【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）小尾寒羊5個(gè)與繁殖和疾病抗性相關(guān)基因的克隆及比較基因組學(xué)分析動(dòng)物遺傳育種與繁殖博士論文

密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 小尾寒羊 5 個(gè)與繁殖和疾病抗性相關(guān)基因 的克隆及比較基因組學(xué)分析 5 I 摘 要 綿羊作為世界上重要的可再生資源，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位 。在雞、牛和豬已經(jīng)完成初步的基因組測(cè)序的情況下， 綿羊基 因組 的 研究現(xiàn)狀 呈現(xiàn)明顯的滯后狀態(tài) 。 基于比較基因組學(xué)的研究手段， 在基因組圖譜和測(cè)序的基礎(chǔ)上，利用模式生物基因組研究中獲得的信息推測(cè) 畜禽品種中的基因數(shù)目、位置、功能、表達(dá)機(jī)理和物種進(jìn)化 ，可以實(shí)現(xiàn) 對(duì) 畜禽品種 重要經(jīng)濟(jì)性狀 候選 基因的鑒定、克隆和特性的認(rèn)識(shí)。本課題嘗試在中國(guó)地方綿羊品種的功能基因組研究中引入比較基因組的 研究方法 ，進(jìn)行綿羊繁殖和疾病抗性相關(guān)基因的克隆，為中國(guó)地方綿羊的選育和品種資源保護(hù)提供理論依據(jù)，并用以指導(dǎo)綿羊品種的分子育種和品種資源的保護(hù)工作。 本實(shí)驗(yàn) 共 克隆了綿羊 羊和山羊 個(gè) 基因，并對(duì) 各個(gè) 基因 進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析 ，結(jié)果如下： 綿羊 長(zhǎng) 1449o. ， 867 核苷酸，可編碼 288個(gè)氨基酸，該蛋白具有典型的 構(gòu)域，氨基酸序列與人、犬、小鼠、大鼠、黑猩猩、恒河猴等的一致性均在 95%以上。 綿羊 動(dòng)子 ， 5 錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。多物種的 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析表明， 因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性與物種進(jìn)化復(fù)雜程度可能存在一定的相關(guān)性。 43 個(gè) 物種 其直向同源物 蛋白的聚類(lèi)與生物進(jìn)化的方向基本一致， 并且蛋白的 3構(gòu)也同樣保守，但 各物種 非翻譯區(qū) 在基因調(diào)控及表達(dá)中發(fā)揮了不同作用，從而 在 進(jìn)化方向 上存在一定差異 。 建立了高效的綿羊 核表達(dá)體系，為進(jìn)一步獲得抗血清并應(yīng)用到 白功能研究奠定了基礎(chǔ) 。 小尾寒羊睪丸和卵巢中 共 克隆了 75 個(gè)非冗余的 擇性剪接產(chǎn)物 克隆，其中卵巢組織中26 個(gè)，睪丸組織中 49 個(gè)，涵蓋了 5 端或 3 端的選擇性剪接、外顯子跳躍及內(nèi) 含子保留等 3種主要的剪接方式。 其中 34 條編碼的氨基酸殘基超過(guò) 20 個(gè) ， 根據(jù)編碼產(chǎn)物 析的結(jié)果 可將 其 分為 6 組。第一組共 10 個(gè)選擇性剪接產(chǎn)物（卵巢中 1 個(gè)，睪丸中 9 個(gè)），編碼蛋白均為 端結(jié)構(gòu)域。第二組共計(jì) 17 個(gè)（卵巢中 4 個(gè)，睪丸中 13 個(gè)）與犬中存在的另一種擇性剪接的蛋白序列一致性達(dá)到 94%。第三組共 3 條序列，第四組共 2 條序列 ，均為睪丸中的選擇性剪接產(chǎn)物，功能未知 。第五組序列為 1 條， 12 個(gè) 多物種 C 段結(jié)構(gòu)域存在 85%的一致性。 第六組序列為卵巢中的 1 條選擇性剪接方式 ， 功能未知 。 綿羊 因在不同 生殖系統(tǒng) 中可能存在大量的非編碼 睪丸非編碼 42%（ 21/49），卵巢的非編碼 84%（ 22/26）。 7 條 150下的 增產(chǎn)物的 級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)呈現(xiàn)一種類(lèi)似的“莖泡”樣結(jié)構(gòu)，并隨著序列堿基數(shù)目增加在主莖環(huán)結(jié)構(gòu)外也增加了其他莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使整體的二級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)“十字”型變化。 小尾寒羊 和 濟(jì)寧青山羊 分別 為 103311由兩個(gè)外顯子構(gòu)成。 綿羊 94%、黑猩猩 77%、人 77%、恒河猴 77%、小鼠77%。蛋白的相似性分別為牛 87%、黑猩猩 66%、人 66%、恒河猴 67%、小鼠 63%。多物種的 在 2個(gè)泛素同源結(jié)構(gòu)域，并且其 3 顯示出較高的相似性。 已克隆的小尾寒羊 序列在 904個(gè) 13個(gè) 失 突變，由此造成小尾寒羊 的 47425碼氨基酸殘基的個(gè)數(shù)也從 照 序列 57個(gè)氨基酸殘基變?yōu)?174個(gè)氨基酸殘基 ，3短為 19寧青山羊的 02碼 133個(gè)氨基酸殘基 。 啟動(dòng)子區(qū)分析顯示該基因?yàn)闊o(wú) 除犬 41+45物種23+27。 小尾寒羊和濟(jì)寧青山羊的 ）缺失的現(xiàn)象，使其 末端結(jié)構(gòu)并不存在 序列。 綿羊基因組中 因 克隆產(chǎn)物長(zhǎng) 4192 括 115 52個(gè) 4 3尾寒羊 其他哺乳動(dòng)物 96%，豬 87%，馬 86%，貓 85%，犬 85%，人 83%，黑猩猩 83%，恒河猴 83%，大鼠 78%，小鼠 77%，和 負(fù)鼠 70%。 95%，豬 85%，馬 83%，貓84%，犬 83%，人 79%，黑猩猩 79%，恒河猴 79%，大鼠 72%，小鼠 73%，和 負(fù)鼠 60%。多物種 能 域 在數(shù)量、種類(lèi)及相對(duì)位置上 均有不同，因而造成恒河猴和小鼠在多物種 能域 聚類(lèi) 分析 與基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的聚類(lèi)的位置上存在差異。 綿羊基因組中 因 克隆產(chǎn)物長(zhǎng) 4927 括外顯子 28和 493 3在綿羊的精子和卵子發(fā)生過(guò)程中， 基因轉(zhuǎn)錄、 因組擴(kuò)增產(chǎn)物為 3括 7 個(gè)外顯子及 50 5 189 3增產(chǎn)物 799 576碼 191 個(gè)氨基酸。 多物種 常保守， 綿羊與其他物種的 列一致性分別為與牛為 98%，犬 95%，人、恒河猴、大鼠和小鼠均為 93%。 白分子量為 電點(diǎn)為 有與其它哺乳動(dòng)物相同的 構(gòu)域，與其他物種的相似性分別為，牛 97%，犬和恒河猴 87%，人 88%，大鼠和小鼠 85%。 關(guān)鍵詞 綿羊 比較基因組學(xué) 繁殖性狀相關(guān)基因 疾病抗性相關(guān)基因 基因克隆 s an in in In on on of be to of in So be We to of on to in to or by of as 449bp in o. 67 88 is of SD of 5%. of of of 3 to -D of in to or We 5 6 9 S 34 S in 0 to be in S(1 0 4 3 7 of S of 12 AA on 5% of a of in 21/49) 22/26). S 50bp S 033bp 11by 4% 7%, 7%, 7%, 7%. 7% 6%, 6%, 7%, 3%. to -D a G 04a G 3bp 2574902749PE of 41+4523+27 of a in 19215 2 34 6% 7%, 6%, 5%, 5%, 3%, , 3%, 3%, 8%, 7%, 0%. 5% 5%, 3%, 4%, 3%, 9%, , 9%, 9%, 2%, 3%, 0%. on a in 927of to , 493 on NA Kb in 50 7 189 99918% 5%; 3%. of is of 7% 5%; 8%, 5%. V 目 錄 第一章 比較基因組學(xué)及應(yīng)用 . 1 間比較基因組學(xué)研究 . 1 列比對(duì)的工具與策略 . 1 基因組的比較研究 . 3 統(tǒng)發(fā)生的進(jìn)化關(guān)系分析 . 3 因的預(yù)測(cè) . 4 因組中非編碼區(qū)域的結(jié)構(gòu)與功能研究 . 4 內(nèi)比較基因組學(xué)研究 . 5 核苷酸多態(tài)性 . 6 貝數(shù)多態(tài)現(xiàn)象 . 7 因組內(nèi)的結(jié)構(gòu)變異研究 . 8 語(yǔ) . 8 第二章 材料與方法 . 10 驗(yàn)材料 . 10 驗(yàn)動(dòng)物及采樣方法 . 10 要儀器設(shè)備 . 10 要試劑 . 11 酸提取 . 12 取 . 12 取及反轉(zhuǎn)錄 . 13 隆及測(cè)序 . 15 株和載體 . 15 腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備 . 15 粒提取 . 16 粒純化 . 17 切、目的片斷回收及連接轉(zhuǎn)化 . 17 組質(zhì)粒的快速篩選 . 18 列測(cè)定 . 19 第三章 不同物種 因結(jié)構(gòu)及其系統(tǒng)進(jìn)化分析 . 20 言 . 20 基因和蛋白結(jié)構(gòu) . 20 定位和作用方式 . 21 功能 . 22 降解 . 24 料與方法 . 25 羊 因全長(zhǎng) 隆 . 25 序列選取 . 25 列比對(duì) . 26 列分析 . 26 白質(zhì) 3構(gòu)預(yù)測(cè) . 27 果與分析 . 27 羊 因克隆與序列分析 . 27 動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析 . 27 同物種 碼區(qū)、 5 3統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 . 28 基因在哺乳動(dòng)物中的分布及序列比對(duì) . 32 白質(zhì) 3構(gòu)比較 . 32 論 . 34 因的進(jìn)化 . 34 白 3構(gòu)和功能之間的關(guān)系 . 35 激蛋白與熱休克蛋白之間的關(guān)系 . 36 第四章 小尾寒羊 因的原核表達(dá) . 38 料和方法 . 38 織來(lái)源 . 38 體與菌株 . 38 取和純化和 一鏈的合成 . 38 . 38 物克隆、鑒定與序列分析 . 38 組表達(dá)質(zhì)粒 建 . 38 合誘導(dǎo)表達(dá) . 39 定 . 39 果與分析 . 40 因 克隆與序列分析 . 40 核表達(dá)載體構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá) . 40 論 . 41 第五章 小尾寒羊 丸和卵巢組織中選擇性剪接方式研究 . 42 料和方法 . 43 取和純化和 一鏈的合成 . 43 長(zhǎng)產(chǎn)物擴(kuò)增 . 43 物純化與克隆、測(cè)序 . 43 列分析 . 43 果與分析 . 43 長(zhǎng)引物的擴(kuò)增及克隆 . 43 接方式分析及 物預(yù)測(cè) . 47 長(zhǎng)小于 150剪接方式編碼產(chǎn)物 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) . 54 論 .