽，用 10 l 加樣槍在加樣孔中加入處理好的蛋白樣品及蛋白0 l/孔。 （ 4）電泳：將電泳槽帶電極的蓋子改好后，接通電源，恒電壓 80 V 電泳20分離膠后，可將電壓調(diào)至 100 繼續(xù)電泳（電壓調(diào)高后可明顯縮短電泳時間，不影響電泳效果），約 2 小時，直至電泳樣品目測到達(dá)分離膠的底部，關(guān)閉電泳儀，電泳結(jié)束。 （ 5）染色與脫色：將凝膠浸入考馬斯亮藍(lán)染色液中，微波爐加熱 1 ，搖床振蕩 30 色，倒掉染色液。用超純水除去殘留的染液，再加入脫色液?？捎梦⒉t加熱，振蕩搖床約 1 h，如果多次替換脫色液并延長加熱時間可明顯縮短脫色時間，直至條帶清晰可見。 組融合蛋白表達(dá)形式的鑒定 將步驟 行 組融合蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化 （ 1） 蛋白表達(dá)量與 關(guān)系 將菌液按 1： 100接種于含卡那霉素的 37-3 入 1.0 ， 37 行 （ 2）蛋白表達(dá)量與誘導(dǎo)時間的關(guān)系 將菌液按 1： 100接種于含卡那霉素的 37入 .4 ， 37 h 3 h 6 h 12 行 蘭州大學(xué)碩士畢業(yè)論文 骨代謝標(biāo)記物在實體瘤骨轉(zhuǎn)移診治中的意義 14 重組融合蛋白的表達(dá)形式均是包涵體蛋白。我們對含有組氨酸標(biāo)簽的重組融合蛋白進(jìn)行了純化。 菌培養(yǎng) (1) 取凍存于 的菌種接種于含有 卡那霉素 的 37C 12 h，180 蘇菌種。 (2) 按 1： 100轉(zhuǎn)接于含有 卡那霉素 的 37C 12 h， 180 8，加入 .4 ， 37C 12 h， 180 (3) 將樣品 40 去培養(yǎng)液，收集菌體。 (4) 用 20 滌細(xì)菌。 理收集菌體 (1) 冰浴超聲破碎： 超聲 3 s 共約 300次，功率為 180 (2) 4C， 12000 0 取上清。 (3) 將上清樣品用 可作為上樣樣品 。 析純化 使用鎳柱進(jìn)行親和層析。 （ 1） 2 3000 上清。 （ 2）加入超純水 2 懸混勻， 3000 3 上清。此步重復(fù)兩次。 （ 3）加入 懸混勻， 3000 3 上清。此步重復(fù) 4次。 （ 4）加入 懸混勻，室溫靜置 1 h。上柱 后靜置 10 柱收集樣品。 （ 5） 3 柱，重懸，混勻。靜置 10 柱收集樣品。 （ 6） 500 0 100 350 500 1 懸混勻，上柱后靜置 10 分別收集樣品。 透膜蛋白透析 （ 1）透析袋處理： 將透析袋剪成適當(dāng)長度（ 10段。 在大體積含 2%（ m/v） 碳酸氫鈉和 1 將透析袋煮沸 10 將透析袋用超純水徹底清洗。 蘭州大學(xué)碩士畢業(yè)論文 骨代謝標(biāo)記物在實體瘤骨轉(zhuǎn)移診治中的意義 15 將透析 袋置 1 煮沸 10 將透析袋冷卻，存放于 4 （ 2） 半透膜蛋白透析方法 用超純水將透析袋再次清洗干凈。 檢查透析袋是否漏水。 將透析袋中的超純水排凈后，將蛋白液倒入袋中，量約為透析袋長度的 1/3，夾住透析袋的另一段。 放入預(yù)先配好的 5000 42 h。 倒出 2500 入超純水 2500 入 g。調(diào) C， 12 h。 重復(fù)上一步， 共 3次使尿素終濃度為 ， 收集透析后蛋白。 蘭州大學(xué)碩士畢業(yè)論文 骨代謝標(biāo)記物在實體瘤骨轉(zhuǎn)移診治中的意義 16 第四章 實驗結(jié)果 的基因的克隆和序列分析 圖 4組質(zhì)粒 +） - 胞全基因組 脂糖凝膠電泳結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示人宮頸癌細(xì)胞系 別表示 明僅有少量降解，見圖 4 蘭州大學(xué)碩士畢業(yè)論文 骨代謝標(biāo)記物在實體瘤骨轉(zhuǎn)移診治中的意義 17 圖 4頸癌細(xì)胞系 目的基因 增結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳顯示 820 與該基因的 碼序列 )區(qū)大小相符 ， 見圖 4 圖 41、 4500、 3000、 2000、 1200、 800、 500、 200 2、 3、 4、 5、 蘭州大學(xué)碩士畢業(yè)論文 骨代謝標(biāo)記物在實體瘤骨轉(zhuǎn)移診治中的意義 18 組質(zhì)粒雙酶切驗證 重組質(zhì)粒雙酶切后經(jīng)瓊脂 糖凝膠電泳檢測到大小約為 1800 5400 明 )圖 4 圖 4組質(zhì)粒雙酶切驗證 1、 4500、 3000、 2000、 1200、 800、 500、 200 2、 ) 3、 ) ) 組質(zhì)粒的測序鑒定 將質(zhì)粒 )將 測序結(jié)果與 結(jié)果顯示二者序列完全相同 ， 并無突變。部分測序結(jié)果見附錄。 中的表達(dá)形式及表達(dá)條件 的優(yōu)化 合蛋白的表達(dá)形式 重組菌誘導(dǎo)后表達(dá)產(chǎn)物的 導(dǎo)的重組菌在約 58 預(yù)計的大