【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與大麥黃矮病毒編碼蛋白互作的短肽植物病理學(xué)碩士論文

密級 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與 大麥黃矮病毒編碼蛋白互作的短肽 F 摘 要 禾 谷類作物的黃矮病是由大麥黃矮病毒 (稱 侵染所引起的，在世界各國均有發(fā)生，由蚜蟲進行 循環(huán)性的永久傳播。大麥黃矮病株系的命名，是根據(jù)各株系特異或主要的介體蚜蟲來進行的。我國特有的株系 麥二叉蚜和禾縊管蚜傳播 ， 麥長管蚜和麥二叉蚜傳播。病毒介體?；詮?，僅局限于植物的韌皮部生長且細胞內(nèi)病毒含量很低，目前還沒有理想的方法來防治該病毒。 酵母雙雜交系統(tǒng)（ 研究蛋白質(zhì)間相互作用的一種有效方法。該系統(tǒng)能迅速、 靈敏 地在真核細胞體內(nèi)檢測蛋白生理狀態(tài)下的互作，并可快速獲得目的蛋白的編碼基因， 近幾年來 已在植物病毒學(xué)的很多領(lǐng)域得到應(yīng)用。本研究利用 雙雜交 系統(tǒng)篩選與大麥黃矮病毒系 的移動蛋白和外殼蛋白以及 系 的移動蛋白 互作的短肽，并對獲得的短肽進行初步研究，為研究該病毒的致病機制，培育抗病毒小麥奠定基礎(chǔ)。 本文 根據(jù)已知的大麥黃矮病毒 系 和 系的移動蛋白 (P)基因序列 以及 系的外殼蛋白 (基因序列分別 合成上下游引物，通過 增獲得目的片段后 構(gòu)建了酵母表達載體 于在酵母雙雜交分析中 表達誘餌融合蛋白。 用 選 司的隨機肽庫，獲得了兩種和該蛋白互作的短肽， 分別為： 對這兩種短肽進行了生物信息學(xué)分析，初步了解了其基本性質(zhì)。然后利用獲得的短肽和 轉(zhuǎn)化酵母細胞， 沒有檢測到相互作用的發(fā)生， 同樣的方法檢測 沒有相互作用的發(fā)生， 說明 這種互作是特異性發(fā)生在 篩選到的短肽之間的。有希望利用獲得的短肽培育出短肽介導(dǎo)的抗病毒小麥。 關(guān)鍵詞： 酵母雙雜交，大 麥黃矮病毒，隨機肽庫，寄主與病原互作 is to be of In is a of at in be on of by is by to be to of be to of a to in of is to a or a be in is CR on of a NA to of to s on we we do So of be 目 錄 第一章 引 言 . 1 第一節(jié) 文獻綜述 . 1 1. 酵母雙雜交 .母雙雜交系統(tǒng)的基本原理 .母雙雜交的 特點與優(yōu)點 .母雙雜交系統(tǒng)局限性和改進 .母雙 雜交系統(tǒng)的發(fā)展 . 酵母雙雜交系統(tǒng)在病毒學(xué) 中 的應(yīng)用 .母雙雜交系統(tǒng)在病毒粒體分子結(jié)構(gòu)和裝配研究中的應(yīng)用 .母雙雜交系統(tǒng)在病毒核酸復(fù)制及基因表達調(diào)控研究中的應(yīng)用 .母雙雜交系統(tǒng)在病毒介體傳播的分子機制研究中的應(yīng)用 .母雙雜交系統(tǒng)在病毒運動模式中的應(yīng)用 .母雙雜交系統(tǒng)在病毒致病機制研究中的應(yīng)用 .母雙雜交系統(tǒng)在病毒編碼蛋白聯(lián)系圖譜研究中的應(yīng)用 .定病毒蛋白與宿主受體蛋白間的相互作用 .定蛋白質(zhì)之間相互作用的特定區(qū)域 .母雙雜交系統(tǒng) 在基因組研究中的應(yīng)用 10 3. 小結(jié) 11 第二節(jié) 研究背景及意義 . 12 第二章 構(gòu)建酵母表達載體 . 14 1. 材料 . 14 種 14 劑 14 2. 方法 . 14 增 . .制備外源基因 .制備載體 .連接、轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒的鑒定 17 3. 結(jié)果與分析 . 19 體的構(gòu)建 .因的 增結(jié)果 .因的克隆和重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果 .因的克隆和重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果 .序列測定及分析 . 小結(jié)與討論 . 23 第三章 酵母雙雜交篩選 與誘餌蛋白 互作 的短肽 . 24 1. 材料 . 24 菌種 .試劑 . 24 2. 方法 . 24 隨機肽庫 滴度測定 .擴增 7購買的隨機肽庫 .酵母菌株 表現(xiàn)型鑒定 .酵母感受態(tài)的制備 .酵母共轉(zhuǎn)化 . .擴增并從酵母中提取質(zhì)粒 .檢測短肽和 間的相互作用 . 結(jié)果與分析 . 30 操作流程 .酵母表現(xiàn)型的確認 .隨機肽庫 滴度 .隨機肽庫和 7增結(jié)果 .酵母共轉(zhuǎn)化及 .再次共轉(zhuǎn)化及重新確認結(jié)果 .對獲得的短肽測序、分析結(jié)果 .篩選到的短肽和 互作用的檢測結(jié)果 . 小結(jié)與討論 . 39 第 四 章 主要結(jié)論 .考文獻 . 41 致 謝 . 47 作者簡歷 . 48 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 1 第一章 引 言 第一節(jié) 文獻綜述 1. 酵母雙雜交系統(tǒng) 蛋白質(zhì)是生命功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，體內(nèi)包括復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、分泌、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝等多種生命活動都依賴于蛋白 白 生命活動過程中蛋白質(zhì)作用的研究有助于揭示生命過程的許多本質(zhì)問題。但由于蛋白質(zhì)與其他生物大分子間作用依賴于細胞內(nèi)環(huán)境 ，作用時間及作用力差異極大，因而傳統(tǒng)生化方法受到較大限制。酵母雙雜交技術(shù)作為發(fā)現(xiàn)和研究在活細胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的技術(shù)平臺，在近幾年來得到了廣泛運用。酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進行的，研究活細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過報告基因的表達產(chǎn)物敏感地檢測得到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。大量的研究文獻表明，酵母雙雜交技術(shù)既可以用來研究哺乳動物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作，也可以用來研究高等植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作。因此，它在許多的研究領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用。 酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理 酵母雙雜交系統(tǒng)是在 1989 年由 提出并初步建立 ， 該系統(tǒng)是在釀酒酵母 (研究蛋白質(zhì)間相互作用的一種非常有效的分子生物學(xué)方法 (1989)。該系統(tǒng)最初是在人們對酵母轉(zhuǎn)錄因子 認識基礎(chǔ)上建立起來的。一個完整的酵母轉(zhuǎn)錄因子 分為結(jié)構(gòu)上可以分開的、功能上相互獨立的兩個結(jié)構(gòu)域：位于 N 端1氨基酸區(qū)段的 合域（ 位于 C 端 768氨基酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域（ 夠識別位于 應(yīng)基因（ 上游激活序列 (并與之結(jié)合。是通過同轉(zhuǎn)錄機 (的其它成分之間的結(jié)合作用，以啟動 (吳乃虎 等， 1998)。 獨分別作用并不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，但是當(dāng)二者在空間上較為接近時，則呈現(xiàn)完整的 錄因子活性并可激活 游啟動子，使啟動子下游報告基因（ 以轉(zhuǎn)錄 (宮明 等， 2000)。將 已知的誘餌蛋白質(zhì) X 融合，構(gòu)建出 粒載體；將 庫，基因片段或基因突變體（以 Y 表示）融合，構(gòu)建出 粒載體。兩個穿梭質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)化至酵母體內(nèi)進行表達。該酵母菌株含有特定報告基因（如 ），并且本身無報告基因的轉(zhuǎn)錄活性。蛋白質(zhì) X 和 Y 的相互作用導(dǎo)致了 空間上的接近，從而激活 游啟動 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 2 子調(diào)節(jié)的報告基因的表達，使轉(zhuǎn)化體由于 達而可在特定的缺陷培養(yǎng)基上生長。原理如圖 1時因 達而在 在下顯現(xiàn)藍色。通過篩選陽性菌落即可檢測已知蛋白間的相互作用、蛋白質(zhì)二聚體的形成、確定蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域或重要活性位點，以及從庫中篩選與已知蛋白質(zhì) x 相互作用的未知蛋白質(zhì) Y 的編碼序列等。 圖 1酵母雙雜交原理 he of 母雙雜交系統(tǒng)能在體內(nèi)測定蛋白質(zhì)的結(jié)合作用，具有高度敏感性，主要是由于：（ 1）采用高拷貝和強啟動子的表達載體使雜合蛋白過量表達。（ 2）信號測定是在自然平衡濃度條件下進行，而如免疫共沉淀等物理方法為達到此條件需進行多次洗滌，降低了信號強度。（ 3）雜交蛋白間穩(wěn)定度可被激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物而增強，后者又與啟動子 合，此三元復(fù)合體使其中各組分的結(jié)合趨 于穩(wěn)定。（ 4）通過 生多種穩(wěn)定的酶使信號放大。同時，酵母表型， 白表達等檢測方法均很敏感。 酵母雙雜交的 特點與優(yōu)點 酵母雙雜交系統(tǒng)的最主要的應(yīng)用是快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基因。酵母雙雜交系統(tǒng)檢測蛋白之間的相互作用具有以下優(yōu)點： (et (1) 作用信號是在融合基因表達后，在細胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的，省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。 (2) 檢測在活細胞內(nèi)進行，可以在一定程度上代表細胞內(nèi)的真實情況。 動 子 告基因 轉(zhuǎn)錄 Y D 動 子 告基因 Y 動 子 告基因 D 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 3 (3) 檢測的結(jié)果可以是基因 表達產(chǎn)物的積累效應(yīng)，因而可檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時的相互作用。 (4) 酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細胞類型和分化時期材料構(gòu)建 庫，能分析細胞漿、細胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白。 酵母雙雜交系統(tǒng)局限性和改進 酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白質(zhì) 很多方面的應(yīng)用，但仍存在一些局限性，人們也相應(yīng)針對它的缺點進行了一些重大改進。 (1) 雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等，這些反應(yīng)在 核內(nèi)無法進行。另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白的輔助，這限制了某些細胞外蛋白和細胞膜受體蛋白等的研究。為此人們初步建立了哺乳動物雙雜交系統(tǒng)作為酵母雙雜交系統(tǒng)的輔助手段 (， 1992)。另外還構(gòu)建了 復(fù)系統(tǒng) (， 1992) 和泛素專一性蛋白酶系統(tǒng) (， 1992) 針對膜受體、細胞外分泌蛋白等方面進行研究。 (2) 酵母雙雜交系統(tǒng)的一個重要的問題是 假陽性 。由于某些蛋白本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能（如 合酶 錄激活因子）或在酵母中表達時發(fā) 揮轉(zhuǎn)錄激活作用，使 合結(jié)構(gòu)域雜交蛋白在無特異激活結(jié)構(gòu)域的情況下可激活轉(zhuǎn)錄。另外某些蛋白表面含有對多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域，能與其他蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而引起報告基因的表達，產(chǎn)生 假陽性 的結(jié)果。為了解決這個問題， 人提出了建立在 合酶 錄基礎(chǔ)上的雙雜交系統(tǒng) (， 1997)。 人還構(gòu)建了含三種不同的報告基因（ 酵母 株 (， 1996)，這三種報告基因分別受三種不同的啟動子（ 控，而這三種不同的啟動子都由 活，該菌株可靈敏地檢測出很弱的結(jié)合作用，從而顯著地消除假陽性。 (3) 某些誘餌蛋白質(zhì)或待篩選蛋白質(zhì)在酵母中大量表達時，可能對酵母產(chǎn)生一定的毒性作用，如使酵母體內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路阻斷，干擾酵母中正?；虻谋磉_調(diào)控，抑制酵母細胞的分裂，甚至使酵母細胞在選擇性培養(yǎng)基上不能生長等，由此使得某些種類的蛋白質(zhì)不能在該系統(tǒng)中進行分析。針對這些異源蛋白質(zhì)對酵母生長的毒性作用，近年來在雙雜交系統(tǒng)中的主要改進是選用更加靈敏的報告基因從而降低這些異源蛋白在酵母中的表達量，減輕這些 異源蛋白質(zhì)在酵母中的毒性，如采用 母雙雜交系統(tǒng) (， 1996)，該系統(tǒng)中 段被原核生物的白質(zhì)編碼區(qū)所取代，單純皰疹病毒的 88 個 碼區(qū)則取代了 段。 酵母雙雜交系統(tǒng)的發(fā)展 目前發(fā)展起來的各種雙雜交系統(tǒng)大多是以 人建立的系統(tǒng)為基礎(chǔ)的。 這些新系統(tǒng)主要對 報告基因 、 誘餌 表達載體以及 獵物 表達載體等做了一些改進 (敖光明 等， 2001)。 其中一個重要改進是引入額外的 報告基因 , 如廣泛采用的 因。 經(jīng)過改造帶有 告基因的酵 母細胞 , 只有當(dāng) 啟動表達才能在缺乏組氨酸的選擇性培養(yǎng)基上生長。 告基因 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 4 的轉(zhuǎn)錄表達是由 誘餌 和 獵物 的相互作用所啟動的。 大多數(shù)雙雜交系統(tǒng)往往同時使用兩個甚至三個 報告基因 。這些改造后的基因在啟動子區(qū)有相同的轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合位點 , 因此可以被相同的轉(zhuǎn)錄激活因子 (如上述的 白 )激活。 通過這種雙重或多重選擇既提高了檢測靈敏度又減少了假陽性現(xiàn)象，如在 1993 年發(fā)展出了一種研究蛋白質(zhì)和 互作用的實驗體系酵母單雜交系統(tǒng) (， 1993) ，另外為了研究阻斷大分子間特定相互作用的 機理，在原有酵母雙雜交系統(tǒng)上發(fā)展起反向酵母雙雜交系統(tǒng) (， 1996) 和用于分析蛋白和 相互作用的酵母三雜交系統(tǒng) (， 1997) 等。下面介紹幾種常用的體系： (1) 非單一的報告基因體系：在酵母 雙雜交 系統(tǒng)建立的初期階段，由于僅僅采用 這種報告基因的表達往往不能十分嚴謹?shù)丶右钥刂?，因此容易產(chǎn)生一些假陽性。 人于 1996 年構(gòu)建了 株（ ， 1996）內(nèi)含三種不同的報告基因（ 分別受三 種不同的啟動子（ 控，而這三種不同的啟動子都由 活，該菌株可靈敏地檢測出很弱的結(jié)合作用，從而顯著地消除了假陽性。考慮到某些誘餌蛋白質(zhì) X 或待篩選蛋白質(zhì) Y 在酵母中大量表達時，可能對酵母產(chǎn)生一定的毒性作用，如使酵母體內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路阻斷，干擾酵母中正?；虻谋磉_調(diào)控，抑制酵母細胞的分裂，甚至使酵母細胞在選擇培養(yǎng)基因不能生長等，由此使得對某些種類的蛋白質(zhì)不能在該系統(tǒng)中進行分析。針對這些異源蛋白質(zhì)對酵母生長的毒性作用，近幾年來在 雙雜交 系統(tǒng)中主要的改進是選用更加靈敏的報告基因從而降 低這些異源蛋白在酵母中的表達量，減輕這些異源蛋白質(zhì)在酵母中的毒性，如采用 母 雙雜交 系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中 段被原核生物的 純皰疹病毒的 88 個 碼區(qū)則取代了 段。 圖 1單一報告體系原理示意圖 of (2) 逆雜交體系：在研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能特點、作用方式過程中 , 有時還要通過突變、加抑制劑等手段破壞蛋白質(zhì)間的相互作用。 針對實際工作中的 這種需要 , (1996)發(fā)展了所謂的逆雙雜交系統(tǒng)。 這項技術(shù)的關(guān)鍵是 報告基因 引入。 因在這里起到了反選擇的作用 , 它編碼的酶是尿嘧啶合成的關(guān)鍵酶。 該酶能把 55化成對細胞有毒的物質(zhì)。通過改造在 因的啟動子內(nèi)引入 結(jié)合位點 ， 這個改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的選擇性培養(yǎng)基上只有當(dāng) 誘餌 和 獵物 相互作用激活 因的表達才能生長。 在含有 5完全培養(yǎng)基上 誘餌 和 獵物 的相互作用則抑制細胞的生長。 然而如果目的蛋白 , 即 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 5 與 則細胞能在含有 5完全培養(yǎng)基上生長。 通過這種方法，篩選到了轉(zhuǎn)錄因子 突變物 , 這些突變物仍然能結(jié)合視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白 但是喪失了同另外一種稱為 白的結(jié)合能力。 結(jié)果得到了體外結(jié)合實驗的驗證。 通過對這些突變蛋白基因的測序 , 他們發(fā)現(xiàn)了新的 合的位點。反向雙雜交系統(tǒng)可更有效地識別蛋白間作用的關(guān)鍵位點或起決定作用的個別氨基酸， 進而分析蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。此外此系統(tǒng)還可篩選能阻 止某些蛋白間相互作用的短肽或小分子物質(zhì)用作臨床治療制劑。 人 (1996)利用這種方法鑒定出 答元件結(jié)合蛋白 (磷酸化位點的 變會阻斷其與輔助激活因子 (合識別 蛋白 )的相互作用 。 圖 1雜交系統(tǒng)示意圖 of 3) 活體系：以上介紹的酵母雙雜交系統(tǒng)都是建立在對 合 酶 激活的基礎(chǔ)上的。 這意味著雙雜交過程是在細胞核內(nèi)完成的。 然而許多待研究的蛋白質(zhì)是膜蛋白 , 它們需定位到膜上之后才能表現(xiàn)正常的生物功能，與其他蛋白質(zhì)起作用。 有些真核細胞蛋白還要經(jīng)過翻譯后的加工修飾如二硫鍵的形成、糖基化、聚異戊二烯基化等。 這些加工修飾在正常的細胞核內(nèi)不可能發(fā)生。 有些蛋白質(zhì)本身具有激活轉(zhuǎn)錄的活性 , 它們可不經(jīng)過雙雜交相互作用即能激活 報告基因 的表達。 因此根據(jù)需要有人又發(fā)展了新的雙雜交系統(tǒng)。 例如 , 人設(shè)計了一個白介導(dǎo)的雙雜交系統(tǒng) ( ,1997) 也被稱為 活系統(tǒng) (利用 活體系已成功檢測非結(jié)構(gòu)蛋白之間的相互作用 (等， 2002) (4) 三雜交系統(tǒng)： 酵母三雜交系統(tǒng)是 (1996)在酵母雙雜交基礎(chǔ)上提出來的 ,其基本原理和試驗操作與 非常相似 。 (1996) 利用 地塞米松雜合分子，將與合的糖皮質(zhì)激素受體及雜合分子作為誘餌，用于篩選與 合的 庫，分離了與 合的蛋白 蛋白質(zhì)的相互作用是某些生命活動的基礎(chǔ)，如轉(zhuǎn)錄、 剪切及 毒與宿主之間的作用等。 (1996) 提出了分析 蛋白相互作用的方法。在這個系統(tǒng)中，與 合的蛋白是一個具有 合域的蛋白 (如細菌能夠與 子的臂 具有臂 有誘餌序列 (這樣子與 結(jié)合于報告基因的上游；第 3 個分子 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 6 是 果該蛋白識別誘餌序列 結(jié)合，則報告基因轉(zhuǎn)錄。該系統(tǒng)用于確定 識別目的蛋白質(zhì)的 合域，也可以研究被已知蛋白質(zhì)識別的 列。利用這個系統(tǒng)成功地發(fā)現(xiàn)了許多 蛋白質(zhì)之間的相互作用。包括鐵離子調(diào)節(jié)蛋白與鐵反應(yīng)元件的結(jié)合 、 激活因子 應(yīng)元件 列的結(jié)合等 (F 等 ,1996)。 (2000)應(yīng)用酵母三雜交系統(tǒng)進行研究，發(fā)現(xiàn) 5前導(dǎo)序列與其 異性地結(jié)合后，可以明顯激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。突變分析表明：前導(dǎo)序列中的富含嘌呤堿基的區(qū)域和 的鋅指結(jié)構(gòu)域是特異性互作的區(qū)域； (1999)在酵母三雜交系統(tǒng)試驗中發(fā)現(xiàn) ,煙草壞死病毒衛(wèi)星 (端非編碼區(qū)的 100 個核苷酸序列可特異性地結(jié)合 明這個區(qū)域在啟動轉(zhuǎn)錄中起主要作用 。 圖 1雜交系統(tǒng)示意圖 5) 泛素專一性蛋白酶體系：針對同一個問題， (在酵母 雙雜交 系統(tǒng)中， 酵母細胞核內(nèi)發(fā)生相互作用，表達的融合蛋白需定向到核內(nèi)來激活報告基因的轉(zhuǎn)錄，這就可能限制了大量非核內(nèi)蛋白質(zhì)如膜受體蛋白 質(zhì)、細胞外分泌蛋白質(zhì)等在此系統(tǒng)中的應(yīng)用 ) 與建了泛素專一性蛋白酶系統(tǒng)（ 該系統(tǒng)的基本思想是，泛素與蛋白質(zhì)新形成的復(fù)合蛋白會被一種泛素專一性蛋白酶（ 斷，此專 一性切割只在泛素正確折疊的前提下發(fā)生。他們發(fā)現(xiàn)，泛素 時仍能正確地折疊，而當(dāng) 兩個片段將不能正確折疊。但是真正令人感興趣的是，連于 結(jié)合時，這一錯義突變帶來的折疊困難將意外地得到克服。利用這些特性，二人將 X 蛋白與泛素 C 端， Y 蛋白（未知）與泛素 N 端（含錯義突變）分別融合相連，這里作為報告蛋白的是連在泛素 C 端的帶有血凝素標(biāo)記的二氫葉酸還原酶。當(dāng) X 與 Y 特異結(jié)合時，導(dǎo)致泛素兩片段能夠正確折疊形成 正常 的泛素，使 下報告蛋白，再經(jīng)免疫印跡分析呈陽性，則可以確知 X 與 Y 發(fā)生的作用（ ， 1994）。這一系統(tǒng)可以用于解決很多問題，而且可以用于檢測蛋白相互作用中的動力學(xué)性質(zhì)。但是由于 對于表型識 別顯得繁冗。 有人對它作了改進 ,以一種融合的轉(zhuǎn)錄激活因子 為報告蛋白。 旦被從遍在蛋白 C 端片段上切下，它就會進入細胞核內(nèi)激活特定的報告基因 ,如 : 。這樣就可以根據(jù)轉(zhuǎn)化細胞是否生長及顯色來判斷待測蛋白之間有無相互作用。因此極大地簡化了操作步驟，提高了篩選效率 ( ,1998) 目前 雙雜交 系統(tǒng)主要還是建立在酵母這一體系之中，更準確地說，以酵母細胞核作為相互作 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 7 用的反應(yīng)場所，外源基因的轉(zhuǎn)錄，翻譯，蛋白產(chǎn)物的修飾，折疊及細胞內(nèi)定位等過程是在酵母細胞中完成的。但酵母畢竟還是一種 低等的真核生物，它的各種生物學(xué)功能，尤其是蛋白質(zhì)的翻譯后修飾如 N 端糖基化，二硫鍵形成等的水平還很難與高等真核生物相比擬。因此要進一步研究蛋白質(zhì)產(chǎn)物的生物學(xué)功能，還必須建立高等生物體系中的 雙雜交 系統(tǒng)。在這一方面，近幾年來，已初步建立了哺乳動物細胞 雙雜交 系統(tǒng)激活。在哺乳動物 雙雜交 系統(tǒng)中，采用單純皰疹病毒的 段 （ ， 1997），同時又引入另一個含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（ 告基因的表達載體，采用磷酸 鈣共沉淀法，轉(zhuǎn)化入胞中進行培養(yǎng) (， 1996)。該系統(tǒng)成功地驗證了小鼠 白與 T 抗原間的蛋白質(zhì)相互作用 （ ， 1994）。此后不久， 1997） 等人利用 檢測了 種蛋白質(zhì)之間的相互作用。此外，在酶母 雙雜交 系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng) (， 1997) 和表面 胞質(zhì)團共振分析技術(shù) ( (， 1993)，也可對酵母 雙雜交 系統(tǒng)的結(jié)果加以驗證，從而更加準確地探明大分子間相互作用的機理。 2. 酵母雙雜交系統(tǒng)在病毒學(xué) 中 的應(yīng)用 酵母雙雜交系統(tǒng)在病毒粒體分子結(jié)構(gòu)和裝配研究中的應(yīng)用 病毒的結(jié)構(gòu)蛋白種類很少，應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)對病毒粒體裝配中結(jié)構(gòu)蛋白的互作問題進行研究，可為電子顯微鏡重建等研究提供重要補充。 (1997,1999)應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)對水稻矮縮病毒（ 粒體裝配進行研究。結(jié)果 表明， 在內(nèi)衣殼表面形成二聚體，對核心結(jié)構(gòu)的保持起到重要作用； 粒體表面形成三聚體且可誘導(dǎo)五鄰體和六鄰體的排列。 (2000)發(fā)現(xiàn)水稻東格魯桿狀病毒（ 外殼蛋白域有很強的互作關(guān)系，表明 與了 殼的組裝。 (1996)發(fā)現(xiàn)花椰菜花葉病毒（ 內(nèi)含體蛋白（ 特異性地與病毒外殼前體蛋白（ 接，由于 成熟病毒粒體中不存在，故推測 粒體裝配中只起附屬作用。 酵母雙雜交 系統(tǒng)在病毒核酸復(fù)制及基因表達調(diào)控研究中的應(yīng)用 病毒核酸復(fù)制是病毒生 命 周期