【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）馬鈴薯Y病毒CP基因不同區(qū)段對發(fā)夾RNA和人工的miRNA介導(dǎo)的病毒抗性的影響-植物抗病毒基因工程博士論文

分類號： 授予學(xué)位單位代碼： 10434 U D C： 密 級： 研 究 生 學(xué) 號 ： 東農(nóng)業(yè)大學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文 馬鈴薯 Y 病毒 因不同區(qū)段對發(fā)夾 人工的導(dǎo)的病毒抗性的影響 P of NA 011 年 5 月 10 日 研 究 生 ： 學(xué)科專業(yè) ： 生物化學(xué)與分子生物學(xué) 研究方向 ： 植物抗病毒基因工程 學(xué)院 ： 生命科學(xué)學(xué)院 指導(dǎo)教師 ： 教授 教授 論 文 提 交 日 期： 論 文 答 辯 日 期： 學(xué) 位 授 予 日 期： 學(xué) 科 門 類 答 辯 委 員會 主席： P of NA 2011 關(guān)于學(xué)位論文 原創(chuàng)性和使用授權(quán)的聲明 本人所呈交的學(xué)位論文，是在導(dǎo)師指導(dǎo)下，獨立進(jìn)行科學(xué)研究所取得的成果。對在論文研究期間給予指導(dǎo)、幫助和做出重要貢獻(xiàn)的個人或集體，均在文中明確說明。本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。 本人完全了解山東農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留和使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留和按要求向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文紙質(zhì)本和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)山東農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有 關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文和匯編本學(xué)位論文，同時授權(quán)中國科學(xué)技術(shù)信息研究所將本學(xué)位論文收錄到 中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫并向社會公眾提供信息服務(wù) 。 保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定。 論文作者簽名： 導(dǎo) 師 簽 名 日 期： 符 號 說 明 異 常 人工的 35S 花椰菜花葉病毒 35S 動子 羧芐青霉素 互補 查爾酮 合成酶 十六烷基 三甲基 溴化銨 焦碳酸二乙脂 雙鏈 乙二胺四乙酸 酶聯(lián)免疫檢測 發(fā)夾 R: 反向重復(fù) 卡那霉素抗性 微小 （ 乙磺酸 磷酸鹽緩沖液 源于病原物獲得的抗性 轉(zhuǎn)錄后基因沉默 NA 依賴于 合酶 導(dǎo)的沉默復(fù)合體 導(dǎo)的病毒抗性 擾 十二烷基硫酸鈉 小干擾 沉默 轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默 目錄 中 文 摘 要 . 1 英 文摘要 . 4 1 前 言 . 7 因沉默 . 7 默 . 8 干擾 . 8 小 . 9 聯(lián)系 和區(qū)別 . 10 他 參與沉默的 小分子 . 11 默的作用機制 . 13 徑 . 14 徑 . 14 導(dǎo)的病毒抗性 . 15 導(dǎo)的病毒抗性的特點 . 17 導(dǎo)的病毒抗性是轉(zhuǎn)錄后基因沉默的結(jié)果 . 18 于 抗病毒策略 . 19 物抗病毒研究中高效的發(fā)夾 物 表達(dá)載體的構(gòu)建 . 20 結(jié)構(gòu) 長度的影響 . 20 區(qū)域的影響 . 21 酸序列同源性的影響 . 20 錄速度的影響 . 22 于 抗病毒策略 . 22 工 術(shù)的影響因素 . 23 列的設(shè)計與優(yōu)化 . 23 然的 體的選擇 . 24 鈴薯 Y 病毒與抗病毒基因工程 . 24 研究的目的及其意義 . 26 2 材料與方法 . 28 料 . 28 源 . 28 試植物 . 28 株、質(zhì)粒 . 28 法 . 28 建含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)載體 . 28 物表達(dá)載體的構(gòu)建策略 . 28 增特異性引物設(shè)計 . 29 建 基因植物表達(dá)載體 . 30 物表達(dá)載體的構(gòu)建策略 . 31 篩選 . 31 物的設(shè)計 . 31 增目的片段 . 32 的片段與克隆載體的連接 . 33 的片段和質(zhì)粒 酶切 . 33 段的回收（試劑盒法） . 34 的片段與質(zhì)粒 連接 . 34 受態(tài)細(xì)胞的制備 . 35 粒 大腸桿菌中轉(zhuǎn)化（熱激法） . 35 化菌落 定 . 35 粒 大量提?。▔A性 ） . 36 組質(zhì)粒的酶切鑒定 . 38 組質(zhì)粒向農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化（凍融法） . 38 桿菌介導(dǎo)的瞬時侵染 . 38 桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化 . 39 物總 提取（ ） . 40 基因植株的 測 . 40 基因植株的抗病性鑒定及 測 . 40 基因植株的抗病性鑒定 . 40 基 因植株的 測 . 41 交分析 . 41 基因植株總 提?。?步提取法） . 41 含有甲醛的凝膠上進(jìn)行 泳 . 42 膜 . 42 針制備 . 43 記有效性檢測 . 44 交 . 45 基因植株 提取及雜交分析 . 46 基因植株 提取 . 46 泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳） . 47 膜（電轉(zhuǎn)膜）及固定 . 48 針的制備 . 49 交 . 49 3 結(jié)果與分析 . 50 向于 馬鈴薯 Y 病毒 因 不同區(qū)段的 導(dǎo)的病毒抗性 . 50 物表達(dá)載體的構(gòu)建 . 50 P 不 同區(qū)段正向和反向目的片段的獲得 . 50 向目的片段與表達(dá)載體 的連接 . 51 向目的片段與重組中間載體的連接 . 51 桿菌介導(dǎo)的瞬時侵染驗證 物表達(dá)載體的有效性 . 53 化 農(nóng)桿菌 株 . 53 時表達(dá)靶向 P 的 檢測 . 54 交檢測瞬時侵染時靶 積累 . 55 基因煙草的獲得 . 56 基因煙草的檢測 . 57 基因煙草的抗病性分析 . 59 基因煙草的 交分析 . 63 基因 煙草植株中 雜交分析 . 64 2 代轉(zhuǎn)基因植株的抗病性分析 . 65 工的 導(dǎo)的馬鈴薯 Y 病毒抗性 . 66 篩選及引物設(shè)計 . 66 南芥天然 體的克隆 . 66 向于 P 基因不同區(qū)段的 人工 達(dá)載體的構(gòu)建 . 68 組表達(dá)載體的鑒定 . 68 桿菌介導(dǎo)的瞬時侵染檢測 達(dá)載體的有效性 . 70 化農(nóng)桿菌 株 . 70 時表達(dá)靶向 P 的 檢測 . 70 交檢測靶 積累 . 71 基因煙草的獲得 . 72 基因煙草的檢測 . 72 基因植株的抗病性分析 . 74 基因煙草的 交分析 . 77 基因煙草植株中 雜交分析 . 78 2 代轉(zhuǎn)基因植株的抗病性分析 . 79 4 討論 . 81 5 結(jié)論 . 89 參 考文獻(xiàn) . 90 致 謝 . 106 攻 讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況 . 107 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文 1 中文摘要 基因沉默是生物體長期以來形成的一種防御機制，阻止 外源基因、轉(zhuǎn)座因子、病毒等外源核酸的侵入，保護(hù)生物基因組的完整性。 小干 擾 微小 兩種序列特異性地轉(zhuǎn)錄后 基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，是 沉默 侵入植物細(xì)胞的病毒基因組與轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有部分同源性，因此在 轉(zhuǎn)錄后基因沉默 所導(dǎo)致的 近乎免疫 ） 、抗性持久、生物安全性高等優(yōu)點 。 在基因沉默的研究中 已 發(fā)現(xiàn) “位置效應(yīng)” 的存在 ， 能 受到靶序列所處的位置 影響。在 前尚未見有關(guān)“位置效應(yīng)”的系統(tǒng)報道。 本研究以馬鈴薯 方式 構(gòu)建 體，系 統(tǒng)性的比較 尋找引發(fā)基因沉默的有效片段及更好利用 研究結(jié)果和主要結(jié)論如下： （ 1） 馬鈴薯 Y 病毒 因不同區(qū)段對發(fā)夾 導(dǎo)的病毒抗性的影響 將 P 基因人工的劃分為 16 段各 50區(qū)段。 通過 增，得到相應(yīng)的不同區(qū)段的正向和反向的片段 ， 通過酶切連入植物表達(dá)載體 中 ； 熱 激 法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 篩 選 并 獲 得 構(gòu)的 植 物 表 達(dá) 載 體 用 成 功 構(gòu)建的 16 個植物表達(dá)載體（ 另外 8 個為吳斌構(gòu)建）瞬時侵染本生煙 驗證其有效性 ， 果 顯示 ， 16 個植物表達(dá)載體均能在植物體內(nèi)成功表達(dá)產(chǎn)生 瞬時表達(dá)的 有效地下調(diào)靶基因 P 的表達(dá) 。 將構(gòu)建的 8 個 植物表達(dá)載體利用凍融法 導(dǎo)入農(nóng)桿菌 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草經(jīng)卡那霉素抗性篩選和 測 確定 轉(zhuǎn)基因植株。 轉(zhuǎn)基因植株自交， 種子置于 含卡那霉素的篩選培養(yǎng)基上 進(jìn)行 篩選 ，共 得到 的 50 株、62 株、 56 株、 55 株、 45 株、 63 株、 72 株 和 55 株 轉(zhuǎn)基因植株。 抗病性分析 發(fā)現(xiàn)除了轉(zhuǎn)基因株系 獲得抗性植株外，其余 12 個轉(zhuǎn)基因株系中抗性植株的比例分別 為 馬鈴薯 Y 病毒 因不同區(qū)段對 發(fā)夾 人工的 導(dǎo)的病毒抗性的影響 2 結(jié)果 表明 在利用 導(dǎo)的抗 毒的研究中，以 P 基因上的 50列為莖 足以介導(dǎo)宿主植株的基因沉默的產(chǎn)生， 但 由于 位置的 差 異 產(chǎn)生不同的抗病效率 ， 靶向于 3端 段 表現(xiàn)最高水平的抗性 ； 且 以 因 3端為靶序列的 5端 為靶序列的植株 更能有效地介導(dǎo)對 抗性 。 轉(zhuǎn)基因植株的 交 分析表明，轉(zhuǎn)基因都在 平上得到了表達(dá)， 抗病植株中 積累量明顯低于同類型的感病植株，抗性與 累量呈負(fù)相關(guān) ， 證實 病毒抗性是由 導(dǎo)的；對轉(zhuǎn)基因植株的 達(dá)量的分析 ， 表明 植株對病毒的敏感程度與 累量之間沒有明顯的相關(guān)性。 對 的轉(zhuǎn)基因植株的抗病性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn) ， 幾乎 所有的 抗性轉(zhuǎn)基因植株的后代均表現(xiàn)很強的抗病毒侵染能力， 說明由 導(dǎo)的 性在 植株中能夠穩(wěn)定遺傳。 （ 2） 馬鈴薯 Y 病毒 因不同區(qū)段對人工的 導(dǎo)的病毒抗性的影響 以 P 基因 的全長 列 為靶基因， 根據(jù) 特征選取 8 個不同的位置， 、 和 為靶區(qū)。 選用 擬南芥 體 作 為 達(dá)的 骨架， 通過 增的方式 替代 掉 原有的 具有生物學(xué)功能的 得到含有 段 。將擴增 產(chǎn)物 連入 植物表達(dá)載體 。 熱 激 法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 篩選并獲得重組 表達(dá)載體 用構(gòu)建的 達(dá)載體瞬時侵染本生煙， 證其有效性， 結(jié)果 顯示 ， 8 個 物表達(dá)載 體均能在植物體內(nèi)成功表達(dá) 瞬時表達(dá)的有效地下調(diào)靶 P 基因的表達(dá) 。 將成功構(gòu)建的 達(dá)載體 利用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草 生植株經(jīng)卡那霉素抗性篩選和 測 確定為轉(zhuǎn)基因植株。 自交 后 ，經(jīng)卡那 霉素 篩選和 定 ， 分別獲得 轉(zhuǎn)基因植株 98 株、 96 株、 114 株、 116 株、 117 株、 111 株、 110 株 和 116 株。 抗病性 結(jié)果顯示，表達(dá) 靶向于馬鈴薯 Y 病毒 因的 基因植 株能介導(dǎo)對馬鈴薯 Y 病毒的抗性 ，抗性比例分別為 針對馬鈴薯 Y 病毒 因不同區(qū)段設(shè)計的 轉(zhuǎn)基因植株所 介導(dǎo)的抗山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文 3 病 性 效果 之間 存在差異， 靶向于 3端的 能 表現(xiàn)更高水平的抗性。 轉(zhuǎn)基因植株的 交 分析表明，轉(zhuǎn)基因都在 平上得到了表達(dá)， 且植株的抗性與轉(zhuǎn)基因的表達(dá)量成負(fù)相關(guān)，表明 導(dǎo)的病毒 抗性是由 導(dǎo)的。對轉(zhuǎn)基因植株的 析，結(jié)果顯示，所有抗病轉(zhuǎn)基因植株中 都有 在，且植株的抗性與 表達(dá)量成正相關(guān)。 對 的轉(zhuǎn)基因植株的抗病性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的抗性轉(zhuǎn)基因植株 的后代都表現(xiàn)高的抗病率 ，表 明由 導(dǎo)的 性 在 植株中 能夠穩(wěn)定