【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）PF40基因與DREB轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)化小麥的研究作物遺傳育種碩士論文

密級 ： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 因與 錄因子轉(zhuǎn)化小麥的研究 .) .) I 摘 要 本研究利用分子生物學(xué)試驗手段，構(gòu)建了 粒載體，利用農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化法和基因槍轉(zhuǎn)化法分別將 其 導(dǎo)入小麥 （ .） 基因組中。 因是從谷子未成熟種子 探討該基因?qū)π←湹挠绊?，以分蘗特性差異明顯的 個冬小麥品種為受體材料，用帶有 因和 因的質(zhì)粒轟擊小麥幼胚愈傷組織。經(jīng)含有 5 培養(yǎng)基上四次抗性篩選后移栽溫室，共獲得 613 株再生植株，經(jīng) 測共獲得 43 株陽性植株， 性轉(zhuǎn)化率為 將 26 個轉(zhuǎn)基因植株的種子種成 轉(zhuǎn)基因后代中隨機選取 19 株進行的 析，初步斷定 性率為 經(jīng)過 測和 交分析，證明 統(tǒng)計學(xué)中 6個株系的 基因后代中有 12 株符合孟德爾 3： 1 的遺傳分離比（ 結(jié)果表明因在后代中得到較穩(wěn)定遺傳，并以顯性方式遺傳給后代。同時對 轉(zhuǎn)基因植株進行分蘗和成穗數(shù)的調(diào)查結(jié)果顯示 ， 義、 義、 干擾載體與對照均有顯著性差異，只有擾載體與對照的差異 不顯著，以上結(jié)果 表明 因?qū)π←湹姆痔Y 具有 一定的 調(diào)空作用 。 以冬小麥品種輪選 987 幼苗的莖尖分生組織為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將與抗逆相關(guān)的逆境誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子 因的質(zhì)粒 入小麥基因組中，與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后共獲得 110 棵轉(zhuǎn)化幼苗。經(jīng) 增鑒定，其中 10 棵幼苗證明含有 因，轉(zhuǎn)化率達到 轉(zhuǎn)基因已經(jīng)穩(wěn)定遺傳給后代，并且所得株系基本符合孟德爾分離比 3:1。 本研究表明將 因?qū)胄←湆π←湹姆痔Y數(shù)和成穗數(shù)存在一定的 調(diào)節(jié)作用。同時，利用優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化體系，較好地克服了小麥轉(zhuǎn)化受體的基因型障礙，提高了小麥的基因轉(zhuǎn)化效率。 關(guān)鍵詞 : 小麥， 錄因子， 基因槍轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌介導(dǎo)，幼胚，莖尖分生組織 he 5S bi to of to to of To 000 of 99by 13 on S in 3 of 6 6 of 9 9 of 2 s 6 be 18 9918 a in to of of 10 10 of be 1 s :1 in It or in on of of be a to no 錄 第一章 緒論 1 究目的和意義 1 內(nèi)外研究進展 2 麥轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究進展 2 物分蘗基因工程研究進展 7 究內(nèi)容和方法 15 第二章 小麥基因槍法轉(zhuǎn)化 因 16 料與方法 16 16 17 果與分析 23 粒載體的檢測與鑒定 23 草劑抗性篩選 25 0 代轉(zhuǎn) 因再生植株的 測 27 1 代轉(zhuǎn) 因植株的 測 28 1 代轉(zhuǎn) 因植株的遺傳分析 29 化 因小麥 植株分蘗特性鑒定 29 第三章 小麥農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化 因 34 料與方法 34 34 35 果與分析 37 粒載體的檢測與鑒定 37 選與檢測 38 第四章 討論 41 麥基因槍轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化效率 41 因與小麥分蘗特性 41 桿菌侵染小麥莖尖分生組織的轉(zhuǎn)化 42 一步研究工作設(shè)想 43 第五章 結(jié)論 44 參考文獻 45 致謝 53 作者簡歷 54 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 究目的和意義 小麥是全世界分布范圍最廣、栽培面積最大、總產(chǎn)量最高、總貿(mào)易額最多的糧食作物，在世界經(jīng)濟中占有舉足輕重的作用。我國小麥最大播種面積在 4 億畝左右，約占全國糧食播種面積的26%，為僅次于水稻的第二大主要糧食作物。伴隨著我國可利用耕地面積的逐年減少，淡水資源的短缺和匱乏，人口的逐漸增多，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗等優(yōu)良性狀綜合表達的 小麥品種具有非常重要的社會、經(jīng)濟和生態(tài)效益。 雜交育種技術(shù)仍然是目前作物新品種培育的主要方法。近 20年來，隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)，外重組技術(shù)，基因克隆技術(shù)及遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展，植物基因工程育種己成為作物育種的新途徑。從上世紀 90 年代開始，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在作物遺傳改良上的應(yīng)用一直是廣大科學(xué)工作者關(guān)注的熱點。截止目前獲得的小麥轉(zhuǎn)基因植株的報道中，基因槍法約占其中的 90 左右，其它方法僅占 10%（葉興國等， 2001）。與基因槍轉(zhuǎn)化相比農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是一種生物轉(zhuǎn)化，具有一定的主動性，且具有基因拷貝數(shù)低、發(fā)生轉(zhuǎn)基因沉 默相對較少、轉(zhuǎn)移的基因片段較長、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點（徐春暉等， 2002）。利用作物幼苗莖尖分生組織作為轉(zhuǎn)化受體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，在作物的遺傳轉(zhuǎn)化過程中可以有效的解決離體培養(yǎng)的基因型依賴問題。莖尖分生組織在農(nóng)桿菌侵染后很容易再生出植株，不需要經(jīng)過器官、組織和細胞組織培養(yǎng)過程，有效的克服了組織培養(yǎng)過程中基因型障礙造成的難以獲得再生植株的缺點，擴大了小麥轉(zhuǎn)化的基因型范圍（ 梁欣欣等， 2007）。此方法具有周期更短、取材不受季節(jié)限制、無需嚴格的組織培養(yǎng)滅菌操作系統(tǒng)、有效的避開了繁雜的組織培養(yǎng)過程等優(yōu)點，有望克服基因型對植物再 生和轉(zhuǎn)化的限制，對禾本科作物改良具有重要的價值。 小麥等禾本科植物植株發(fā)育的一個重要特征就是產(chǎn)生分蘗的能力。分蘗是影響水稻與小麥等主要農(nóng)作物穗數(shù)多少并進而影響單產(chǎn)的重要農(nóng)藝性狀之一，是單子葉植物在生長發(fā)育過程中形成的一種特殊的分枝特性。一般認為，分蘗數(shù)目是多基因控制的數(shù)量性狀，且很容易受到環(huán)境條件的影響。目前，已經(jīng)分離出一些分蘗數(shù)目發(fā)生改變的植物的突變體，但對這些突變體的研究以及對控制分蘗的分子機理的探究還不夠完善。 因是從谷子花序的 庫中篩選得到的一個與植物分蘗發(fā)育相關(guān)基因。將其在 數(shù)據(jù)庫的查詢比較表明該基因是不同與以往發(fā)現(xiàn)的與側(cè)芽側(cè)枝發(fā)育有關(guān)的基因，該基因或同源基因普遍存在于禾本科植物中。通過 因轉(zhuǎn)化煙草和谷子的研究發(fā)現(xiàn)，該基因在一定程度上可以改變植物的分蘗數(shù)目。 與植物的抗蟲、抗病等其它性狀比較，植物的耐鹽性、抗旱性等抗逆性狀要復(fù)雜得多。 為了適應(yīng)環(huán)境，在長期的進化中，植物逐漸建立起相應(yīng)的抗性機制，如干旱、鹽漬、低溫等外界環(huán)境引起的脫水脅迫（ 植物體內(nèi)產(chǎn)生一系列生理生化變化，誘導(dǎo)了許多脅迫耐性相關(guān)基因的表達，從而使植物抵御不良環(huán)境對自身的傷害 （劉強等， 2000）。 植物對干旱、高鹽及低溫耐性的強弱往往不取決于某一單個因子，其性狀受到許多因子的影響。利用單一基因，如脯氮酸合成酶基因或甜菜堿合成酶基因進行轉(zhuǎn)化，雖能在一定程度上改善植物的耐鹽性或耐早性，但不能使植物的抗逆性得到較為理想的綜合改良。因此，從改良或增強一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控著手，是使植物抗逆性得到綜合改良的有效的途徑和方法。 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 就是這樣一種轉(zhuǎn)錄因子，它可以調(diào)控多個與植物干早、高鹽及低溫耐性有關(guān)的功能基因的表達。因此，利用轉(zhuǎn)錄因子 期能獲得較好的改良效果。 內(nèi)外研究進展 麥轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究進展 從上世紀 90 年代開始，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在作物遺傳改良上的應(yīng)用一直是廣大科學(xué)工作者關(guān)注的熱點。 1992 年 通過基因槍將 因?qū)胄←溒贩N “ 中，宣告世界上第一株轉(zhuǎn)基因小麥問世以來（ ， 1992），基因槍法一直占據(jù)著小麥轉(zhuǎn)基因手段的重要位置，其次還有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉管通道法等技術(shù)。 麥遺傳轉(zhuǎn)化的方法 小麥遺 傳轉(zhuǎn)化的方法很多，有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、 化法、硅碳纖維介導(dǎo)法、花粉管通道法、電擊法和顯微注射法等。對禾谷類作物來說，基因槍法是一種有效的轉(zhuǎn)化途徑。迄今為止，大多數(shù)轉(zhuǎn)化的禾谷作物都是采用基因槍法得到的 (表 1)。 表 1 常用小麥基因轉(zhuǎn)化方法特點比較 of 價條件 基因槍法 花粉管法 農(nóng)桿菌法 其它方法 受體范圍 完整細胞 卵細胞 完整細胞 原生質(zhì)體 宿主范圍 無 無 有 無 組培條件 簡單 簡單 簡單 復(fù)雜 嵌合比例 多 無 有 無 轉(zhuǎn)化率 100001 10000作難度 難 簡單 較簡單 極難 設(shè)備要求 昂貴 最便宜 便宜 昂貴 轉(zhuǎn)化工作效率 高 較低 低 低 應(yīng)用多少 最多 較多 較多 少 穩(wěn)定性 差 較差 好 差 （歐巧明等， 2005） 因槍轉(zhuǎn)化法 基因槍法（ 稱粒子轟擊法（ 、生物發(fā)射技術(shù)（ 或高速微粒子發(fā)射技術(shù)（ ，它是將核酸分子附著于高速運動的金屬微粒表面，從而引入到受體細胞中的一種遺傳物質(zhì)導(dǎo)入技術(shù)。 1987年美國康奈爾大學(xué)的 人首先發(fā)明了火藥式基因槍，隨后該實驗室的 1987）使用該基因槍將攜帶有細菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 （ 基因的煙草花葉病毒的 入洋蔥的表皮細胞，使 因得到表達。基因槍法本質(zhì)上是一種物理過程，沒有宿主的限制，對雙子葉和單子葉植物都 能進行有效地轉(zhuǎn)化。目前，用于基因槍轉(zhuǎn)化的受體材料十分廣泛，其中包括原生質(zhì)體、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 懸浮細胞、根或莖的切段、葉園片、成熟胚、幼胚、幼穗、分生組織、愈傷組織、胚芽鞘、花粉粒等幾乎所有具有潛在分化能力的組織或細胞。基因槍轉(zhuǎn)化法大大推動了小麥遺傳轉(zhuǎn)化的研究，促進了小麥基因工程的發(fā)展。但基因槍的轟擊參數(shù)以及受體生理因素嚴重的影響了基因槍的轉(zhuǎn)化效率；同時，該方法轉(zhuǎn)化易出現(xiàn)嵌合體，多拷貝整合，共抑制和基因沉默現(xiàn)象，轉(zhuǎn)化成本很高，限制了基因槍法的普遍應(yīng)用。 桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌 粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法（ 一種天然有效的遺傳工程系統(tǒng)。在農(nóng)桿菌浸染植物時，其 粒 (包括 粒 )上一段轉(zhuǎn)移 ） 插入到植物基因組中，使其攜帶的目的基因在植物中得以表達。與 桿菌轉(zhuǎn)化的外源 貝數(shù)低、片斷較大 (可達 50整合后的外源基因結(jié)構(gòu)變異較小、轉(zhuǎn)化效率高，同時農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方式其轉(zhuǎn)化和篩選具有明顯的簡易性，恰當?shù)姆稚M織是其優(yōu)良的轉(zhuǎn)化材料。1983 年首次利用根癌農(nóng)桿菌獲得了轉(zhuǎn)基因煙草，農(nóng)桿菌法很快就成為雙子葉植物基因轉(zhuǎn) 導(dǎo)的主要方法。盡管單子葉植物尤其是禾本科植物曾被認為不在農(nóng)桿菌宿主之內(nèi)， 1999） 、葉興國（ 2001）等也分別報道了利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因小麥植株，并且經(jīng)分子檢測和遺傳分析證明外源基因能夠穩(wěn)定表達和遺傳。但是，目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小麥成功的報道較基因槍而言還太少，轉(zhuǎn)化的效率不高。 粉管通道轉(zhuǎn)化法 花粉管通道法（ 80 年代初期，由我國學(xué)者周光宇根據(jù)植物遠緣雜交理論提出的，是在授粉后向子房注射含目的基因的 液，利用植物開花、受精過程形 成的花粉管通道，將外源 入受精的卵細胞，并進一步被整合到受體細胞的基因組中，隨受精卵的發(fā)育而成為轉(zhuǎn)基因新個體?；ǚ酃芡ǖ婪ū苊饬藦?fù)雜的組織培養(yǎng)與植株再生過程，可直接在轉(zhuǎn)化當代獲得種子，并且不受植物種類限制，成本較低，不需要昂貴的儀器設(shè)備。成卓敏等 （ 1993）獲得大麥黃矮病毒 因轉(zhuǎn)化的小麥；郭寶太等 （ 1996） 將 因通過該方法導(dǎo)入到小麥栽培品種，經(jīng)過 測證明該外源基因已經(jīng)成功導(dǎo)入。但花粉管通道法也有其自身的局限性，如 提取方法、 射液的配制、花期的選擇、操作方法等都 將影響最終效果，易受環(huán)境條件影響，重復(fù)性差、經(jīng)驗性強、轉(zhuǎn)基因植株后代情況復(fù)雜、轉(zhuǎn)化效率低 (一般在 1%以下 )。 它轉(zhuǎn)化法 應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因小麥研究的遺傳轉(zhuǎn)化方法還有電激法、 導(dǎo)法、脂質(zhì)體、離子束介導(dǎo)法等直接的基因?qū)敕椒?，它們有一個共同的特點就是：利用高能量或物理化學(xué)的間接處理原生質(zhì)體或愈傷組織細胞，使其產(chǎn)生瞬間的小孔或細胞融合，從而使外源 入受體中。研究表明，雖然這些方法操作簡單，但轉(zhuǎn)化效率普遍較低，幾乎很難獲得轉(zhuǎn)基因再生植株。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 4 麥遺傳轉(zhuǎn)化的受體 幼胚為受體的轉(zhuǎn)化 小麥遺傳轉(zhuǎn)化的受體類型取決于所用轉(zhuǎn)基因的方法。選用適宜的小麥基因型并且采用分裂旺盛，狀態(tài)良好的外植體作為轉(zhuǎn)化材料是提高轉(zhuǎn)化頻率的關(guān)鍵，目前幼胚是小麥轉(zhuǎn)化最為理想的受體。 (1992， 1993)首先報道用基因槍法轉(zhuǎn)化春小麥品種 幼胚，成功獲得了穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)基因小麥植株，隨后以小麥幼胚為受體的轉(zhuǎn)基因植株逐漸增多（ ， 1993； 1996；張曉東等， 1997）。 利用農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化小麥的實驗中，多以小麥的幼胚以及胚性愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體。 （ 2003） 以預(yù)培養(yǎng) 4d 的小麥幼胚為外植體，用農(nóng)桿菌 染轉(zhuǎn)化，以草甘磷為篩選劑，獲得了 轉(zhuǎn)化率。 （ 1997）將帶有 因的 株轉(zhuǎn)化春小麥未成熟胚、預(yù)培養(yǎng)的未成熟胚以及胚性愈傷組織 3 種外植體都獲得了轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng) 測分析， 35%的轉(zhuǎn)基因植株是單拷貝的，且 基因分離中多數(shù)符合孟德爾遺傳規(guī)律。 幼穗為受體的轉(zhuǎn)化 近幾年來，由于小麥遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的不斷發(fā)展，人們也在不斷的尋找更有效的轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)。小麥幼穗由 于取材方便、周期較短、容易滅菌等特點成為離體培養(yǎng)外植體一個很好的選擇（ 伍碧華等， 1996） 。 以幼穗為受體獲得了外源基因的瞬時表達或穩(wěn)定表達，并發(fā)現(xiàn)幼穗的轉(zhuǎn)化效果優(yōu)于幼胚的轉(zhuǎn)化效果（陳梁鴻， 1997）。 劉錄祥等（ 2001） 選擇適期幼穗作為外植體，圍繞保證愈傷組織發(fā)生過程中形態(tài)建成的完整和正常，輔以調(diào)整培養(yǎng)基的成份和適當延長脫分化過程，在分化潛力高峰期轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)取得初步成功，初步建立起克服基因型障礙的小麥遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)。王艷麗等（ 2005）分別以不同小麥基因型的幼胚和幼穗為外植體，以植物中常用的 告基 因的瞬時表達為指標，對農(nóng)桿菌敏感的小麥基因型進行較大規(guī)模的篩選，結(jié)果表明 83 個小麥基因型的幼穗經(jīng)農(nóng)桿菌感染后 ， 因表達率 幼 胚經(jīng)農(nóng)桿菌感染后表達率在 上的基因型僅占 沒有表達的基因型多達 花藥為受體的轉(zhuǎn)化 小麥花藥的愈傷組織的再生能力很強，經(jīng)基因槍轟擊后比較容易得到轉(zhuǎn)基因植株，因而也是小麥轉(zhuǎn)基因的良好受體。以花藥為受體最大的好處在于轉(zhuǎn)基因后代經(jīng)加倍即純合，但其成功也依賴于花藥培養(yǎng)體系，受小麥品種的基因型影響較大。黃益洪等（ 2002）利用小麥的幼穗、花藥以及幼胚分別作為受體材料，利用不同種類的農(nóng)桿菌菌株侵染小麥不同基因型和同一基因型的不同外植體，研究了農(nóng)桿菌菌系、小麥基因型和外植體對轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明在采用高致毒力菌株、高敏感受體和高再生頻率材料的“三高原則”下，幼穗及幼胚的效果比較理想。 株的整體轉(zhuǎn)化 植物整體轉(zhuǎn)化方法就是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因直接導(dǎo)入到活體植株中，特別是植物的花器官中，使外源基因有機會進入到卵細胞或受精卵中，轉(zhuǎn)化操作后，植物可以在土壤或營養(yǎng)液中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 5 中繼續(xù)發(fā)育，直到形成轉(zhuǎn)基因種子（ ， 2000） ，有效的避免了由單一的轉(zhuǎn)化細胞進行組織培養(yǎng)獲得再生植株的過程。 （ 2002）以完整的小麥植株為材料進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，但未得到轉(zhuǎn)基因植株。何道一等（ 2003）將含有 因表達載體的農(nóng)桿菌滴入小麥小花中進行小麥活體轉(zhuǎn)化，通過 交進行分子水平鑒定，最終獲得轉(zhuǎn)化植株效率為 莖尖分生組織為受體的轉(zhuǎn)化 利用作物幼苗莖尖分生組織作為轉(zhuǎn)化受體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，在作物的遺傳轉(zhuǎn)化過程中可以有效的解決離體培養(yǎng)的基因型依賴問題。莖尖分生 組織在農(nóng)桿菌侵染后很容易再生出植株，不需要經(jīng)過器官、組織和細胞組織培養(yǎng)過程，有效的克服了組織培養(yǎng)過程中基因型障礙造成的難以獲得再生植株的缺點，擴大了小麥轉(zhuǎn)化的基因型范圍（梁欣欣等， 2007）。梁欣欣以小麥幼苗的莖尖分生組織為轉(zhuǎn)化受體，將含有擬南芥逆境誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子 除草劑 因的表達載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入小麥 種中，獲得了耐鹽性增強的轉(zhuǎn)基因小麥，經(jīng) 王宏芝等（ 2004）以不同發(fā)育時期的小麥為材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)結(jié)合基因槍轟擊，將外源基因?qū)氲叫←溕?生長時期的生長點中，獲得了 告基因的瞬時表達。 將種子萌芽，剝?nèi)ヅ哐壳?，用細針刺傷暴露的生長點，再用農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化，經(jīng)時表達和 測后，得到了轉(zhuǎn)基因植株和后代種子 。 （ 2006）以小麥受損的莖尖分生組織為受體，利用農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化的方法，從 的轉(zhuǎn)化到 子檢測進行完整的實驗操作，得到了 性轉(zhuǎn)化率。 麥遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)存在的主要問題 傳轉(zhuǎn)化頻率低 目前廣泛應(yīng)用受體可以是胚性懸浮 細胞、幼胚、成熟胚、幼穗愈傷組織，也可以是花藥、盾片等，轉(zhuǎn)化的方法相對也比較成熟，但是由于受到基因型的限制、取材的季節(jié)性、組織培養(yǎng)的手段的制約以及轉(zhuǎn)化效率不高等諸多問題，尋找合適的受體材料及組織培養(yǎng)方法成為提高基因槍轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵，小麥轉(zhuǎn)化體系的尚未完善仍是制約小麥基因工程的主要障礙。只有少數(shù)基因型材料能通過組織培養(yǎng)可以再生出大批植株，絕大多數(shù)具有重要經(jīng)濟價值的基因型仍難以利用。小麥組織培養(yǎng)中植株再生頻率低和基因型依賴性強等問題在一定程度上阻礙了轉(zhuǎn)基因小麥的規(guī)?；l(fā)展，使轉(zhuǎn)基因小麥研究僅僅集中在少數(shù)基因型， 而這些基因型往往又并非生產(chǎn)所需要的。另外，基因轉(zhuǎn)化的受體單一、受體的轉(zhuǎn)化頻率低等，也嚴重阻礙了小麥基因工程的發(fā)展。因此，選擇合適的外植體作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體，建立不受基因型限制的轉(zhuǎn)化體系是目前小麥遺傳轉(zhuǎn)化研究的重點。 乏合適的篩選標記基因 對于轉(zhuǎn)基因植物的篩選是植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)中極為重要的一個環(huán)節(jié)。現(xiàn)有的植物轉(zhuǎn)化體系主要采用抗生素、藥物或除草劑抗性來篩選轉(zhuǎn)基因植株。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 6 表 2 轉(zhuǎn)基因植物常用篩選標記基因 he of 選擇標記基因 引用文章 編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因） ， 1993 碼潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因） ， 1994 碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因） ， 1991 碼二氫葉酸還原酶基因） ， 1998 因（編碼 酰轉(zhuǎn)移酶基因） ， 1993 編碼 等， 1992 因（編碼 53 陳梁鴻等 ， 1999 近年來，轉(zhuǎn)基因小麥的安全性問題受到人們的廣泛關(guān)注，一旦轉(zhuǎn)基因植物被獲得，選擇標記基因就失去作用，但是它們在后代中仍然表達。由于這些選擇標記基因（ 大多來自于微生物，所以其安全性問題引起人們關(guān)注。目前，對選擇標記基因的憂慮有四種 :(1)其表達產(chǎn)物會對植物細胞的分生和增殖有副面影響； (2)會對環(huán)境產(chǎn)生影響，具有抗生素，或除草劑抗性的標記基因的應(yīng)用，會不會破壞生態(tài)平衡（汪琛穎， 2004）； (3)利用同樣的選擇標記基因很難再對其它基因進行轉(zhuǎn)化 (4)標記基因傳播到野生親緣種中，使雜草獲得這種抗性，變成現(xiàn)有除草劑無法殺滅的超級雜草。一種全新的發(fā)展策略即獲取無選擇標記的轉(zhuǎn)基因植物逐漸發(fā)展起來。無選擇標記的轉(zhuǎn)基因植物具有許多獨特的優(yōu)勢，如消除大眾對轉(zhuǎn)基因植物中含有選擇標記基因而引起的恐慌及可以反復(fù)向己轉(zhuǎn)化的植物中加外源基因等，因此這種新方法（無標記）有著巨大的應(yīng)用潛力（ et 2002） 。目前對無選擇標記的轉(zhuǎn)基因植物的研究已經(jīng)有許多報道（ . et 1998； et 2000； et 2000），主要有位點特異性重組法，轉(zhuǎn)座子法，染色體內(nèi)重組法（ 共轉(zhuǎn)化法等，并且已經(jīng)獲得了無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因植物（ s）。 基因沉默和外源基因的不確定性表達 轉(zhuǎn)基因沉默（ 象是指利用遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入并穩(wěn)定整合進受體細胞核基因組中的完整的外源基因在當代轉(zhuǎn)化體或在其后代中表達活性受到抑制的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)基因沉默的機理較復(fù)雜，原因較多，況且小麥為六倍體植物，基因組大而復(fù)雜， 轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象更容易發(fā)生。目前的轉(zhuǎn)基因植物往往以多拷貝、多位點、隨機整合到植物基因組中，轉(zhuǎn)基因的表達活性和轉(zhuǎn)基因植物的表現(xiàn)型很難預(yù)測。轉(zhuǎn)基因在遺傳傳遞過程中雖有可能按孟德爾遺傳規(guī)律進行傳遞，但傳遞過程中轉(zhuǎn)基因很可能發(fā)生基因丟失而失去其應(yīng)用價值。此外，由于外源基因在受體植物中隨機整合，會破壞受體植物在長期進化過程中所形成的協(xié)調(diào)體系，引起某些功能損傷，突變或不育等。另外，由于外源基因共抑制、甲基化或異染色質(zhì)化造成的基因沉默現(xiàn)象也會造成轉(zhuǎn)基因植株無法獲得（崔欣等， 2002）。 潛在實用價值目 標基因缺乏 從基因槍轉(zhuǎn)化法獲得第一例轉(zhuǎn)基因小麥植株到現(xiàn)在，已經(jīng)有多種目的基因被導(dǎo)入其中，涉及到抗除草劑、抗病毒、抗真菌、抗蟲、改善品質(zhì)、抗逆、雄性不育等性狀等等。經(jīng)十多年的研究，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 7 小麥遺傳轉(zhuǎn)化取得了很大進展，但大多數(shù)工作還僅僅局限于轉(zhuǎn)基因基礎(chǔ)研究階段，真正有利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要目的基因轉(zhuǎn)化研究報道很少。因此，今后小麥轉(zhuǎn)基因研究工作，除建立高效遺傳轉(zhuǎn)化體系外，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)商有利用價值的重要基因的分離也是分子改良最大的限制因素之一，所以鑒別、分離、克隆有益、重要基因也非常關(guān)鍵。 物分蘗基因工程研究進展 小麥等禾本科植物植株發(fā)育的一個重要特征就是產(chǎn)生分蘗的能力。分蘗是影響水稻與小麥等主要農(nóng)作物穗數(shù)多少并進而影響單產(chǎn)的重要農(nóng)藝性狀之一，是單子葉植物在生長發(fā)育過程中形成的一種特殊的分枝特性。這種特征使得小麥植株能夠?qū)ΣシN密度的變化作出反應(yīng)?；蛐?、營養(yǎng)水平、水分供應(yīng)的不同以及植物生長激素都會造成分蘗群量的相似反應(yīng)。分蘗與雙子葉植物分枝的本質(zhì)區(qū)別在于：分蘗生于莖稈基部的不伸長節(jié)間，并且生有不定根，可以與主莖分離而單獨存活，而分枝一般發(fā)生在莖稈上部的伸長節(jié)間，沒有不定根，不能單獨存活。在小麥等禾本科植株中，單株穗數(shù) 是重要的產(chǎn)量構(gòu)成因素之一，所以分蘗形成的時間、分蘗的數(shù)量以及大小對最終子粒產(chǎn)量有著至關(guān)重要的作用。 物分蘗的生長與發(fā)育 植物分蘗的形成過程可分為兩個主要步驟，即分蘗芽的形成和分蘗芽的伸長。通常種子發(fā)芽之后，隨著子葉的形成，葉腋的內(nèi)部就開始分化蘗芽。在每個葉子的葉腋里都能形成一個腋芽，即分蘗芽，最初的蘗芽是葉腋部的一個棱狀組織，隨著蘗芽分生組織的生長，在其內(nèi)部開始分化。一般只有位于莖稈基部不伸長節(jié)間上的分蘗芽才能夠伸長生長為分蘗，而莖桿上部伸長節(jié)間上的腋芽一般不伸長而處于休眠狀態(tài)。田間條件下， 分蘗發(fā)生一般在主莖的二棱期時候停止，這一階段穗和莖均進入了快速生長時期。稍后，部分分蘗開始衰亡，首先死亡的是晚生小分蘗，然后一些大分蘗也可能死亡，通常在頂端小穗時期時已經(jīng)形成的三片以上葉的分蘗不會死亡。 在主莖 （ 葉腋內(nèi)形成的分蘗稱為一級分蘗，第一葉腋內(nèi)形成的分蘗稱為第一分蘗 （ 胚芽鞘內(nèi)產(chǎn)生的分蘗稱為胚芽鞘蘗 （ ，每個一級分蘗上都有產(chǎn)生二級分蘗的潛在能力 （ 依次類推。在正常（野生型）禾本科植物中，以一級與二級分蘗為主，更高級的分蘗則很少形成。一般小麥生長至 3 個葉片時進入分蘗期（圖 1）。 由于小麥的大部分營養(yǎng)器官，如葉片、分蘗和根系都是在這個時期形成的，因此，分蘗期是小麥生長發(fā)育過程中的重要時期。穗數(shù)是禾本科產(chǎn)量的決定因素，而單株分蘗數(shù)又是決定穗數(shù)的重要因素，過低或過高的分蘗數(shù)都會影響單位面積產(chǎn)量。 圖 1 分蘗的命名 of 子 胚芽鞘 1 2 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 8 一般認為，分蘗數(shù)目是受多基因控制的數(shù)量性狀，且很容易受到環(huán)境條件的影響。目前，已經(jīng)分離出一些分蘗數(shù)目發(fā)生改變的植物的突變體， 但對這些突變體的研究以及對控制分蘗的分子機理的探究還不夠完善。擬南芥全基因組測序的成功，基因組學(xué)與蛋白組學(xué)技術(shù)的逐漸成熟及在幾種模式植物中克隆到許多與分枝有關(guān)的基因及獲得的相應(yīng)的突變體，為研究分枝產(chǎn)生的機制提供了強有力的理論基礎(chǔ)，近幾年在研究影響分枝的因素方面有了很大的突破與進展（見表 3）。其中基因家族是指：結(jié)構(gòu)相近執(zhí)行相似功能的一系列相似基因，對基因家族的研究會給未知的基因的研究提供一條有用的信息。 表 3 調(diào)控分枝有關(guān)的基因家族 因家族 代表基因 因家族 因（水稻）， 茄）基因 錄調(diào)控因子 稻） 因家族 因（番茄） 細胞色素 族 因， 因 ， 因 因家族 因（擬南芥，蕃茄） 因家族 南芥、水稻，豌豆） 因家族 南芥） 1） 因家族 族包括小的 族，此家族編碼的蛋白具 有 點，是定位在細胞核中，基因的作用是促進芽原基的起始。目前發(fā)現(xiàn)屬于 族的與調(diào)控側(cè)芽及側(cè)枝有關(guān)的基因主要有水稻中的 番茄中的 因。 基因（ i et 2003），是水稻中發(fā)現(xiàn)的控制水稻分蘗的一個基因。 位在細胞核，它作為轉(zhuǎn)錄因子通過影響下游的兩個基因 而調(diào)控水稻分蘗，在營養(yǎng)生長和生殖生長這兩個發(fā)育時期都影響分枝。 變體只有一個主枝，沒有分蘗，在側(cè)芽原基中發(fā)揮作用，可促進側(cè)芽約生長，同時基因可 以使植株的株高降低。 et 2000）是番茄分枝的關(guān)鍵調(diào)控者，參與營養(yǎng)生長時期分生組織的形成。 枝減少，花瓣發(fā)育受阻并且花序減少，在長日照的條件下，缺少第二輪的花器官，育性下降 （ ., 1999）。 2） 屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（ 植物中的 2 個亞家族，在擬南芥中有 133 個 因，至少有 113 個是可以表達的。水稻的 基因，是水稻中主