【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）MyD88siRNA誘導(dǎo)豬調(diào)節(jié)性樹(shù)突狀細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究-醫(yī)學(xué)臨床醫(yī)學(xué)胸心外科博士論文

保密 2 年 申請(qǐng)同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué) 博 士學(xué)位論文 二一年五月 導(dǎo)豬調(diào)節(jié)性樹(shù)突狀細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 培養(yǎng)單位：醫(yī)學(xué)院 一級(jí)學(xué)科：臨床醫(yī)學(xué) 二級(jí)學(xué)科：胸心外科 研 究 生：周謙君 指導(dǎo)教師：劉中民 教授 保密 2 年 A in 2008 書(shū)脊 2010 by of o. 055407030) 周謙君 同濟(jì)大學(xué) 學(xué)位論文版權(quán)使用 授權(quán)書(shū) 本人完全了解同濟(jì)大學(xué)關(guān)于收集、保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意如下各項(xiàng)內(nèi)容：按照學(xué)校要求提交學(xué)位論文的印刷本和電子版本；學(xué)校有權(quán)保存學(xué)位論文的印刷本和電子版，并采用影印、縮印、掃描、數(shù)字化或其它手段保存論文；學(xué)校有權(quán)提供目錄檢索以及提供本學(xué)位論文全文或者部分的閱覽服務(wù)；學(xué)校有權(quán)按有關(guān)規(guī)定向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或者機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版；在不以贏利為目的的前提下，學(xué)?？梢赃m當(dāng)復(fù)制論文的部分或全部?jī)?nèi)容用于學(xué)術(shù)活動(dòng)。 學(xué)位論文作者簽名： 年 月 日 同濟(jì)大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下，進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本學(xué)位論文的研究成果不包含任何他人創(chuàng)作的、已公開(kāi)發(fā)表或者沒(méi)有公開(kāi)發(fā)表的作品的內(nèi)容。對(duì)本論文所涉及的研究工作做出貢獻(xiàn)的其他個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。 學(xué)位論文作者簽名： 年 月 日 縮語(yǔ)表 縮 語(yǔ) 表 突細(xì)胞 原遞呈細(xì)胞 節(jié)性 T 細(xì)胞 C 未成熟樹(shù)突細(xì)胞 植物抗宿主病 8 髓樣分化因子 88 周血單個(gè)核細(xì)胞 組豬粒單集落刺激因子 重組豬白細(xì)胞介素 - 4 多糖 向角散射 向角散射 縮語(yǔ)表 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 干擾素 干擾 C 外周血單核細(xì)胞來(lái)源的 信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白 亡結(jié)構(gòu)域 原相關(guān)分子模式 式識(shí)別受體 介素 1 受體相關(guān)激酶 瘤壞死因子受體相關(guān)因子 擾素調(diào)節(jié)因子 7 摘要 摘要 目的 通過(guò) 合刺激豬外周血單核細(xì)胞，獲得豬外周血單核細(xì)胞來(lái)源的采用 擾豬 髓樣分化因子 88（ 因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)出豬調(diào)節(jié)性 對(duì)干擾前后的細(xì)胞表型，免疫學(xué)功能及生物學(xué)活性進(jìn)行檢測(cè)，探討豬調(diào)節(jié)性 誘導(dǎo)耐受的機(jī)制，為臨床應(yīng)用于移植耐受奠定基礎(chǔ)。 材料和方法 提取豬外周血單個(gè)核細(xì)胞（ 經(jīng) 導(dǎo)，體外培養(yǎng)得到未成熟單核來(lái)源的 過(guò)化學(xué)合成法制備針對(duì) 因 對(duì)（序列 1 和序列 2），在 染試劑介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染 以轉(zhuǎn)染無(wú)義 別給予 1的 用 測(cè)干擾前后 因的表達(dá)水平。流式細(xì)胞術(shù) (檢測(cè) 面 6， , 分子表達(dá)， 測(cè)定混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 同種異體 T 細(xì)胞的刺激能力， 測(cè)定 泌 度。 結(jié)果 1. 聯(lián)合應(yīng)用 激豬外周血單核細(xì)胞，可以獲得豬外周血單核細(xì)胞來(lái)源的 胞； 2. 質(zhì)體介導(dǎo)的 染的最小最適的 度為 10 3. 與無(wú)義對(duì)照組相比，序列 1 和序列 2 干擾組 蛋白質(zhì)表達(dá)水平下降 80%以上； 4. 測(cè)豬 表型為 6+； 摘要 激后 達(dá)有升高，而 列 1 和列 2 干擾后 6， 達(dá)降低； 5. 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中隨著混合細(xì)胞中刺激細(xì)胞的比例增加， T 細(xì)胞反應(yīng)性逐漸增強(qiáng)， 最強(qiáng)；轉(zhuǎn)染 ，較之干擾前，刺激指數(shù)下降，T 細(xì)胞反應(yīng)性下降，與 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( 染后， 應(yīng)分泌的 應(yīng)分泌的 高，與 相比，差異具有顯著性（ in PS 按照刺激細(xì)胞：反應(yīng)細(xì)胞 =1： 10 的比率進(jìn)行 檢測(cè)上清液中 圖 圖 細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果 第 3 章 豬 表型鑒定，免疫學(xué)功能檢測(cè)和體外成熟誘導(dǎo) 19 論 我們采用流式細(xì)胞術(shù)， 及相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè)來(lái)研究 表型特征和免疫學(xué)功能。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)豬 面的白細(xì)胞抗原，發(fā)現(xiàn)豬達(dá) 低水平表達(dá) 分子，其免疫表型結(jié)果為 6+，符合豬 免疫表型特征 26, 30, 31。豬 表達(dá) T 細(xì)胞， B 細(xì)胞以及 胞的表面標(biāo)記分子。豬等動(dòng)物的 以持續(xù)性檢測(cè)到低表達(dá)的單核 /巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物 達(dá)的與否也使 別于存在于豬血液中的傳統(tǒng) C， 32。 人類(lèi)被認(rèn)為是單核 /巨噬系統(tǒng)而非 胞的特征性標(biāo)記，但是研究發(fā)現(xiàn)，隨著 單核細(xì)胞被誘導(dǎo)成為 表達(dá)率有所下降。我們的結(jié)果顯示豬 激成熟以后 達(dá)比較恒定，并無(wú)明顯升高，但也有學(xué)者認(rèn)為豬 達(dá)在成熟后降低 22。無(wú)論是 是 續(xù)性共表達(dá)是豬體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的 大特 征。豬 人 著高度同源性33，我們用克隆號(hào)為 76單克隆抗體檢測(cè)到豬 定表達(dá) 到 熟刺激后表達(dá)無(wú)明顯增高 22。 （ ，即豬 類(lèi)抗原。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá) 細(xì)胞比例逐漸增高。我們發(fā)現(xiàn)， 從 表達(dá)來(lái)看 多個(gè)峰，說(shuō)明體外誘導(dǎo) 在異質(zhì)性。 分類(lèi)上被稱(chēng)為豬的 是一種表達(dá)于髓系來(lái)源細(xì)胞的分子，存在于粒細(xì)胞和單核細(xì)胞分化階段的早期，在功能上代表信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白（ , 34。在人和鼠等其他一些動(dòng)物中， 認(rèn)為與 激 T 細(xì)胞的能力有一定關(guān)聯(lián)，但在豬 否具有相同功能還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí) 35。豬表達(dá) c 和 些分子屬于 2 整合素，是細(xì)菌 使重要的細(xì)胞粘附功能 36。另外，豬 表達(dá) 者是 面表達(dá)的一種 37；后者則是一種 肌動(dòng)蛋白聚合蛋白 38。 用 養(yǎng)出的 未成熟 C， 共刺激分子 表達(dá)，是研究 熟過(guò)程的良好模型 22, 39。我們用為成熟誘導(dǎo)劑對(duì)豬 體外進(jìn)行成熟誘導(dǎo)，圖 10， 11 顯示，用 8 小時(shí)以后， 達(dá)無(wú)明顯改變， 子表達(dá)上調(diào)，也有人報(bào)道 熟后表達(dá)下調(diào) 28。 豬 因?yàn)樗麄冊(cè)谑艿?6 的表達(dá)上調(diào)。 第 3 章 豬 表型鑒定，免疫學(xué)功能檢測(cè)和體外成熟誘導(dǎo) 20 例如， 膿桿菌 白，脂磷壁酸和肽聚糖； 配體 多聚尿苷酸（ 40, 41。 體對(duì) 最大作用是誘導(dǎo)其成熟，最直接的表現(xiàn)是有關(guān)抗原遞呈的表面分子如 類(lèi)分子， 6的表達(dá)上調(diào) ， 熟后， 子表達(dá)上調(diào)，而且從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面， 但是 熟后刺激 T 細(xì)胞能力的增強(qiáng)并不僅僅取決于這些分 子表達(dá)的上調(diào) 42。 果表明， 激成熟的 未經(jīng)成熟刺激處理的同時(shí)相 比，刺激 T 細(xì)胞增殖的能力更強(qiáng)，說(shuō)明 導(dǎo)成熟的 導(dǎo)同種異體 T 細(xì)胞反應(yīng)的能力更強(qiáng)大，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng) T 細(xì)胞比例降至 1： 100時(shí)，仍然能觀(guān)察到 T 細(xì)胞明顯的免疫刺激作用。隨著 成熟，趨化因子受體表達(dá)和吞噬抗原的能力下降，而刺激 T 細(xì)胞增殖的能力增強(qiáng)，這些功能上的變化表明 攝取抗原逐漸過(guò)渡到提呈抗原的階段 41, 43。 成熟過(guò)程中，細(xì)胞表面的共刺激分子 有所升高，從而為激活 T 細(xì)胞提供必要的共刺激信號(hào)，我們的結(jié)果表明，豬 人類(lèi)和小鼠等動(dòng)物一樣，受到成熟刺激后，也會(huì)呈現(xiàn)共刺激分子表達(dá)上調(diào)， 刺激能力增強(qiáng)等反應(yīng)。 與 刺激不同的 如 誘導(dǎo) 應(yīng)細(xì)胞因子 應(yīng)細(xì)胞因子有 0。有意思的是， 豬 刺激下均能同時(shí)誘導(dǎo)較強(qiáng)的 泌，因而所誘導(dǎo)的T 細(xì)胞反應(yīng)并不偏向于 者 應(yīng)，而我們 細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬 成熟刺激 導(dǎo)后，成熟前后分泌 水平變化無(wú)顯著性差異 26。然而， 成熟和細(xì)胞因子應(yīng)答也會(huì)受到免疫調(diào)節(jié)的影響。體內(nèi)的不同環(huán)境和所遇到的不同刺激信號(hào)病原體而接受到的不同刺激信號(hào)，會(huì)具有多樣的反應(yīng)性。體外實(shí)驗(yàn)有時(shí)僅能模擬一部分體內(nèi)的實(shí)際情況。同樣，我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)所觀(guān)察到關(guān)于 結(jié)論，有時(shí)候可能在體內(nèi)環(huán)境下不一定完全適用。 如果采用 僅以 以刺激豬 養(yǎng) 710天后產(chǎn)生豬骨髓來(lái)源的 胞（ 其免疫表型和生物學(xué)特性與 本相同 26，在受到 成熟刺激以后，共刺激分子和 子 表達(dá)上調(diào)，對(duì)同種異體 T 細(xì)胞增殖刺激能力增強(qiáng)，從比較動(dòng)物學(xué)的觀(guān)點(diǎn)來(lái)看，與其他相動(dòng)物類(lèi)似 44。有所區(qū)別的是，豬血液中的 在于，其表型為 有特征性高表達(dá)的 子和 第 3 章 豬 表型鑒定，免疫學(xué)功能檢測(cè)和體外成熟誘導(dǎo) 21 6，如果繼續(xù)在體外培養(yǎng)，這些細(xì)胞的 共刺激分子表達(dá)將進(jìn)一步明顯提高，并呈現(xiàn)明顯的樹(shù)突狀形態(tài) 19。豬皮膚來(lái)源的 高表達(dá) 和共刺激分子 6，但不表達(dá) 與豬的 型不完全一致 45。 我們的結(jié)果顯示用 外誘導(dǎo) 到的 型符合 征，與人類(lèi)似，豬 受到 刺激發(fā)生成熟過(guò)程中 分子表達(dá)上調(diào)，趨化因子受體表達(dá)和吞噬能力下降，而刺激T 細(xì)胞增殖的能力增強(qiáng)。 第 4 章 構(gòu)建和 染試驗(yàn) 22 第 4 章 構(gòu)建和 染實(shí)驗(yàn) 料 胞 按照上文所述方法培養(yǎng)得到的豬 要實(shí)驗(yàn)器材 玻璃制品： 各型 刻度吸管 、燒杯、燒瓶 塑料制品： 各型號(hào)移液器、 槍頭、 、 離心管、培養(yǎng)板、 培養(yǎng)皿、細(xì)胞計(jì)數(shù)板 儀器設(shè)備： 、 900HT (司 )、 普通 及倒置 顯微鏡 （ 水平式離心機(jī) （ 司）、生物安全柜（ 司 ） 要實(shí)驗(yàn)試劑 胎牛血清 2 司 250 M） 司 重組豬粒單系集落刺激因子（ 司 重組豬白細(xì)胞介素 司 青霉素 (10萬(wàn) U) 華北制藥公司 鏈霉素 (10萬(wàn) U) 華北制藥公司 克隆抗體 司 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 司 第 4 章 構(gòu)建和 染試驗(yàn) 23 司 司 5緩沖液 司 寡聚（ 2 司 度各為 x ) 司 法 構(gòu)建 46 按照 用計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)，委托上海吉瑪基因公司合成。 序列一： 5 - 3 ; 5 序列二： 5 5 無(wú)義對(duì)照： 5 5 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 1. 將雙鏈 5 M） 6 l 加入 無(wú)血清培養(yǎng)液 250 l 中 ,混合均勻； 2. 將 無(wú)血清培養(yǎng)液 250 3. 將稀釋后的 合均勻，在常溫下孵育 15分鐘； 4. 6孔培養(yǎng)板輕輕吸去原來(lái)的培養(yǎng)液，更換新鮮的 .5 5. 將 孔板的培養(yǎng)液中，輕柔第 4 章 構(gòu)建和 染試驗(yàn) 24 前后搖擺培養(yǎng)板 , 使混合均勻， 0 6. 將上述三組（干擾一組，干擾二組和無(wú)義對(duì)照組） 組設(shè)兩個(gè)復(fù) 孔， 48小時(shí)后 72小時(shí)后 擾后 白表達(dá)的檢測(cè) 離心收集懸浮的 06細(xì)胞，加入 1% 20 150 2 10 10 心吸取上清獲得蛋白裂解液。用標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線(xiàn)法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。調(diào)整至相同量蛋白質(zhì)，加入 3 上樣緩沖液，煮沸 5分鐘，經(jīng)干式電轉(zhuǎn)至 3% 脫脂奶粉過(guò)夜封閉。次日，加入一抗兔抗 1 1 000) , 小鼠抗 1 1 000) 常溫下孵育 1 3%脫脂奶粉洗膜 3次 , 每次 1015 溫下相應(yīng)加入二抗，辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗兔 1 3 000) 常溫下孵育 1 h 以上 , 次 , 用化學(xué)發(fā)光 法或加入堿性磷酸底物顯色 , 進(jìn)行 擾后 達(dá)的檢測(cè) 計(jì)數(shù) 5 106個(gè)細(xì)胞，加入 1照說(shuō)明書(shū)的步驟提取總 用紫外分光光度法測(cè)定 88:1。以 3寡聚（ 2為引物， 反轉(zhuǎn)錄酶將 轉(zhuǎn)錄合成 時(shí)定量 應(yīng)采用 x 900列分析儀上進(jìn)行。具體的 應(yīng)為：總體積 20 l，包括 x ) 10 l，引物 (10 m) l ，模板 5 l。 應(yīng)分兩步：初始變性 95 C 10 秒，繼之為 95 C 5 秒， 60 C 30 秒共 40 個(gè)循環(huán)。用 18s 為陽(yáng)性?xún)?nèi)對(duì)照。引物序列為： 5引物 3 引物 物采用羅氏應(yīng)用科學(xué)提供的 件在線(xiàn)設(shè)計(jì)。 1、 細(xì)胞 110 7 2、 加 1 細(xì)胞用 1 第 4 章 構(gòu)建和 染試驗(yàn) 25 3、 勻漿（要徹底，后轉(zhuǎn)至 組織勻漿量 100 4、 顛倒混勻 10下，室溫 55、 加氯仿 1/5體積（ 必須按總體積的 1/5） 6、 顛倒混勻 10下，室溫 57、 4 ，離心 12000g， 158、 轉(zhuǎn)上層水相（約 400l ）于另一 中 9、 加等體積異 丙醇（約 400l ），混勻室溫 1010、 4 ，離心 12000g， 10棄上清 11、 加冰預(yù)冷的 75%乙醇（用 112、 4 離心 7500g， 5 13、 棄上清，空氣干燥 5能完全干燥） 14、 溶于 0l （ 10l （可在 55水中， （ 表 圖 第 5 章 干擾 誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性 免疫調(diào)節(jié)作用 39 擾前后的 示 刺激細(xì)胞 :反應(yīng)細(xì)胞 1:100 1:10 1:5 對(duì)照組 干擾 1 組 a 擾 2 組 b 隨著混合細(xì)胞中刺激細(xì)胞的比例增加， 漸增強(qiáng)， 最強(qiáng)；轉(zhuǎn)染 種反應(yīng)性下降， 低。 擾前后的細(xì)胞因子檢測(cè)的結(jié)果 用 檢測(cè) 合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子 分泌。 激后， 泌稍有增高，但與對(duì)照組相比，差異無(wú)顯著性（ P 染后， 泌增高，與對(duì)照第 5 章 干擾 誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性 免疫調(diào)節(jié)作用 40 組相比，差異具有顯著 性（ P 圖 圖 圖 按照刺激細(xì)胞：反應(yīng)細(xì)胞 =1： 10的比率進(jìn)行 P 圖 按照刺激細(xì)胞：反應(yīng)細(xì)胞 =1： 10的比率進(jìn)行 擾組 P 第 5 章 干擾 誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性 免疫調(diào)節(jié)作用 41 論 先天性免疫中的重要性在于 面的 于 識(shí)別，而族在 此識(shí)別過(guò)程中占據(jù)中心地位，是抗感染免疫反應(yīng)中最重要的 特異性地識(shí)別病原相關(guān)分子模式 病原微生物進(jìn)化中保守分子 , 如脂多糖 (肽聚糖、酵母多糖以及病原微生物的核酸等，通過(guò)誘導(dǎo)大量的趨化因子的分泌 , 以及上調(diào)趨化因子受體基因的表達(dá)，使免疫細(xì)胞快速而大量地向感染部位遷移；同時(shí)激活天然的免疫細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷能力，在激活天然免疫中發(fā)揮重要作用 74, 75。另一方面， 能調(diào)節(jié)獲得性免疫， 噬抗原、共刺激分子的表達(dá)、 成熟、遷移至次級(jí)淋巴組織將抗原呈遞給初始T 細(xì)胞，激活初始 T 細(xì)胞等都受到 胞表面的 別的調(diào)控；而且抗原特異的 T 細(xì)胞激活并分化為效應(yīng)細(xì)胞過(guò)程中需要的抗原肽 合物分子信號(hào)和共刺激分子信號(hào)也取決于 胞表面的 特定 識(shí)別。由此可見(jiàn)， 號(hào)傳導(dǎo)途徑是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁 76, 77。激活可以誘導(dǎo)很強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，有利于機(jī)體 抗病原微生物感染或者組織損傷，但是過(guò)強(qiáng)的免疫反應(yīng)也會(huì)導(dǎo)致許多不利影響，如產(chǎn)生自身免疫性疾病，內(nèi)毒素休克，以及對(duì)移植物的排異反應(yīng)等等。在穩(wěn)態(tài)條件下，機(jī)體存在 時(shí)地終止 信號(hào)，以避免過(guò)強(qiáng)的免疫反應(yīng)，以免對(duì)機(jī)體造成不利的影響。 型跨膜蛋白，在抗感染免疫上有重要作用。 胞內(nèi)區(qū)含有體同源區(qū)（ ,一保守結(jié)構(gòu)， 號(hào)傳導(dǎo)通路上的許多蛋白質(zhì)，如髓樣分化因子 88（ 8, 白介素 1受體相關(guān)激酶（ 腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子 都具有 構(gòu)域。 一種胞漿可溶性蛋白，結(jié)構(gòu)上包括 N 端的死亡結(jié)構(gòu)域 ( D) ,中間區(qū)域及 C 端的 共 3 個(gè)功能區(qū)域，是 究表明， 賴(lài)性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是大多數(shù) 號(hào)傳導(dǎo)中的共同通路，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程為 : 當(dāng) 受體發(fā)生二聚化 , 構(gòu)象改變，此時(shí)胞質(zhì)中 構(gòu)域與 C 端相互作用 , 端的 集下游同樣含死亡結(jié)構(gòu)域的 致 身磷酸化 , 磷酸化的 離 合， 最終導(dǎo)致第 5 章 干擾 誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性 免疫調(diào)節(jié)作用 42 和 激活，從而導(dǎo)致共刺激分子表達(dá)上調(diào)，并促使炎癥因子的分泌 78；另 外， ( 誘導(dǎo)型干擾素的分泌。因此， 號(hào)向下游傳導(dǎo)的重要的銜接分子 7, 78, 79。除了 外，所有的 可以通過(guò) 徑進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，此信號(hào)通路稱(chēng)為 信號(hào)通路是 依賴(lài)信號(hào)通路，通過(guò)另外的接頭蛋白 80。而 能通過(guò) 賴(lài)信號(hào)通路和 依賴(lài)信號(hào)通路這兩條途徑進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo) 81。 巨噬細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞表面是表達(dá) 類(lèi)最多的細(xì)胞，這些有識(shí)別 功能，例如 別革蘭氏陰性菌的脂多糖（ ， 別細(xì)菌 的 列。 分布尤為復(fù)雜，這也從側(cè)面反映了不同 群的相應(yīng)功能。 活 T 細(xì)胞需要兩種信號(hào)：第一種是抗原肽 子復(fù)合物提供的抗原特異信號(hào)，第二種信號(hào)是 6 等共刺激分子提供的共刺激信號(hào)。已知第一種信號(hào)的提供與 密切關(guān)系；在抗感染免疫中，第二種信號(hào)主要也是由 供， 使 達(dá)共刺激分子 82。例如 經(jīng) 進(jìn)靜止 達(dá) I、 膜分子，從而使 有這些處理和提呈抗原所必須的表面結(jié)構(gòu)分子 , 促使 體刺激導(dǎo)致炎癥趨化因子受體如 調(diào) , 而歸巢受體如 調(diào)，這樣有利于 遷移， 遷移過(guò)程中逐漸成熟，而 成熟對(duì)于其作為 刺激幼稚 T 細(xì)胞至關(guān)重要 83。可見(jiàn)， 號(hào)傳導(dǎo)途徑在調(diào)節(jié)成熟過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用 84。 為 號(hào)傳導(dǎo)通路中的一個(gè)關(guān)鍵接頭蛋白，其功能缺陷不僅會(huì)導(dǎo)致許多 功能受損 7, 8，而且會(huì)令 成熟刺激不能產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞因子。 使小鼠 導(dǎo) 對(duì)于 除小鼠 誘導(dǎo)了 應(yīng)，這表明 子是調(diào)節(jié) 應(yīng)和 應(yīng)一個(gè)關(guān)鍵性的分子。一旦敲除了 子后，不能使該小鼠 導(dǎo)任何偏向于 反應(yīng)，這證明了 于 作用需要通過(guò) 能起作用。 發(fā)現(xiàn) 陷將導(dǎo)致疫反 應(yīng)缺陷 85，因?yàn)?除之 激下難以分泌 5 章 干擾 誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性 免疫調(diào)節(jié)作用 43 而 誘導(dǎo) 應(yīng)所需的細(xì)胞因子 86, 87。 用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都證實(shí)了在 敲除的情況下， 過(guò) 號(hào)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)了 疫反應(yīng)， 進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明， 刺激 大量分泌 C 分泌，是誘導(dǎo) 應(yīng)的強(qiáng)刺激劑），但是 敲除后小鼠 刺激下卻不能分泌 而 果補(bǔ)充外源性顯著增強(qiáng)該 泌 是無(wú)法逆轉(zhuǎn) 泌的高水平。這說(shuō)明，盡管 是在抑制 C 所誘導(dǎo)的 應(yīng)不單純是由促 胞因子分泌下降所導(dǎo)致的，此外可能還有別的機(jī)制 88。 根據(jù) 因序列的特點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì) 了針對(duì) 4 對(duì) 過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選比較后我們選取了其中的兩對(duì)，即干擾一序列和干擾二序列。采用脂質(zhì)體導(dǎo)入了針對(duì) ，我們獲得了具有調(diào)節(jié)性 型的細(xì)胞，通過(guò) 而用 檢測(cè) 養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子（ 分泌，從而了解 擾后 免疫調(diào)節(jié)作用。從 看，顯增強(qiáng)了 同種異體 T 細(xì)胞的免疫刺激作用，而干擾后的 激 T 細(xì)胞增殖能力下降，說(shuō)明 顯減弱了 這種刺激作用。而且，干擾后 泌上升，表明干擾后的導(dǎo)了 T 細(xì)胞由 應(yīng)的偏移 89。與人和小鼠的 所不同88，我們的結(jié)果表明 能促進(jìn)正常表達(dá) 豬 導(dǎo) 應(yīng)，說(shuō)明對(duì)于豬 說(shuō)，依賴(lài) 信號(hào)傳導(dǎo)通路相對(duì)于 依賴(lài)的信號(hào)傳導(dǎo)通路并不更占據(jù)主導(dǎo)地位。但而當(dāng) 子被干擾以后， 導(dǎo)了 應(yīng)，說(shuō)明依賴(lài) 子的信號(hào)傳導(dǎo)通路與非 子依賴(lài)的信號(hào)傳導(dǎo)通路這兩條通路之間存在一個(gè)很重要的動(dòng)態(tài)平衡，抑制其中的一個(gè)通路的信號(hào)傳導(dǎo)， 另外一個(gè)通路就會(huì)占據(jù)主導(dǎo)地位。 在正常生理情況下，成熟 幼稚 T 細(xì)胞共同作用形成所謂的“免疫突觸”，并導(dǎo)致相應(yīng)的細(xì)胞因子分泌 90, 91。已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證明通過(guò)阻斷 刺激分子 細(xì)胞刺激作用降低與細(xì)胞因子 92, 93。我們的結(jié)果說(shuō)明，通過(guò) 術(shù)干擾豬 因，阻斷了號(hào)傳導(dǎo)途徑，抑制了 胞的成熟，其與同種異體反應(yīng)性 T 細(xì)胞共同作用后的細(xì)胞因 子分泌被顯著改變。然而， 成熟和細(xì)胞因子應(yīng)答也會(huì)受到免疫調(diào)節(jié)的影響。 族對(duì)于因在體內(nèi)的不同環(huán)境和所遇到的不同病原體第 5 章 干擾 誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性 免疫調(diào)節(jié)作用 44 而接受到的不同刺激信號(hào)，會(huì)具有多樣的反應(yīng)性。體外實(shí)驗(yàn)有時(shí)僅能模擬一部分體內(nèi)的實(shí)際情況。同樣，我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)所觀(guān)察到關(guān)于 結(jié)論，有時(shí)候可能在體內(nèi)環(huán)境下不一定完全適用。 胞激活后究竟是向 應(yīng)細(xì)胞抑或 應(yīng)細(xì)胞方向分化在很大程度上取決于 及細(xì)胞所處的微環(huán)境，而不是 T 細(xì)胞本身的狀態(tài) 94。 C 采用何種方式誘導(dǎo) T 細(xì)胞的免疫反應(yīng)，例如大腸桿菌的 激 導(dǎo) 應(yīng)；一種來(lái)自蠕蟲(chóng)蟲(chóng)卵的抗原能使 應(yīng) 95, 96。此外， 成熟狀態(tài)對(duì)于誘導(dǎo)免疫反應(yīng)方